Identificação baseada em Microarray de Individual HERV Loci Expressão: Aplicação a descoberta de biomarcadores em câncer de próstata

Esta análise transcriptômica de tecidos de câncer de próstata humano identifica loci de expressão de retrovírus endógenos humanos individuais para avaliar um microarray personalizado de alta densidade como uma ferramenta de triagem para a descoberta de biomarcadores. Depois que o cirurgião remove o órgão da próstata do paciente, o patologista prepara os tecidos tumorais e normais adjacentes separadamente no extrato de laboratório, purifica e qualifica a RM. NA dos tecidos normais e tumorais amplificam mRNAs usando o kit de ovação de transcriptoma completo e, em seguida, clivam e rotulam os produtos amplificados resultantes. Em seguida, processe sequencialmente o H-E-R-V-V dois microarrays enchendo a hibridização, lavagem e digitalização.

Em última análise, usando métodos de biocomputação, conjuntos de sondas, exibindo sinal significativo e expressão diferencial podem ser rastreados, levando à identificação de loci individuais transcricionalmente ativos. Muitos anos atrás, exploramos o comportamento da família IRV W em vários contextos, incluindo amostras de esclerose múltipla. Placenta testicular.

Tive a ideia de seu método pela primeira vez quando começamos a entender que subgrupos sobrepostos ou não sobrepostos de elementos IRV dentro de uma família eram expressos. Dependendo do contexto. O uso da tecnologia do navio permite a exploração coordenada de várias suas famílias e a análise simultânea de diferentes regiões para cada locus.

Por exemplo, US três e domínio UF para LTR, que podem apoiar um papel direto na patologia. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do câncer, como para o diagnóstico de câncer de próstata, onde os biomarcadores de proteínas existentes, como o PSA, carecem de especificidade e sensibilidade. Enquanto isso, o RNA não codificante como o PCA três parece mais promissor, demonstrando o procedimento de manuseio da próstata estará vendendo a michel um técnico do departamento de patologia.

Philippe per demonstrará a preparação e análise do alvo de extração de RNA, enquanto um técnico do laboratório da Unidade John demonstrará o procedimento do navio. Monte o tecido congelado verticalmente sobre um pequeno monte de OCT no criostato. Pegue uma única seção de cinco mícrons, core-a com Blu udina e, em seguida, faça um exame histológico rápido para examinar a natureza do tecido para o tecido tumoral.

Estime a quantidade de células turais e selecione apenas núcleos com mais de 80% de células tumorais. Corte outra seção de cinco mícrons e core com hematina, eoína e açafrão. Agora corte 15 seções de 30 mícrons de espessura e transfira-as para um tubo de eend orph livre de RNAs.

Em seguida, faça uma última seção de cinco mícrons para coloração com hematina, eoína e açafrão para controlar a quantidade de células tumorais. Ao final do procedimento, trans transfere as amostras em gelo seco para o laboratório de biologia molecular. Homogeneizar o tecido em solução de Triol no gelo, usando um moedor de mão até que o tecido esteja completamente dissolvido.

Incubar as amostras à temperatura ambiente durante cinco minutos. Em seguida, adicione 300 microlitros de clorofórmio e vórtice por 15 segundos. Após dois minutos à temperatura ambiente, centrifugar a 12 000 G durante 15 minutos a dois a oito graus Celsius.

Para o RNA, transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para um novo tubo. Adicione 750 microlitros de isopropanol, misture por inversão e incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Centrifugue as amostras para granular o RNA precipitado, lave o pellet de RNA com um mililitro de etanol a 80%.

Em seguida, centrifugue as amostras a 7.500 g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Remover o sobrenadante com as pontas P 1000 e P 10. Deixe o etanol restante secar ao ar.

Em seguida, adicione 100 microlitros de água livre de RNAs. Transfira as amostras para um bloco de calor de 70 graus Celsius. Para dissolver o pellet, verifique a qualidade do RNA e a integridade do RNA usando um bioanalisador e um NanoDrop de acordo com as instruções do fabricante.

Em uma extração de RNA ideal, o número de integridade do RNA é tipicamente sete ou maior. Continue com toda a ovação do transcriptoma, kit de amplificação de RNA seguindo as instruções do fornecedor. Em seguida, purifique o produto CD NA de fita simples resultante.

Verifique o rendimento e a distribuição de tamanho do CDNA de fita simples usando um bioanalisador e um NanoDrop de acordo com as instruções do fabricante. A distribuição de tamanho do CD NA amplificado deve normalmente estar entre 101.500 bases de comprimento com um pico em torno de 600 bases e ter uma distribuição geral em forma de sino. Em seguida, para fragmentar o CDNA, adicione 6,6 microlitros de mistura de fragmentação a dois microgramas de CD NA em 30 microlitros de centrifugação e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos.

Em seguida, inative o DNA a 95 graus Celsius por 10 minutos e mantenha no gelo. Alíquota de um microlitro do CDNA fragmentado para verificação de distribuição de tamanho baseada em Agilent. O único tratamento do DNA homogeneíza a distribuição do tamanho do CD NA para cerca de 100 nucleotídeos antes da hibridização.

Verifique a distribuição do tamanho do CD NA de fita simples usando um bioanalisador Pfizer pré-úmido. O chip do gene HERV com 200 microlitros de pré-hibridização. Misture e incube a 50 graus Celsius, 60 RPM por 10 minutos.

Adicione 131 microlitros de mistura de hibridização aos 69 microlitros de CD NA fragmentado e rotulado à temperatura ambiente e na natureza por dois minutos a 95 graus Celsius. Em seguida, incube a 50 graus Celsius por cinco minutos e centrifugue na velocidade máxima por cinco minutos. Agora esvazie o chip do gene HERV pré-umedecido e carregue a preparação alvo de 200 microlitros.

Aplique pontos difíceis nos dois SEPTA hibridizar a 50 graus Celsius, 60 RPM por 18 horas. Esvazie o chip do gene HERV e encha a sonda. Seja uma matriz com 250 microlitros de tampão de lavagem, coloque 600 microlitros de mistura de solução SAPE e 600 microlitros de mistura de solução de anticorpos nas posições número um e número dois, coloque 800 microlitros de tampão de retenção de matriz na posição.

Número três, empurre as agulhas para baixo. Atribua o chip certo a cada módulo. Selecione o protocolo FS 4 5 0 0 0 4 e execute cada módulo conforme as instruções do software.

Aplique pontos difíceis nos SEPTA para evitar vazamentos. Em seguida, carregue o chip no carregador automático ou, alternativamente, diretamente no scanner. Comece a digitalizar.

Depois de digitalizar o chip dot CEL files são gerados, verifique a imagem e alinhe a grade ao local para identificar as células da sonda. Também sujeite os chips a várias medições de controle de qualidade. Agora normalize os chips e aplique uma abordagem de agrupamento hierárquico para explorar o conjunto de dados após a normalização, uma análise significativa foi realizada para procurar genes diferencialmente expressos do procedimento de microarray e foi seguida por uma correção de taxa de descoberta falsa em cinco amostras de tumor de par de correspondência e RNA de próstata normal.

Isso levou à identificação de 207 conjuntos de sondas HERV com valores de expressão diferenciais. Uma análise mais aprofundada de 35 amostras adicionais de pares de correspondência de outros tecidos cancerígenos identificou 44 conjuntos de sondas HERV específicas da próstata. Estas são as 10 estruturas HERV mais relevantes.

Finalmente, a análise funcional pode ser realizada em uma interface dedicada que consiste em sequências anotadas de interesse ilustradas por um elemento HERVW escolhido nas 10 principais estruturas provirais identificadas rotuladas na parte superior com suas sondas específicas dedicadas presentes na matriz HERV dois e rotuladas com as regiões retrovirais funcionais LTR gag POLE N, e com foco nos cinco subdomínios principais LTRU três e U cinco, e o projeto subsequente de primers de PCR para validação de RT PCR. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dominar as etapas críticas envolvidas na preparação de amostras e alvos, que são pré-requisitos de qualidade para ter sucesso no uso de microraios para terra, bem como na descoberta de biomarcadores convencionais. Projetamos um microarray de alta densidade em formato ametri, com o objetivo de caracterizar de forma otimizada a expressão de indivíduos de loci, a fim de entender melhor se eles podem ser ativos se a transcrição NA da área seca não-con ou modular a expressão gênica codificante.

Essa técnica abre caminho para pesquisadores na área de doenças crônicas e infecciosas, pois a identificação sistemática de voci ativos pode unificar hipóteses genéticas, virais e ambientais como fatores desencadeantes em diversas patologias. Trabalhar com um número limitado de amostras em um experimento de prova técnica de conceito pode ser complicado para descobrir com sucesso que os biomarcadores tomam precauções, como respeitar um fluxo de trabalho validado estatisticamente, incluindo robustez do método e uma amostragem representativa da população-alvo de pacientes.