A próxima geração de tissue microarray (ngTMA) Protocolo de Estudos biomarcadores
23 de setembro de 2014
O protocolo visa à otimização da construção e qualidade de microarrays de tecido para pesquisa com biomarcadores. Ele inclui aspectos do planejamento e design, patologia digital anotação de slides virtual, e arraying tecido automatizado.
O objetivo do procedimento a seguir é construir microarrays de tecidos ideais ou direcionados para uso subsequente na pesquisa de biomarcadores. Primeiro, um arquivo digital de lâminas é gerado a partir de lâminas de tecido representativas. As áreas histológicas de interesse são anotadas nas lâminas digitais para especificar as regiões exatas dos blocos doadores correspondentes a serem transferidos para o bloco de microraios de tecido.
Depois que o design e os layouts do microarray de tecido são criados, os blocos doadores são perfurados automaticamente e a causa é carregada nos microarrays de tecido. Usando essa abordagem de próxima geração precisa, rápida e automatizada, áreas histológicas precisas ou mesmo grupos específicos de células podem ser capturados e transferidos com precisão para um microarray de tecido. A principal vantagem de nossa técnica sobre os métodos existentes de microanel de tecido, como o uso de um dispositivo caseiro ou semi-automatizado, é claramente a precisão histológica.
Isso é conseguido combinando os pontos fortes da patologia digital com a experiência histológica e também o microanel de tecido automatizado demonstrando o procedimento hoje são Kalin Hamman e Jose Galvan. Duas assistências técnicas do nosso laboratório Usando o software de digitalização. Primeiro, selecione o modo automático para varredura de campo claro.
Em seguida, clique nas opções de digitalização para ajustar os parâmetros de qualidade do slide. Agora escolha salvar as digitalizações de slides localmente ou para o acabamento da Web clicando em parâmetros do servidor e defina o destino da digitalização para o centro do caso. Agora, prepare os slides antes de colocá-los no magazine Para o scanner, verifique se os slides estão limpos.
Se necessário, limpe-os Com etanol, até 25 lâminas podem ser carregadas em cada magazine e o scanner pode ser carregado com até 10 magazines. Vários carregadores são empilhados quando são carregados. Depois que os slides forem carregados, forneça todos os slides, nomes de arquivos e defina a pasta de salvamento no centro do caso.
Agora comece a digitalizar o slide clicando na seta verde. Nesta seção, os locais de onde as amostras de tecido são perfuradas na lâmina são definidos por anotações na lâmina digital. Comece abrindo a pasta de slides digitais.
No software de visualização, as alterações podem ser feitas na própria pasta. As notas podem ser adicionadas, os slides podem ser reordenados e os privilégios do usuário podem ser definidos, assim como os anexos. Agora comece a anotar os slides clicando em um.
Ele aparecerá no visualizador. No visualizador. Use a ferramenta de ampliação para avaliar o slide e encontrar as áreas de interesse para integração na próxima geração de TMA.
Usando a ferramenta de anotação TMA, selecione o tamanho do núcleo desejado e a cor da anotação. Anexe esta anotação a um slide clicando no slide. Em seguida, mova a anotação para as estruturas histológicas desejadas.
Essas anotações marcam os locais de punção no bloco de tecido correspondente. Repita esse processo até que todos os slides sejam anotados. Uma opção alternativa para a causa do tecido é enviá-los para um tubo de PCR de 0,2 mililitro para análise molecular.
Anote os slides usando uma marca de cor diferente para distinguir esses pontos daqueles que são o TMA. Depois que todas as anotações forem feitas, salve um arquivo de planilha contendo uma lista de todos os slides com suas anotações correspondentes e as cores das anotações. Comece a microrreconstrução tecidual recuperando os blocos de tecido de parafina correspondentes para todas as lâminas digitais anotadas, doravante.
Chamado de blocos doadores. Classifique os blocos na mesma ordem dos slides digitais. Verifique se cada bloco tem pelo menos quatro milímetros de espessura.
Caso contrário, o tecido precisará ser reinventado no computador. Abra o microarray de tecido do software e forneça um nome para o projeto. Vá para a troca de ferramenta e selecione o diâmetro da ferramenta necessário.
Agora carregue até 12 blocos de destinatários na máquina. Anote os nomes dos blocos. Todos eles devem ser rotulados usando o mesmo sistema de numeração para consistência.
Em seguida, no software, atribua o nome apropriado a cada um dos blocos para criar um layout TMA. Primeiro, faça um novo design TMA atribuindo o número de linhas, colunas, linhas vazias e espaçamento dos punções. Salve o layout e atribua-o ao bloco.
Em seguida, repita o processo para o próximo bloco. Com um novo layout ou o mesmo layout, os tamanhos de macho podem ser variados entre os blocos de recipients. Em seguida, carregue até 60 blocos doadores na máquina.
Até 10 blocos cabem em cada linha. A a F. Os blocos doadores restantes serão carregados posteriormente no software. Dê a cada bloco de doadores um nome de identificação.
Uma imagem de cada bloco será adquirida automaticamente. Agora alinhe as lâminas digitais com seus blocos doadores correspondentes. Primeiro, selecione um bloco.
Em seguida, clique no slide e compare o slide e bloqueie as imagens lado a lado. Selecione pontos de referência na imagem do bloco doador que correspondam a pontos específicos na lâmina digital correspondente. Em seguida, clique em Avançar e as anotações serão movidas para a imagem do bloco doador.
Se as anotações estiverem corretas, clique em cada uma para confirmar sua localização. Em seguida, clique em iniciar. Isso solicita que o microarray faça um furo no ponto de referência no bloco receptor e, em seguida, faça um furo do bloco doador no mesmo local e transfira o núcleo para o bloco receptor.
Para coletar núcleos para um tubo de PCR, clique na ferramenta de PCR para o bloco. Até quatro anotações podem ser usadas para fornecer tecido ao tubo. Uma vez definidos, clique em iniciar e o doador será chamado e o tubo carregado.
Depois que a máquina perfura e perfura, os núcleos, atualiza a imagem do bloco doador. Prossiga repetindo o alinhamento e a anotação para o próximo bloco. Em seguida, centralize-o.
Continue fazendo isso para cada bloco doador. Isso estará no TMA. Quando o primeiro conjunto de 60 blocos doadores estiver concluído, descarregue-os e carregue mais 60 blocos.
Continue o processo até que todos os blocos doadores estejam dispostos. Depois de tirar cerca de 500 núcleos, limpe a broca e a ferramenta de perfuração será removida. Quando as matrizes estiverem concluídas, exporte o projeto.
Um arquivo de planilha com os dados do projeto estará na pasta de exportação. Ele mostra a localização de cada amostra dentro de cada bloco TMA. Em seguida, salve as imagens do bloco doador com anotações sobrepostas como arquivos JPEG na pasta de exportação.
Isso conclui o processo de geração do bloco TMA. Este layout TMA mostra seis blocos NG TMA que foram construídos em duas cópias para 12 blocos finais para preencher a matriz. Cada bloco tumoral continha 402 manchas de tecido e cada bloco de tecido normal continha 268 manchas.
Depois que 60 blocos de doadores foram anotados, a causa foi perfurada. O tempo de transferência do núcleo foi de aproximadamente 12 segundos. A perda de núcleo foi mínima e o tempo total para uma matriz, este projeto foi de cerca de 24 horas.
Isso incluiu o tempo necessário para perfurar a causa para análise molecular subsequente após o processo de N-G-T-M-A. Outros métodos como imunohistoquímica em citohibridização e até mesmo colorações especiais podem ser aplicados a esses microarrays de tecido, a fim de responder a algumas perguntas como quais genes ou proteínas são expressos ou mesmo alterados em diferentes tecidos.
Visão Geral
Este protocolo descreve a construção e otimização de microarranjos de tecidos para pesquisa de biomarcadores. Ele integra a patologia digital e o microarranjo automatizado de tecidos para aumentar a precisão histológica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa de biomarcadores
- Tecnologia de microarranjos de tecidos
- Patologia digital
Contexto
- As microarranjos de tecidos são essenciais para a análise de biomarcadores de alto rendimento.
- Os arquivos digitais de lâminas facilitam a anotação precisa de áreas histológicas.
- Processos automatizados melhoram a eficiência e a precisão na amostragem de tecidos.
- A expertise histológica é crucial para a seleção ideal de tecidos.
Objetivo do Estudo
- Construir microarranjos de tecidos direcionados para pesquisas com biomarcadores.
- Aumentar a precisão da amostragem de tecidos por meio da automação.
- Agilizar o processo de anotação digital de lâminas e transferência de tecidos.
Métodos Utilizados
- Criação de arquivos digitais de lâminas a partir de lâminas de tecido representativas.
- Anotação de áreas histológicas de interesse em lâminas digitais.
- Perfuração automatizada de blocos doadores para criar microarranjos de tecidos.
- Uso de software para o design e gerenciamento do layout de microarranjos de tecidos.
Resultados Principais
- Construção bem-sucedida de microarranjos de tecidos com alta precisão histológica.
- Transferência eficiente de amostras de tecido direcionadas para blocos receptores.
- Fluxo de trabalho aprimorado por meio da automação e integração com a patologia digital.
- Criação de uma planilha abrangente de dados do projeto para análises posteriores.
Conclusões
- O protocolo melhora significativamente a qualidade das matrizes de microarranjos de tecidos.
- A combinação de patologia digital com técnicas automatizadas produz resultados precisos.
- Essa abordagem é vantajosa em comparação com os métodos tradicionais de construção de microarranjos de tecidos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A tecnologia de microarranjo de tecidos de nova geração (ngTMA) atende à necessidade crítica de amostragem precisa e reprodutível de tecidos na descoberta e validação de biomarcadores. Ao integrar a patologia digital com o arranjo automatizado, o ngTMA aumenta a precisão histológica e a produtividade, apoiando diretamente os fluxos de trabalho de validação de alvos e desenvolvimento de ensaios. Essa abordagem reduz o ruído biológico em modelos pré-clínicos, melhorando a confiança preditiva na identificação de compostos promissores e nos estudos de biomarcadores translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao capturar regiões histológicas específicas, como centro do tumor, frente de invasão e sítios metastáticos, para a validação funcional de alvos.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da anotação precisa de zonas teciduais, reduzindo a ambiguidade mecanicista em estudos de engajamento de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, gerando pontos de tecido padronizados a partir de regiões anotadas, permitindo avaliação confiável de compostos.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de perfuração automatizada e correspondência digital de lâminas, garantindo preparação consistente de amostras entre diferentes execuções.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Discute a relevância da doença e o alinhamento de biomarcadores translacionais mediante a incorporação de múltiplos tipos de tecidos/zonas histológicas (por exemplo, tumor, linfonodo, metástases hepáticas, tecido normal) provenientes de amostras de pacientes.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, produzindo múltiplas cópias de ngTMA para análise paralela em imuno-histoquímica, hibridização in situ e colorações especiais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ngTMA integra-se ao continuum de descoberta, desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos e trabalhos Pré-clínicos, fornecendo resultados quantitativos e com resolução espacial em tecidos que apoiam a verificação de hipóteses e a elucidação de vias.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia a testagem de hipóteses, a elucidação de vias ou a redução de riscos biológicos por meio da captura precisa de áreas histológicas de interesse por meio de anotação digital.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio, reprodutibilidade ou saídas quantitativas, quando apoiadas pelo artigo, por meio do arranjo automatizado de regiões anotadas que produzem manchas padronizadas de tecido.
- Análises: Destaca medições, leituras ou saídas estatísticas que ajudam as equipes a comparar condições por meio da anotação digital de lâminas e exportação de dados do projeto para análises posteriores.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método à continuidade pré-clínica ou ao alinhamento de biomarcadores somente quando o artigo o apoiar, ao permitir a aplicação de IHC, ISH e colorações especiais em ngTMA para avaliar a expressão de proteínas/genes em diferentes zonas do tecido.
- Reutilização Institucional: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único, por meio da produção de múltiplas cópias de ngTMA e do arquivamento digital de lâminas para estudos futuros.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Decisões de avanço ou interrupção mais precisas, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto na Carteira: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica obrigatória em histologia, patologia digital e design de microarranjos de tecidos.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo microarranjador automatizado de tecidos, scanner de lâminas e plataforma de anotação baseada na web.
- Requisitos de padronização entre equipes para protocolos de anotação, rotulagem de blocos e gerenciamento de dados.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, como diferentes tipos de tecidos, tamanhos de núcleos e volumes de amostras de pacientes.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem, incluindo tempo de anotação (2-3 min/caso), requisitos de digitalização (3 corridas noturnas para 134 pacientes) e tempo de montagem do arranjo (15-20 h).
