Name: A próxima geração de tissue microarray (ngTMA) Protocolo de Estudos biomarcadores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a construir tissue microarrays de próxima geração para pesquisa de biomarcadores usando patologia digital e automação. Este método melhora a precisão histológica e o fluxo de trabalho em análises de alta vazão.

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Os autores gostariam de agradecer à equipe técnica da Unidade de Pesquisa translacional; Mary Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni ea Equipe de Informática no Instituto de Patologia da Universidade de Berna.

NOTA: Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética local do Hospital Insel, Berna, Suíça (07-10-13). Os tecidos foram obtidos a partir do banco de tumores Bern, Instituto de Patologia, Universidade de Berna. 1 Planejamento e Desenho (Consulting) <ol><li> Pense sobre a questão de pesquisa a ser respondida. Decidir sobre os tipos de tecidos a serem incluídos no projeto. Determine o que estruturas histológicas são importantes para responder a pergunta. </li><li> Determinar o diâmetro do núcleo mais útil e do número de núcleos por paciente para o projeto. Decidir sobre o número de cópias do tecido da próxima geração Micro Array (ngTMA) com base na quantidade de biomarcadores para ser investigado. </li><li> Considere aspectos estatísticos, tais como o tamanho da amostra e análise após o tissue microarray (TMA) é construído. Determinar o número de pacientes de inclusão no estudo e controlo de estabelecimento de tecidos para a matriz. </li><li> Recuperar o histológico (oudiagnóstico) Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) lâminas de cada paciente. Faça uma breve revisão das lâminas e identificar aqueles que contêm informações e histologia relevantes para o projeto. NOTA: Faça novas seções dos blocos de parafina, se corante especial ou imunohistoquímica slide é pretendido para a digitalização de slides e anotações, em vez de H &amp; E diapositivos </li></ol> 2 Deslize Scanning <ol><li> Ligue o PC e scanner de slides e software de digitalização aberta. Selecione &quot;modo automático&quot; para a digitalização de campo claro da tela de visualização. </li><li> Clique em &quot;Opções de verificação&quot; para ajustar os parâmetros de qualidade de slides. Neste momento, selecione se os slides devem ser digitalizados diretamente para a plataforma digital acessível por web ou em uma unidade local (ou disco rígido externo) e definir os tipos de varredura eo número de pontos de focagem. </li><li> Clique em &quot;Parâmetros do Servidor&quot; para digitalizar para o &quot;centro de Caso&quot;. Nesta etapa, adicionar mais revistas, rotular todos os slides e definira pasta no processo Center, onde os slides devem ser armazenados. Cada revista tem capacidade para até 25 slides. </li><li> Verifique a qualidade / limpeza de lâminas histológicas reais para a digitalização. Se necessário, as lâminas limpas com etanol 70%. </li><li> Carregue até 25 lâminas por revista com os rótulos virados para dentro (Figura 3A) </li><li> Coloque a revista no scanner. Para mais do que um compartimento, colocá-los uns em cima dos outros. </li><li> Comece a digitalizar slides, clicando na seta verde (Figura 3B). Quando todos os slides são digitalizados, descarregar as revistas e desligue o scanner de programa, PC e slide. </li></ol> 3 Deslize Digital Anotação <ol><li> Digite o endereço do navegador para o centro de gestão de slides digital e baixar o software visualizador de slides digital gratuito. </li><li> Abra o software visualizador de slides digitais e selecione a pasta que contém os slides digitais (Figura 4A). </li><li> Adicionar notas, reorganizar e administrar a digitapasta de slides l ou atribuir direitos de usuário para os colegas ou adicionar anexos à pasta. </li><li> Clique no slide digital desejado que aparece no visualizador de slides digital. </li><li> Usando a ferramenta de ampliação, avaliar o slide e encontrar as áreas de interesse para a integração no ngTMA. </li><li> Usando a &#39;ferramenta de anotação TMA &quot;, selecione o tamanho do núcleo desejado ea cor da anotação. Coloque a anotação no slide digitais, clicando sobre ela (Figura 4B). </li><li> Mover a anotação das estruturas histológicas desejados para incorporação no ngTMA (Figura 4C). </li><li> Repita esse processo de anotação novamente usando a ferramenta de anotação, selecionar um tamanho de núcleo e uma cor anotação desejada. Repita a visualização de slides e anotações em todos os slides na pasta. </li><li> Alternativamente, coloque núcleos de tecido para PCR em tubos de 0,2 ml em vez de integração no TMA. Anotar os slides usando uma cor diferente para identificarestes pontos para análise molecular. </li><li> Criar uma lista de todos os casos com suas anotações e cores correspondentes. </li></ol> 4. Tissue Microarray Construção <ol><li> Recupere os blocos de tecido parafina correspondentes para todos os slides digitais anotados, classificar os blocos na ordem desejada para microarraying tecido. </li><li> Certifique-se de que os blocos de tecido ter um mínimo de espessura de 4 mm. Se não, reencaixe de tecido é necessário. </li><li> Ligue o PC &quot;ON&quot; e de tecido automático instrumento microarrayer. Abra o software microarrayer tecido e fornecer um nome para o projeto </li><li> Executar uma &quot;ferramenta Change&quot; e selecione o diâmetro da ferramenta necessária para o projeto (ou seja, 0,6, 1,0, 1,5 ou 2,0 mm). </li><li> Carregue até 12 blocos de &quot;destinatário&quot; do TMA na máquina. Dê um ID para cada um dos 12 blocos </li><li> Criar um layout TMA para cada bloco receptor. Observar um projeto TMA com número de linhas, colunas e emptlinhas de y, assim como a distância entre os núcleos. Criar um novo layout para cada bloco receptor ou usar o mesmo layout repetidamente. </li><li> Coloque o cursor sobre o layout bloco receptor para dar o primeiro núcleo. </li><li> Em seguida, carrega-se para 60 blocos dadores na microarrayer tecido (Figura 5A). Coloque dez blocos em cada linha de A a F. Dar a cada bloco de uma identificação dos doadores. Observar imagens de cada bloco doador na tela do computador adquirido automaticamente pelo microarrayer tecido. </li><li> Começando com o primeiro bloco, clique em &quot;Slide&quot;. Observe o slide digitais anotada armazenadas no centro de gestão de slides digital (ou na unidade externa) usando o visualizador de slides digital. Ver a imagem do bloco dador e lado-a-lado da corrediça digital. </li><li> Selecione os pontos de referência na imagem do bloco de sobrepor a imagem do bloco de doadores com o slide digitais </li><li> Após clicar em &quot;Next&quot;, observe as anotações em uma imagem maior do bloco. (Figura 5B &lt;/ Strong&gt;). Clique em cima das anotações para confirmar e clique em &quot;Start&quot;. NOTA: Este pede ao microarrayer tecido para iniciar a perfuração de um buraco de 0,6 mm de diâmetro no bloco receptor no ponto de partida selecionado. Em seguida, num segundo passo, utilizando-se a ferramenta de perfuração, o instrumento perfura buraco no tecido do bloco dador seleccionado na região exacta anotada e confirmado. Cores são, então, transferidos do doador para o bloco receptor. </li><li> Após cerca de 500 núcleos, limpe a ferramenta de perfuração e perfuração com um cotonete de xileno. </li><li> Se núcleos de tecido são desejados (em vez de socos em um ngTMA), clique na ferramenta &quot;PCR&quot; para o bloco, confirmar até 4 anotações e clique em &quot;Iniciar&quot;. Isto vai perfurar e transferir os núcleos dentro de um tubo de 0,2 ml. </li><li> Repita ponto 4,9-4,11 com o segundo bloco dador, e assim por diante. </li><li> Depois de usar todos os blocos doadores, insira uma segunda rodada de blocos doadores (61-120) no tissue microarrayer e continuar passos 4,8-4,11. </li><li> Atualizar doadores e bloco receptor de imagens, enquanto o progresso do projeto durante a perfuração e perfuração está ocorrendo (Figura 5C). </li><li> Executar uma &quot;Export&quot;, após a conclusão do projeto. Localize o arquivo .xslx com os IDs dos doadores e bloco receptor, a localização de todos os socos dentro da TMA, bem como o layout TMA / design, na pasta exportada. Salvar todas as imagens do bloco de doadores com todo anotação sobreposta como imagens jpg na pasta exportado (Figura 5D). O bloco final TMA está então pronto. </li></ol>

<ol><li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4, 844-847 (1998).</li>
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</ol>

Os autores não divulgam

Neste trabalho, um protocolo para ngTMA está delineado. ngTMA é um conceito recém-criado para microarraying tecido que envolve planejamento e design, patologia digital e anotação de slides, bem como automatizado microarraying tecido 12. Comparado com microarraying tecido convencional, ngTMA oferece muitas vantagens. Em uma primeira etapa, a fase de planejamento e projeto é fundamental. O foco está em responder a uma pergunta de pesquisa orientada. Isso deve levar em consideração as questões histológicos (por exemplo, quais as regiões e quantos pontos eu quero incluir?), O planejamento estatístico (por exemplo, tamanho da amostra? Como posso analisar minhas amostras mais tarde?) E considerações logísticas (por exemplo, como muitos biomarcadores e, portanto, o número de cópias ngTMA?). A ngTMA específica é feita para as necessidades específicas, seja para a triagem de biomarcadores e de alto rendimento ou destinado a estudar os aspectos histológicos específicos em apenas alguns cas bem selecionadoses. Um deles, se não a, a desvantagem mais importante de microarraying tecido convencional é a baixa precisão com que marcas nas lâminas histológicas são feitas. O estudo das estruturas histológicas, células ou regiões específicas é feito quase impossível. ngTMA permite alta precisão porque as anotações são colocados diretamente nos slides digitais. Isso permite que o pesquisador para selecionar precisamente as regiões a serem perfurados, incluindo células específicas. Neste exemplo, várias áreas dentro do mesmo bloco de tecido são perfurados para fora para arraying, tais como o centro de tumor, frente à invasão e áreas de interação tumor / estroma com destaque para a presença de aglomerados de células tumorais pequenas ou até mesmo uma única célula. Esta precisão só pode ser conseguido usando ngTMA. Em terceiro lugar, porque as lâminas são digitalizadas em uma plataforma digital com base na Web, deslize visualização e anotações podem ser feitas através do computador, em vez de com o microscópio. O software arraying tecido proporciona uma fácil utilizaçãode interface com um elevado grau de flexibilidade, por conseguinte, diferentes disposições de concepção e ngTMA pode ser alcançado. Desde TMA construção é realizada automaticamente por perfuração, há pouca necessidade de se significativamente reduzida prática de manobra e a quantidade de tempo para a construção. O tempo para a construção do TMA, neste exemplo, é aqui entre 24 hr. Usando uma abordagem TMA convencional e estimativa de 15 golpes por hr, o projeto levaria cerca de 304 horas. ngTMA pode ser aplicado para estudar a expressão de proteínas, o ARNm ou o ADN, bem como combinações destes. Figura 9 ilustra várias destas aplicações para biomarcadores potenciais. Imunohistoquímica padrão podem ser aplicados para determinar o índice de proliferação de cancros utilizando Ki-67. Uma abordagem combinada para investigar a expressão da proteína e a amplificação do ADN por genes, tais como HER2 pode ser utilizado. Os tecidos podem ser reunidos em um único ngTMA para reduzir custos, uso de tecido e outros recursoss. Além disso, o ARNm cromogénico de hibridização in situ para HER2 e outros genes podem ser realizadas para identificar transcritos de mRNA individuais em um grande número de casos, utilizando um número mínimo de lâminas de tecido. A imuno-histoquímica de marcadores imunológicos, tais como CD8 pode ser visualizado no contexto do microambiente do tumor. Imunohistoquímica dupla também pode ser usado para realçar determinadas regiões de interesse, como as interações entre células do sistema imunológico (marcadas em vermelho) e células tumorais (marcadas em marrom) na frente de invasão de cânceres. Tal região de interesse não poderia ter sido capturado usando microarraying tecido convencional. No entanto, este protocolo contém algumas limitações. O desafio mais importante é a sobreposição entre o bloco de doadores e de slides digital. Vários fatores podem influenciar esta etapa. Em primeiro lugar, o mais tardar a partir da secção de bloqueio deve ser usado para a digitalização de slides. Em muitos casos, a H &amp; E não é a última parte do bloco dador, rather é uma coloração imuno-histoquímica ou outras. Neste caso, também uma lâmina corada pode ser usada, desde que a última mancha é digitalizado e anotada ou um novo H &amp; E deve ser feito. Cuidados também devem ser tomados quando se secções de tecido estão sendo feitas como tecidos podem expandir-se no banho de água que leva a correspondência de um desafio de slides e bloco. Em segundo lugar, no momento em que projectos estão limitados a 12 receptores de blocos TMA transformados em uma única vez. Projetos maiores superiores a 12 TMAs deve ser atribuído a um segundo nome do projeto. Em terceiro lugar, os blocos doadores devem ser feitas a partir de moldes padrão e cassetes como o instrumento não pode ajustar-se a vários tamanhos. Finalmente, blocos dadores deve exceder a altura mínima (4 mm) para conseguir a perfuração óptima. Em alguns casos, isto requer reencaixe dos tecidos. Centenas de publicações ao longo dos últimos anos destacam a TMA como uma ferramenta de valor inestimável para a pesquisa de biomarcadores. TMA foram usadas para estudar 13 pulmão, colo-rectal 7, breast 14, 15 próstata, pâncreas, 16, 17 da bexiga, e cancros gástricos 18, para citar alguns. Um número crescente de autores combinaram o uso do TMA com a análise de imagens e avanços significativos estão sendo feitos nessa direção 19-21. No entanto, ao lado de um punhado de grupos de pesquisa que tenham publicado idéias inovadoras TMA 22-24, tem sido dada pouca atenção para otimizar a técnica de TMA-se. Microarrayers tecido automatizadas, como o ATA-27 por Estigen / Beecher fornecem projeto de layout e socos tecido expediente e automatizado. Isto representa no entanto apenas um aspecto do conceito ngTMA. ngTMA é uma melhoria substancial em relação às técnicas convencionais microarraying tecido. Ele incorpora experiência em histologia e design TMA com a flexibilidade de patologia digital ea precisão de anotações digitais com a velocidade ea confiabilidade de construção automatizada TMA. A combinação de ngTMA análise da imagem e para a avaliação de proteína e moleculares biomarcadores será uma ferramenta poderosa para melhorar ainda mais a qualidade da investigação clínica e de translação no futuro.

Ao longo das duas últimas décadas, tissue microarray (TMAs) tiveram um impacto notável sobre estudos de investigação de biomarcadores. TMA são essencialmente de tecido &quot;armazenamento&quot; produzidos pela transferência repetida de pequenos fragmentos de tecido, tipicamente variando em tamanho de 0,6 a 2,0 mm de diâmetro, a partir de blocos de parafina &quot;dadores&quot; num único bloco de TMA &quot;receptor&quot; (Figura 1) 1. Usando um pequeno tamanho do núcleo, aproximadamente 500 diferentes pontos de tecido de poucos ou muitos pacientes diferentes podem ser dispostos em uma TMA 2. A utilização de TMA para estudos de biomarcadores preditivos de prognóstico ou tem muitas vantagens. Considere o exemplo em que a expressão de uma proteína biomarcador por imuno-histoquímica é para ser avaliada em 450 pacientes. Em vez de executar 450 imunohistoquímica em 450 pacientes lâminas seccionadas a partir do mesmo número de blocos, pequenos núcleos de cada uma das amostras pode ser dispostos em uma única TBloco MA. Mesmo que vários núcleos são retiradas de cada paciente individual, um número mínimo de blocos são produzidos. Isso tem o efeito de diminuir considerável drasticamente os custos e outros recursos, bem como reduzir o desperdício de tecido. Além disso, este estudo permite apropriadamente alimentado usando um grande número de tecidos, a ser avaliada sob as mesmas condições experimentais. TMAs ter muitas aplicações diferentes. Por exemplo, eles podem ser usados ​​para estudar a morfologia, a expressão da proteína, a expressão de ARN e as aberrações de DNA após coloração com corantes diferentes, ou após a imuno-histoquímica, ou mesmo cromogénico e hibridação in situ fluorescente 3-7. Estudos recentes também têm utilizado TMAs para testar a variação intra e interlaboratorial em protocolos de coloração, estabelecer especificidade ou sensibilidade de anticorpos para as mutações genéticas específicas, e para determinar a reprodutibilidade interobservador da expressão da proteína em colaborações internacionais <sup&gt; 8-11. A construção de TMAs tradicional usando tecidos derivados do paciente é um procedimento passo múltiplos de comprimento (Figura 2). Ele começa com uma busca de possíveis casos adequados e seleção de lâminas de diagnóstico dos arquivos em um instituto de patologia, ou outro instituto, de onde são recuperados. O patologista avalia cada slide por caso e seleciona o slide mais representativo para os objetivos do estudo. Em seguida, a região de interesse é marcado usando uma caneta directamente sob o microscópio. Isso é muitas vezes difícil e imprecisa e resulta apenas em uma &quot;estimativa&quot; de onde socos tecido deverão ser tomadas a partir. Em seguida, os blocos de parafina correspondentes a esses slides marcados são recuperadas a partir do arquivo. Uma rápida comparação entre o bloco e slide é feito. Usando um arrayer semi-automatizada ou caseiro tecido, o bloco dador é perfurado na região estimativa de interesse e transferido para um recipiente de blocos TMA. Construção de TMAs usando esta técnica arraying é trabalhoso, demorado e impreciso, e inflexível. Preparando uma TMA de 475 pontos em 3 exemplares é estimada em cerca de 84 horas de trabalho. Uma nova abordagem para a construção de TMA foi introduzido recentemente pelo Instituto de Patologia da Universidade de Berna, que se baseia em três componentes: planejamento e projeto (ou consultoria), patologia digitais combinados com experiência em histologia e TMA automatizado arraying 12. Juntos, este conceito é chamado de próxima geração Tissue Microarray (ngTMA). Abaixo, um protocolo para ngTMA é descrita com base em um exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático. Aqui, os tumores primários, bem como metástases de linfonodos e metástases hepáticas devem ser dispostas em ngTMAs para análise de biomarcadores subseqüente. Adicionalmente, pequenos núcleos de tecido de cada paciente são desejáveis ​​para a extracção de ácido nucleico futuro.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic 250 Flash II</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Scanner</td></tr><tr><td>de slides TMA Grandmaster</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Tissue Microarrayer</td></tr><tr><td>Pannoramic Viewer</td><td>3DHistech</td><td>software de</td><td>visualização de slides</td>grátis</tr><tr><td>Case Center</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Plataforma de slides digitais</td></tr></tbody></table>

a próxima geração de tissue microarray (ngtma) protocolo de estudos biomarcadores

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

Pesquisa com biomarcadores depende de tissue microarray (TMA). TMA são produzidos por transferência repetida de pequenos fragmentos de tecido a partir de um bloco de &quot;dador&quot; em um bloco de &quot;destinatário&quot; e, em seguida, utilizados para uma variedade de aplicações de biomarcadores. A construção de TMA convencional é de trabalho intensivo, impreciso e demorado. Aqui, um protocolo utilizando tissue microarrays de próxima geração (ngTMA) é descrito. ngTMA é baseada em planejamento TMA e design, patologia digital e microarraying tecido automatizado. O protocolo é ilustrada com um exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático. Aspectos histológicos, estatísticos e logísticos são consideradas, tais como o tipo de tecido, as regiões histológicos específicos, e os tipos de células para a inclusão na TMA, o número de pontos de tecido, tamanho da amostra, a análise estatística, e número de cópias de TMA. Lâminas histológicas para cada paciente são digitalizados e enviados para uma plataforma digital com base na web. Lá, eles são vistos e annotated (marcado) usando uma ferramenta de diâmetro 0,6-2,0 mm, várias vezes usando várias cores para distinguir áreas de tecidos. Blocos doadores e 12 blocos de &quot;destinatário&quot; são carregados no instrumento. Diapositivos digitais são recuperadas e combinadas a imagens de blocos de doadores. Arraying repetida de regiões anotados é executada automaticamente, resultando em um ngTMA. Neste exemplo, seis ngTMAs são planejadas com seis diferentes tipos de tecidos / zonas histológicas. São desejados Dois exemplares dos ngTMAs. Três a quatro lâminas para cada paciente são verificados; 3 corridas de verificação são necessárias e realizado durante a noite. Todas as lâminas são anotadas; cores diferentes são usadas para representar os diferentes tecidos / zonas, ou seja, o centro do tumor, invasão frente, tumor / estroma, metástases em linfonodos, metástases hepáticas e tecido normal. 17 anotações / case são feitas; tempo para anotação é de 2-3 min / case. 12 ngTMAs são produzidos contendo 4.556 pontos. Tempo arraying é de 15-20 horas. Devido à sua precisão, flexibilidade e de velocidade, é um poderoso ngTMAFerramenta para melhorar ainda mais a qualidade de TMA utilizado na investigação clínica e de translação.

Planejamento e Desenho Aqui foi utilizado o exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático que estão sendo investigados por uma série particular de biomarcadores. Não só é um ngTMA planejado para estes pacientes, mas a extração de DNA, seguida de análise mutacional por algum gene específico. Durante a fase de planejamento e projeto de ngTMA, os seguintes aspectos foram decididos. De cada paciente, 6 regiões histológicas diferentes serão investigadas: Centro de tumor, frente de invasão tumoral, as áreas de maior densidade tumor brotamento (interação tumor / estroma), o tecido normal, metástases linfáticas e metástases hepáticas. Três pontos de tumor por área de tecido tumoral e dois pontos de tecido normal devem ser incluídos no projeto (n = 17 pontos por paciente). Uma vez que está previsto que mais de 50 biomarcadores ser investigado neste material do paciente, são desejadas duas cópias do ngTMA final. Devido à possibilidade de pequeno tamanho de linfonodos e distanmetástases t, um pequeno diâmetro do núcleo de 0,6 mm para TMA construção para todos os tecidos é escolhido. Além disso, está previsto que cada região se vestisse separadamente, de modo que 6 ngTMAs contendo diferentes áreas histológicas serão produzidos: um ngTMA contendo tecidos do centro do tumor a), b) frente invasão, áreas c) tumor brotamento, d) o tecido normal , e) de metástases linfáticas, e f) metástases hepáticas. Para a concepção do TMA usando uma ferramenta de 0,6 milímetros, uma distância confortável de 0,4 milímetros entre perfuradores será seleccionado. Porque a avaliação de manchas de tecidos em linhas e colunas longas muitas vezes é cansativo, dois projetos diferentes são selecionados. Para os blocos tumorais com três socos por área de tecido, um projeto contendo seis partes é criado. Isto leva a um número total de 402 golpes de tecido. Para socos tecido normal, dois socos por caso devem ser incluídos. Um layout de montagem 432 socos no total é escolhida. Além disso, para cada caso, até 4núcleos de 0,6 milímetros, adicionalmente, ser perfurado e colocado em tubos de 0,2 ml. Estes núcleos de tecido também será anotada. Para resumir, 6 ngTMAs de diferentes tecidos serão produzidos (5 séries de tumores x 3 socos x 134 pacientes; uma matriz tecido normal x 2 socos x 134 pacientes), além de quatro núcleos por paciente para tubos. Tomados em conjunto, 2.814 anotações serão feitas. Em seguida, as lâminas correspondentes H &amp; E de pacientes selecionados serão recuperadas a partir do arquivo de slides. Cada caso é brevemente revisto por um patologista ea maioria das lâminas representativas de cada tipo de tecido são selecionados. Digitalização Lâminas digitais de cada corte histológico são feitas para anotação futuro. Para este estudo, 3-4 lâminas de tecido deverão ser digitalizados por caso, ou seja, o câncer colorretal primário, com ou sem os tecidos normais adjacentes, metástases em linfonodos e metástases hepáticas e, possivelmente, um slide de con adicionaltenção mucosa normal. Até 10 revistas diferentes pode ser totalmente carregada no scanner de slides; portanto, 250 slides podem ser digitalizados em um único prazo. Tempo para a digitalização e tamanho do diapositivo digitais varia de acordo com as dimensões do tecido e o factor de qualidade desejada. As faixas de fator de qualidade de 0 a 100 Aqui, um fator de qualidade de 60 é selecionado, uma vez que produz um tamanho de arquivo de digitalização menor sem perda perceptível de qualidade da digitalização. Pequenas biópsias podem ser digitalizados em menos de 30 segundos, enquanto cortes de tecido inteiro, como os usados ​​neste exemplo pode demorar entre 2 e 10 min. Tamanho do slide Digital também pode variar de 2 MB a 2 GB. Usando um fator de qualidade de 60, verifica entre 600 MB e 1 GB são produzidos. Entre 402 e 536 lâminas são necessários para este projeto, totalizando 3 séries de digitalização. Cada etapa é realizada durante a noite. Cerca de 500 GB de espaço de armazenamento é necessário. Slides são digitalizados diretamente para uma plataforma digital chamado Caso Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Caso Center é acessível de qualquer lugar com acesso à web, inserindo o nome de usuário e senha designado. Anotação Para anotação, dois aspectos devem ser considerados: 1) diferentes áreas do tecido deve ser dada diferentes cores de anotação e 2) o número de anotações deve refletir o número de cópias desejadas do ngTMA final. Neste caso, três pontos por área de tumor para uma única cópia foram selecionados. Para 2 cópias, cada região deve ser anotada com 6 pontos. Útil é verde para o tecido normal, azul para o centro de tumor, amarelo para a frente de invasão tumoral, vermelho para as áreas de tumor de brotamento (tumor / estroma) interação, preto de metástases linfáticas, turquesa para metástases à distância e finalmente branco para regiões de ser utilizado para os tubos. Anotação de cada caso requer 2-3 min. Construção ngTMA Este estudo requer 6 ngTMA blocos to ser construída em duas cópias, resultando em 12 blocos finais. O número máximo de blocos receptores que pode ser suportado pela arrayer é 12 Cada bloco de tumor irá conter 402 pontos de tecido e cada bloco de tecido normal conterá 268 pontos, totalizando 4.556 pontos em todo o projeto. Um layout TMA é criada para cada bloco receptor eo projeto está salvo (Figuras 6A, 6B). 60 os blocos de tecido pode ser carregado no microarrayer tecido em paralelo; uma imagem de cada bloco dador é feita. Começando com o primeiro bloco de doadores, o slide digitais anotada correspondente é recuperada do processo Center. Correspondência de slides é realizada, o que pode demorar entre 1-3 min. As anotações são confirmadas ea arrayer é solicitado para iniciar perfuração (Figura 7). Perfuração e tempo de transferência de núcleo é de aproximadamente 12 segundos. Perda de núcleos durante este procedimento é mínimo. O tempo total para arraying este projeto é de aproximadamente 24 horas, incluindo o tempo para SLIde / bloco de correspondência e recarga do instrumento. Alguns exemplos de ngTMA estão ilustrados na Figura 8A. Núcleos para análise molecular subsequente também pode ser perfurado no momento (Figura 8B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1 A) Um bloco 'doador'. Cores do bloco doador são perfurados para fora e transferido para B) um bloco receptor, ou tissue microarray (TMA). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2 O fluxo de trabalho de tissue microarray convencional. A) lâminas histológicas são recuperadas a partir do arquivo e B) dada ao patologista f ou revisão. CD) As anotações são feitas nos slides que indicam a região estimada 'para transferência. E) Os blocos de tecido correspondentes são recuperadas. F) Block e slides são comparados para correspondência, o que pode G), por vezes, ser uma tarefa desafiadora. HJ ) microarraying Tissue toma então lugar. K) Cores são repetidamente transferidos e L) uma TMA final é construído. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3 a) até 25 lâminas podem ser colocados em cada revista para digitalização. B) Ajustes para o fator de qualidade e tamanho pode ser feito. Progresso da digitalização pode ser monitorado. "Src =" / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "width =" 600 "/&gt; Figura 4 A) Digitalizado slides podem ser transferidos para a plataforma baseada em web, Caso Center. B) lâminas digitais podem ser vistos. A ferramenta de anotação TMA permite ao usuário selecionar o tamanho do núcleo e cor necessária para anotação. C) As anotações podem ser colocados diretamente sobre a lâmina digital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500"> Figura 5 A) Até 60 blocos podem carregado no microarrayer tecido, ou seja, 10 blocos doadores por linha e 12 destinatários blocos também. B) Uma imagem de cada bloco doador é retirado, a digital slide é recuperado. Correspondência de bloco de corrediça e é feito e anotações são utilizadas para bloquear a perfuração. C) O progresso da arraying pode ser monitorizada, enquanto o instrumento está perfurando. D) Após a perfuração é executada, a exportação da localização de cada ponto no esquema mas também uma imagem de cada bloco dador com anotações correspondentes é feita. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500"> Figura 6. Estes layouts TMA foram utilizados para predispor os blocos de tumor A) e B) os tecidos normais. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500"> Figura 7. Tela do software microarrayer tecido. À esquerda, 12 recipient blocos pode ser colocada no instrumento. Na parte inferior, são tomadas as imagens de cada bloco dador. No centro, o layout do TMA, o progresso da perfuração, bem como as imagens ampliadas de cada bloco dador com anotações é encontrado. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500"> Figura 8 A) Alguns exemplos de blocos ngTMA recém-criados. B) socos tecido adicionais podem ser tomadas para análise molecular subseqüente. Estes núcleos são perfurados e colocado em tubos de 0,2 ml. <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600"> Figura 9 Exemplos de aplicações de biomarcadores ngTMA. A) Imunohistoquímica coloração de Ki67 em câncer colorretal. Dupla HER2 imunohistoquímica / hibridação in situ, ensaio mostrando B) a baixa expressão da proteína (castanho) e nenhuma amplificação do gene Her2 (preto) em relação ao centrómero (vermelho), C), de expressão elevada de proteína (castanho) e a amplificação do gene Her2 ( preto) em relação ao centrómero (vermelho). D) Hibridização in situ de Her2 que mostra transcritos de ARNm únicos no cancro da mama ngTMA. E) Imuno-histoquímica para CD8 no câncer colorretal. F) Duplo mancha imunohistoquímica para marcador pan-citoqueratina AE1 / AE3 (marrom; células tumorais) e CD68 (vermelho;. Macrófagos) destacando microambiente do tumor no câncer colorretal <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O protocolo visa à otimização da construção e qualidade de microarrays de tecido para pesquisa com biomarcadores. Ele inclui aspectos do planejamento e design, patologia digital anotação de slides virtual, e arraying tecido automatizado.

A próxima geração de tissue microarray (ngTMA) Protocolo de Estudos biomarcadores

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

O objetivo do procedimento a seguir é construir microarrays de tecidos ideais ou direcionados para uso subsequente na pesquisa de biomarcadores. Primeiro, um arquivo digital de lâminas é gerado a partir de lâminas de tecido representativas. As áreas histológicas de interesse são anotadas nas lâminas digitais para especificar as regiões exatas dos blocos doadores correspondentes a serem transferidos para o bloco de microraios de tecido.Depois que o design e os layouts do microarray de tecido são criados, os blocos doadores são perfurados automaticamente e a causa é carregada nos microarrays de tecido. Usando essa abordagem de próxima geração precisa, rápida e automatizada, áreas histológicas precisas ou mesmo grupos específicos de células podem ser capturados e transferidos com precisão para um microarray de tecido. A principal vantagem de nossa técnica sobre os métodos existentes de microanel de tecido, como o uso de um dispositivo caseiro ou semi-automatizado, é claramente a precisão histológica.Isso é conseguido combinando os pontos fortes da patologia digital com a experiência histológica e também o microanel de tecido automatizado demonstrando o procedimento hoje são Kalin Hamman e Jose Galvan. Duas assistências técnicas do nosso laboratório Usando o software de digitalização. Primeiro, selecione o modo automático para varredura de campo claro.Em seguida, clique nas opções de digitalização para ajustar os parâmetros de qualidade do slide. Agora escolha salvar as digitalizações de slides localmente ou para o acabamento da Web clicando em parâmetros do servidor e defina o destino da digitalização para o centro do caso. Agora, prepare os slides antes de colocá-los no magazine Para o scanner, verifique se os slides estão limpos.Se necessário, limpe-os Com etanol, até 25 lâminas podem ser carregadas em cada magazine e o scanner pode ser carregado com até 10 magazines. Vários carregadores são empilhados quando são carregados. Depois que os slides forem carregados, forneça todos os slides, nomes de arquivos e defina a pasta de salvamento no centro do caso.Agora comece a digitalizar o slide clicando na seta verde. Nesta seção, os locais de onde as amostras de tecido são perfuradas na lâmina são definidos por anotações na lâmina digital. Comece abrindo a pasta de slides digitais.No software de visualização, as alterações podem ser feitas na própria pasta. As notas podem ser adicionadas, os slides podem ser reordenados e os privilégios do usuário podem ser definidos, assim como os anexos. Agora comece a anotar os slides clicando em um.Ele aparecerá no visualizador. No visualizador. Use a ferramenta de ampliação para avaliar o slide e encontrar as áreas de interesse para integração na próxima geração de TMA.Usando a ferramenta de anotação TMA, selecione o tamanho do núcleo desejado e a cor da anotação. Anexe esta anotação a um slide clicando no slide. Em seguida, mova a anotação para as estruturas histológicas desejadas.Essas anotações marcam os locais de punção no bloco de tecido correspondente. Repita esse processo até que todos os slides sejam anotados. Uma opção alternativa para a causa do tecido é enviá-los para um tubo de PCR de 0,2 mililitro para análise molecular.Anote os slides usando uma marca de cor diferente para distinguir esses pontos daqueles que são o TMA. Depois que todas as anotações forem feitas, salve um arquivo de planilha contendo uma lista de todos os slides com suas anotações correspondentes e as cores das anotações. Comece a microrreconstrução tecidual recuperando os blocos de tecido de parafina correspondentes para todas as lâminas digitais anotadas, doravante.Chamado de blocos doadores. Classifique os blocos na mesma ordem dos slides digitais. Verifique se cada bloco tem pelo menos quatro milímetros de espessura.Caso contrário, o tecido precisará ser reinventado no computador. Abra o microarray de tecido do software e forneça um nome para o projeto. Vá para a troca de ferramenta e selecione o diâmetro da ferramenta necessário.Agora carregue até 12 blocos de destinatários na máquina. Anote os nomes dos blocos. Todos eles devem ser rotulados usando o mesmo sistema de numeração para consistência.Em seguida, no software, atribua o nome apropriado a cada um dos blocos para criar um layout TMA. Primeiro, faça um novo design TMA atribuindo o número de linhas, colunas, linhas vazias e espaçamento dos punções. Salve o layout e atribua-o ao bloco.Em seguida, repita o processo para o próximo bloco. Com um novo layout ou o mesmo layout, os tamanhos de macho podem ser variados entre os blocos de recipients. Em seguida, carregue até 60 blocos doadores na máquina.Até 10 blocos cabem em cada linha. A a F. Os blocos doadores restantes serão carregados posteriormente no software. Dê a cada bloco de doadores um nome de identificação.Uma imagem de cada bloco será adquirida automaticamente. Agora alinhe as lâminas digitais com seus blocos doadores correspondentes. Primeiro, selecione um bloco.Em seguida, clique no slide e compare o slide e bloqueie as imagens lado a lado. Selecione pontos de referência na imagem do bloco doador que correspondam a pontos específicos na lâmina digital correspondente. Em seguida, clique em Avançar e as anotações serão movidas para a imagem do bloco doador.Se as anotações estiverem corretas, clique em cada uma para confirmar sua localização. Em seguida, clique em iniciar. Isso solicita que o microarray faça um furo no ponto de referência no bloco receptor e, em seguida, faça um furo do bloco doador no mesmo local e transfira o núcleo para o bloco receptor.Para coletar núcleos para um tubo de PCR, clique na ferramenta de PCR para o bloco. Até quatro anotações podem ser usadas para fornecer tecido ao tubo. Uma vez definidos, clique em iniciar e o doador será chamado e o tubo carregado.Depois que a máquina perfura e perfura, os núcleos, atualiza a imagem do bloco doador. Prossiga repetindo o alinhamento e a anotação para o próximo bloco. Em seguida, centralize-o.Continue fazendo isso para cada bloco doador. Isso estará no TMA. Quando o primeiro conjunto de 60 blocos doadores estiver concluído, descarregue-os e carregue mais 60 blocos.Continue o processo até que todos os blocos doadores estejam dispostos. Depois de tirar cerca de 500 núcleos, limpe a broca e a ferramenta de perfuração será removida. Quando as matrizes estiverem concluídas, exporte o projeto.Um arquivo de planilha com os dados do projeto estará na pasta de exportação. Ele mostra a localização de cada amostra dentro de cada bloco TMA. Em seguida, salve as imagens do bloco doador com anotações sobrepostas como arquivos JPEG na pasta de exportação.Isso conclui o processo de geração do bloco TMA. Este layout TMA mostra seis blocos NG TMA que foram construídos em duas cópias para 12 blocos finais para preencher a matriz. Cada bloco tumoral continha 402 manchas de tecido e cada bloco de tecido normal continha 268 manchas.Depois que 60 blocos de doadores foram anotados, a causa foi perfurada. O tempo de transferência do núcleo foi de aproximadamente 12 segundos. A perda de núcleo foi mínima e o tempo total para uma matriz, este projeto foi de cerca de 24 horas.Isso incluiu o tempo necessário para perfurar a causa para análise molecular subsequente após o processo de N-G-T-M-A. Outros métodos como imunohistoquímica em citohibridização e até mesmo colorações especiais podem ser aplicados a esses microarrays de tecido, a fim de responder a algumas perguntas como quais genes ou proteínas são expressos ou mesmo alterados em diferentes tecidos.

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