2.15: Clonagem Molecular

A clonagem molecular é um conjunto de técnicas usadas para inserir DNA recombinante de uma fonte procariótica ou eucariótica em um veículo replicante, como plasmídeos ou vetores virais. A clonagem refere-se a fazer várias cópias de um fragmento de DNA de interesse, como um gene. Neste vídeo, você aprenderá sobre as diferentes etapas da clonagem molecular, como configurar o procedimento e as diferentes aplicações dessa técnica.

Pelo menos duas moléculas de DNA importantes são necessárias antes do início da clonagem. Primeiro, e mais importante, você precisa do fragmento de DNA que vai clonar, também conhecido como inserção. Pode vir de um procarioto, eucarioto, um organismo extinto ou pode ser criado artificialmente em laboratório. Usando a clonagem molecular, podemos aprender mais sobre a função de um gene específico.

Em segundo lugar, você precisa de um vetor. Um vetor é o DNA plasmidial usado como uma ferramenta em biologia molecular para fazer mais cópias ou produzir uma proteína a partir de um determinado gene. Os plasmídeos são um exemplo de vetor e são DNA circular, extra cromossômico, que é replicado por bactérias.

Um plasmídeo normalmente tem um local de clonagem múltipla ou MCS, esta área contém locais de reconhecimento para diferentes endonucleases de restrição, também conhecidas como enzimas de restrição. Diferentes inserções podem ser incorporadas ao plasmídeo por uma técnica chamada ligação. O vetor plasmídico também contém uma origem de replicação, o que permite que ele seja replicado em bactérias. Além disso, o plasmídeo possui um gene antibiótico. Se a bactéria incorporar o plasmídeo, ele sobreviverá em meios que contenham o antibiótico. Isso permite a seleção de bactérias que foram transformadas com sucesso.

A inserção e o vetor são clonados em um organismo de célula hospedeira, o mais comum usado na clonagem molecular é E. coli. E. coli cresce rapidamente, está amplamente disponível e tem vários vetores de clonagem diferentes produzidos comercialmente. Eucariotos, como leveduras, também podem ser usados como organismos hospedeiros para vetores.

O primeiro passo do procedimento geral de clonagem molecular é obter a inserção desejada, que pode ser derivada de DNA ou mRNA de qualquer tipo de célula. O vetor ideal e seu organismo hospedeiro são então escolhidos com base no tipo de inserção e no que será feito com ele. Uma reação em cadeia da polimerase, ou método baseado em PCR, é frequentemente usado para replicar a inserção.

Então, usando uma série de reações enzimáticas, a inserção e o digestor são unidos e introduzidos no organismo hospedeiro para replicação em massa. Os vetores replicados são purificados de bactérias e, após a digestão por restrição, analisados em um gel. Fragmentos purificados em gel são posteriormente enviados para sequenciamento para verificar se a inserção é o fragmento de DNA desejado.

Vamos dar uma olhada um pouco mais detalhada em como a clonagem molecular é conduzida. Antes de começar, você deve planejar sua estratégia de clonagem, antes de fazer qualquer tentativa de clonagem no banco. Por exemplo, qualquer vetor de plasmídeo fornecerá um número finito de locais de restrição para incorporar a inserção por meio do local de clonagem múltipla. Você precisará escolher locais de restrição que não são encontrados em sua inserção para que você não a separe. Você pode ficar com uma situação em que é forçado a juntar um fragmento de extremidade romba com um que tem uma saliência. Nesse caso, usar o fragmento de klenow para configurar uma ligação de extremidade romba pode ser sua única opção para obter a inserção no vetor desejado. Compreender as várias ferramentas de clonagem molecular à sua disposição, bem como criar uma estratégia cuidadosa antes de começar a clonar, pode economizar muito tempo.

A fonte de DNA para clonagem molecular pode ser isolada de quase qualquer tipo de amostra de célula ou tecido por meio de técnicas simples de extração. Uma vez isolado, o PCR pode ser usado para amplificar o inserto.

Uma vez que a inserção é amplificada, ela e o vetor são digeridos por enzimas de restrição, também conhecidas como endonucleases de restrição.

Uma vez digeridos, a inserção e o vetor podem ser executados em um gel e purificados por um processo chamado purificação em gel. Com relação ao vetor, esta etapa ajudará a purificar o plasmídeo linearizado do plasmídeo não cortado, que tende a aparecer como um esfregaço de alto peso molecular em um gel.

Após a purificação dos digestos em gel, a inserção é ligada ou unida ao plasmídeo, por meio de uma enzima chamada DNA ligase.

De um modo geral, é sempre uma boa ideia configurar ligas, de modo que a proporção de inserção para vetor seja de 3 para 1, o que garante que apenas uma pequena quantidade de vetor se autoliga. Uma vez que a ligadura tenha sido montada no gelo, ela é incubada em qualquer lugar de 14 a 25? C de 1 hora a pernoite.

Em seguida, a transformação é realizada para introduzir o vetor plasmídeo no hospedeiro que irá replicá-lo.

Após a transformação, as bactérias são semeadas em placas de ágar com antibiótico e incubadas durante a noite a 37 ° C. Como o plasimídeo contém um gene de resistência a antibióticos, a transformação bem-sucedida produzirá colônias bacterianas quando cultivadas em placas de ágar na presença de antibióticos. As colônias individuais podem então ser colhidas da placa transformada, colocadas em meio de crescimento líquido em tubos numerados e colocadas em uma incubadora agitada para expansão. Um pequeno volume de cultura líquida é adicionado a uma placa de ágar numerada, enquanto o restante da cultura segue para a purificação do plasmídeo. O esquema de numeração que denota a identidade das colônias bacterianas das quais os plasmídeos serão eventualmente purificados é mantido durante todo o processo de purificação do plasmídeo.

Uma amostra de plasmídeo purificado é então cortada com enzimas de restrição. O digesto é então carregado e executado no gel para verificar a presença de inserto, o que verificará se a colônia bacteriana foi transformada com um plasmídeo contendo um inserto e não um plasmídeo autoligado. As bactérias verificadas como tendo sido transformadas com um plasmídeo contendo inserto são expandidas para posterior purificação do plasmídeo. O sequenciamento é usado como uma etapa final de verificação para confirmar que seu gene de interesse foi clonado.

A clonagem molecular pode ser usada para um número quase ilimitado de aplicações. Por exemplo, quando um modelo de mRNA é transcrito reversamente para formar cDNA, ou DNA complementar, por uma enzima chamada transcriptase reversa e, em seguida, a PCR é usada para amplificar o cDNA, a clonagem molecular pode ser usada para criar uma biblioteca de cDNA? uma biblioteca de todos os genes expressos por um determinado tipo de célula.

A clonagem molecular também pode ser empregada para pegar uma série de genes, ou agrupamento de genes de uma cepa bacteriana, reorganizá-los em plasmídeos que são transformados em outra cepa, de modo que toda uma via biossintética possa ser recriada para produzir uma molécula complexa.

Por meio da clonagem molecular, uma biblioteca mutante pode ser gerada expressando um plasmídeo alvo em uma cepa bacteriana especial que usa uma polimerase propensa a erros quando cultivada em certas temperaturas. As mutações podem ser caracterizadas por sequenciamento. As bactérias transformadas com genes mutantes podem então ser testadas com diferentes medicamentos ou produtos químicos para ver quais colônias bacterianas evoluíram para ter resistência aos medicamentos.

Graças à clonagem molecular, os genes repórteres podem ser incorporados aos plasmídeos de DNA, um gene repórter comum é a proteína fluorescente verde ou GFP, que emite uma fluorescência verde quando exposta à luz ultravioleta. Um gene repórter também pode ser inserido em um alfavírus para mostrar infecção em mosquitos e transmissibilidade nas células.

Você acabou de assistir ao vídeo do JoVE sobre clonagem molecular. Agora você deve entender como funciona a clonagem molecular e como a técnica pode ser usada em biologia molecular. Como sempre, obrigado por assistir!