Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar as células TH 17 dos quatro linfócitos T positivos para CD virgens. Isso é feito pela primeira coleta dos gânglios linfáticos e do baço de um camundongo adulto C 57 preto seis. Na segunda etapa, os tecidos são moídos para obter uma única suspensão celular.

As quatro células T CD 25 negativas positivas são então isoladas e cultivadas sob condições de indução ou controle de ativação de TH 17. Em última análise, Q-P-C-R-E-I-S-A e citometria de fluxo podem ser usados para avaliar a expressão de IL 17 A. Portanto, este método pode fornecer informações sobre a diferenciação de linfócitos T CD quatro em células T oito 17 em camundongos C 57 pretos seis.

Também pode ser aplicado a outros modelos de mouse. A demonstração desse método é crítica, pois os linfonodos são muito pequenos, dificultando as etapas de dissecção. Sem visualização direta deste método, pelo menos quatro horas antes de adicionar as células revestem os poços de uma nova placa de cultura de tecidos de micro teste UBO de 96 poços com 30 microlitros de anti CD três diluídos em PBS estéril batem nas laterais da placa para garantir uma cobertura uniforme dos poços e, em seguida, incubam a placa a 37 graus Celsius após quatro horas, Leve a placa à geladeira até a hora de adicionar as células.

Após confirmar a morte por luxação cervical, esterilizar a área de incisão em um camundongo adulto C 57 preto seis com etanol 70%. Em seguida, pegue a pele anterior à abertura uretral e corte da linha média ventral até a região do queixo, tomando cuidado para não perturbar o peritônio. Em seguida, prenda a pele para permitir o acesso aos gânglios linfáticos e ao baço para remoção.

Agora remova os gânglios linfáticos axilares encontrados perto da axila do camundongo atrás dos músculos peitorais e coloque o tecido em uma placa de Petri contendo cinco mililitros de tampão de corrida AutoMax. Em seguida, remova os gânglios linfáticos braquiais localizados no tecido conjuntivo próximo a cada axila. Em seguida, remova os linfonodos cervicais superficiais encontrados no pescoço do animal, flanqueando a traqueia e, em seguida, remova os linfonodos inguinais localizados na região do quadril na conjunção dos três vasos sanguíneos.

Para acessar os linfonodos mesentéricos, primeiro corte a linha média ventral através do revestimento peritoneal. Os gânglios linfáticos mesentéricos estão localizados profundamente dentro do mesentério do camundongo, geralmente em um colar de quatro a oito nódulos que podem aparecer como um colar de pérolas. Remova o baço puxando-o e destacando-o do pâncreas.

Em seguida, coloque-o na placa de Petri com os gânglios linfáticos para triturar os órgãos. Coloque os gânglios linfáticos no lado fosco de uma lâmina de microscópio e, em seguida, esfregue os tecidos com o lado fosco de uma segunda lâmina. Para filtrar os órgãos fundamentais em uma suspensão de célula única, primeiro dobre um pedaço de cerca de três polegadas por três polegadas de material de náilon de 40 mícrons várias vezes e coloque-o no topo de um tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Use uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 21 para aspirar as células e o tampão e, em seguida, dispense a solução celular lentamente no náilon dobrado. Tomando cuidado para não perfurar o material com a agulha. Uma vez que uma única suspensão celular tenha sido alcançada, a solução deve parecer consistente, sem pedaços visíveis de tecido sólido.

Coloque esta solução no gelo. Depois de classificar as células por separação AutoMax para uma pureza celular negativa de pelo menos 80% CD, quatro CDs positivos e 25. Conte as células por exclusão de azul trian e, em seguida, dilua a suspensão celular para uma vez 10 elevado a seis células por mililitro em meio de cultura de células.

Agora enxágue todos os poços da placa anti-CD três revestidas com 200 microlitros de PBS. Cada um descartando a lavagem em um recipiente de lixo. Em seguida, adicione 100 microlitros do coquetel indutor de TH 17 ou misturas de controle de ativação aos poços apropriados em triplicata.

Finalmente, adicione 100 microlitros de células a cada poço e incube as células por pelo menos 72 horas ou até cinco dias para obter a diferenciação de células TH 17 para Eli SA e QPCR. Após o período de incubação, agrupar os triplicados de cada amostra em tubos einor individuais. Depois de girar as células, transfira o sobrenadante para tubos einor separados e armazene a menos 20 graus Celsius para medir posteriormente a produção de IL 17 A por ELI.

A.To preparar para QPCR após remover o sobrenadante ressuspende, os pellets restantes em 175 microlitros, tampão de lise de RNA para extração imediata de RNA ou armazenar a menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para iniciar o procedimento após o período de incubação. Em preparação para a ativação celular antes da IL 17, um pool de coloração intracelular cada uma das células indutoras ou de controle de ativação de TH 17 triplica em poços individuais de uma placa de cultura de células de 24 poços. Adicione 400 microlitros de meio de cultura de células a cada poço.

Para elevar o volume total para um mililitro, adicione o íon PMA micina e felden A a cada poço e incube as células por quatro horas a 37 graus Celsius para detectar a presença de IL 17 A por coloração intracelular e citometria de fluxo. Primeiro, transfira as células de cada poço da placa de 24 poços para um tubo einor separado. Em seguida, gire os tubos.

Remova os sobrenadantes e ressuspenda os pellets de células em 200 microlitros de tampão de fax. Transfira as células ressuspensas para uma placa de citometria de fluxo de 96 poços e gire as células novamente após lavar os pellets em 200 microlitros de tampão de fax, ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão de fax e adicione 100 microlitros da mistura de coloração de anticorpos extracelulares. Incube por 15 minutos em temperatura ambiente, longe da luz.

Depois de lavar as células duas vezes, incube os pellets em 100 microlitros de citocitose BD. Fixe o tampão cyto perm coberto com papel alumínio por 20 minutos em temperatura ambiente. Agora lave as células duas vezes em 100 microlitros de um tampão de lavagem X BD perm e, em seguida, incube as células em 50 microlitros de mistura de anticorpos intracelulares coberta com papel alumínio por 15 minutos em temperatura ambiente.

Depois de lavar as células novamente, suspenda as células em 200 microlitros de tampão de coloração BD e, em seguida, transfira as células para tubos de citometria de fluxo contendo 200 microlitros do tampão de coloração. Armazene os tubos a quatro graus Celsius até que estejam prontos para serem lidos para análise por citometria de fluxo da primeira porta das amostras na população de células vivas. Em seguida, use a população de células vivas para bloquear a população CD quatro positiva CD oito negativa.

Finalmente, a partir da marcha da população CD quatro positiva oito negativa na população IL 17 A positiva para diferenciar as células TH 17, as células não fracionadas do linfonodo e do baço devem ser enriquecidas para a população de células T CD quatro positivas CD 25 negativas. Nesta figura, são mostradas células linfonodal agrupadas não fracionadas, citos SP e frações de células TT separadas AutoMax coradas com anti CD quatro e anti CD 25. Este primeiro gráfico de dispersão mostra um perfil representativo da porcentagem de linfócitos CD quatro positivos, CD 25 positivos e CD quatro positivos CD 25 negativos presentes nos linfonodos agrupados não fracionados e nas células do baço.

O procedimento de isolamento também fornece uma população de três CDs quatro CDs positivos e 25 positivos que pode ser usada em experimentos adicionais. Neste gráfico de dispersão final, é mostrado o enriquecimento celular desejado com uma população de 84% CD quatro células T positivas e 25 negativas. Esta população enriquecida de quatro células T positivas para CD 25 ajuda a garantir uma diferenciação TH 17 mais bem-sucedida, conforme ilustrado nesta figura.

Enquanto a incubação de quatro linfócitos T CDs positivos para CD 25 negativos com anti CD três e anti CD 28 por cinco dias produz linfócitos T positivos para CD 25, a incubação sob condições indutoras de TH 17 produz um subconjunto de IL 17 produzindo CD quatro linfócitos positivos para CD 25 positivos. O status de diferenciação de TH 17 pode ser avaliado por meio de PCR quantitativo e Elis A, aqui os dados de CD enriquecido quatro linfócitos T positivos para CD 25 negativos incubados sob controle ou condições indutoras de TH 17 são mostrados CD quatro positivos. Os linfócitos T CD25 negativos incubados em condições TH 17 regulam positivamente a IL 17 A, o que pode ser verificado por meio de QPCR e ELI SA. O fator de transcrição específico TH 17 ROAR gama T também é regulado positivamente por CD quatro células T positivas CD 25 negativas incubadas sob condições indutoras de TH 17, como pode ser medido por QPCR.

Ao participar deste procedimento, é importante lembrar de atingir pelo menos uma pureza celular de 80% CD quatro positivas CD 25 negativas antes de incubar as células sob condições indutoras de TH 17. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar linfonodos e baços de camundongos C 57 black six, como incubar células sob T oito 17 ou condições de controle de ativação e como avaliar a diferenciação de linfócitos T CDs quatro virgens em células T oito 17 Sul.