Name: Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas em linfócitos T convencionais e antigênico-específicos usando sistema OP9-DL1 e camundongos deficientes em rag. Este método viabiliza imunoterapia antitumoral personalizada.

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Agradecemos ao Dr. Shinya Yamanaka (Universidade de Kyoto) para a prestação de iPS-MEF-Ng-20D-17 linha celular, Dr. Dario Vignali (Hospital St. Jude Children Research) para apoiar a OT1-2A • pMig II construção, Dr. Juan Carlos Zuniga-Pflucker (Departamento de Imunologia da Universidade de Toronto) para apoiar a linha celular OP9-DL1, e Dr. Kent E Vrana (Departamento de Farmacologia, da Universidade Penn State College of Medicine) para ajudar o projeto deste estudo. Este projecto é financiado, em bolsas com o número de Grant K18CA151798 do Instituto Nacional do Câncer, o Trust Barsumian eo Melanoma Research Foundation (Song J.).

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<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Seki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7%2FSTAT5+cytokine+signaling+pathway+is+essential+but+insufficient+for+maintenance+of+naive+CD4+T+cell+survival+in+peripheral+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs.</a> J. Immunol. 178, 262-270 (2007).</li>
<li>Stemberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+can+develop+into+diverse+effector+and+memory+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets.</a> Immunity. 27, 985-997 (2007).</li>
<li>Siewert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+development%3A+effector%2Fmemory-like+alphaE%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells+originate+from+both+naive+T+cells+and+naturally+occurring+naive-like+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells.</a> J. Immunol. 180, 146-155 (2008).</li>
<li>Wang, L. X., Plautz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed%2C+in+vitro-activated+CD4%2B+effector+T+cells+establish+long-term+memory+without+exogenous+cytokine+support+or+ongoing+antigen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure.</a> J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).</li>
<li>Hinrichs, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117, 808-814 (2011).</li>
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<li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).</li>
<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+tumor-specific+T+cells+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling.</a> Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).</li>
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<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+generation+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells+for+combined+gene+and+cell+therapy+of+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am.+Soc.+Hematol.+Educ.+Program%22%5BJournal%5D)">Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).</li>
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<li>Himburg, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat. Med. 16, 475-482 (2010).</li>
<li>Tanigaki, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lymphocyte+development+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of lymphocyte development by Notch signaling.</a> Nature immunology. 8, 451-456 (2007).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474, 212-215 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<html> Para ACT-terapias baseadas, o em geração in vitro de um grande número de altamente reactivos Ag-específicos de células T in vivo para re-infusão é uma abordagem ideal. Embora o nosso método in vitro dá origem de células T funcionais a partir de células iPS, um grande número de iPS células derivadas de células morrem em quatro semanas, especialmente na quarta semana. Concluímos que os sinais de sobrevivência a partir do entalhe de sinalização mediada pelo DL1, bem como a IL-7 e F...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Camundongos C57BL/6J </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 000664 </td></tr><tr><td> B6.129S7-RAG1 tm1Mom / J </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 002216 </td></tr><tr><td> Anticorpo anti-CD3 (2C11) </td><td> BD PharMingen </td><td> 553058 </td></tr><tr><td> Anti-CD28 anticorpo (37,51) </td><td> BD PharMingen </td><td> 553295 </td></tr><tr><td> Anticorpo anti-CD3 (17A2) </td><td> BioLegend </td><td> 100202 </td></tr><tr><td> Anti-CD4 (GK1.5) anticorpo </td><td> BioLegend </td><td> 100417 </td></tr><tr><td> Anti-CD8 (53-6,7) anticorpo </td><td> BioLegend </td><td> 100714 </td></tr><tr><td> Anti-CD25 anticorpo (3C7) </td><td> BioLegend </td><td> 101912 </td></tr><tr><td> Umti-CD44 anticorpo (1M7) </td><td> BioLegend </td><td> 103012 </td></tr><tr><td> Anti-CD117 anticorpo (2B8) </td><td> BioLegend </td><td> 105812 </td></tr><tr><td> Anti-TCR β-(H57597) anticorpo </td><td> BioLegend </td><td> 109220 </td></tr><tr><td> Anti-IL-2 (JES6-5H4) anticorpo </td><td> BioLegend </td><td> 503810 </td></tr><tr><td> Anti-IFN-γ anticorpo (XMG1.2) </td><td> BioLegend </td><td> 505822 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> A10490-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3007.01 </td></tr><tr><td> A Brefeldin </td><td> Sigma </td><td> B7651 </td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689 </td></tr><tr><td> GeneJammer </td><td> Ciências Integradas </td><td> 204130 </td></tr><tr><td> RNA kit &lt;/ Td&gt; <td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> DNA kit </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> CD8 estojo de isolamento </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-095-236 </td></tr><tr><td> Tampão de lise ACK </td><td> Lonza </td><td> 10-548E </td></tr><tr><td> mFlt-3L </td><td> PeproTech </td><td> 250-31L </td></tr><tr><td> mIL-7 </td><td> PeproTech </td><td> 217-17 </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td></tr><tr><td> FITC-anti-OVA anticorpo </td><td> Immunochemicals Rockland </td><td> 200-4233 </td></tr><tr><td> Tampão de permeabilização </td><td> Biolegend </td><td> 421002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td></tr><tr><td> Formaldeído </td><td> Sigma </td><td> F8775 </td></tr><tr><td> 0,4 mM de filtro </td><td> Millipore </td><td></td></tr><tr><td&gt; Sorter celular Moflo </td><td> Cytomation Dake </td><td></td></tr><tr><td> Calibur citômetro de fluxo </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> LSR citômetro de fluxo II </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Rato limitador </td><td> Braintree Científico </td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação de células dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de linfócitos t

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Transferência adoptiva de células (ACT) de linfócitos-antigénio específico CD8 + T citotóxicos (CTLs) é um promissor no tratamento de uma variedade de doenças malignas 1. CTLs podem reconhecer as células malignas, interagindo antigénios tumorais com os receptores de células T (TCR), e citotoxinas de libertação, bem como as citocinas para matar as células malignas. Sabe-se que menos diferenciadas e central-memória (denominado como altamente reactivo) CTLs são a população óptima para ACT-baseado em imunoterapia, porque estes CTLs têm um elevado potencial proliferativo, são menos propensas a apoptose de células mais diferenciadas e têm uma maior capacidade de responder às citocinas homeostáticos 2-7. No entanto, devido a dificuldades na obtenção de um elevado número de CTLs tais partir de pacientes, há uma necessidade urgente de encontrar uma nova abordagem para gerar altamente reactivos Ag-CTLs específicos para o êxito ACT-terapias baseadas. TCR transdução do caule auto-renovávelAs células para a reconstituição imunológica tem um potencial terapêutico para o tratamento de doenças 8-10. No entanto, a abordagem para obter células-tronco embrionárias (CES) de pacientes não é viável. Embora a utilização de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) para fins terapêuticos tem sido amplamente aplicada na clínica 11-13, HSCs ter reduzido a diferenciação e capacidades proliferativas, e HSCs são difíceis de expandir-se em cultura de células in vitro 14-16. Tecnologia de célula iPS recente eo desenvolvimento de um sistema in vitro para a entrega do gene são capazes de gerar células iPS de pacientes sem qualquer abordagem cirúrgica. Além disso, como os CES, as células iPS possuem capacidade proliferativa indefinido in vitro, e têm sido mostrados para se diferenciarem em células hematopoiéticas. Assim, as células iPS têm um maior potencial para ser usado em ACT-baseado em imunoterapia em comparação com os CES ou HSCs. Aqui, nós apresentamos métodos para a geração de linfócito Tcitos de iPS células in vitro, e em programação in vivo de antigénios específicos de CTLs de iPS células para promover a vigilância do cancro imune. Estimulação in vitro com um ligando Notch impulsiona a diferenciação das células T a partir de células iPS, e os resultados de genes de TCR de transdução em células iPS diferenciar em específicas de antigénio de células T in vivo, o que impede o crescimento do tumor. Assim, demonstramos antigénio-específica diferenciação de células T a partir de células iPS. Os nossos estudos proporcionam uma abordagem potencialmente mais eficiente para a geração de antigénio-CTLs específicos para o ACT terapias baseadas e facilitar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças.

Geração de linfócitos T de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células dá uma abordagem alternativa de utilização de células-tronco embrionárias para T imunoterapia baseada em células. O método mostra que, utilizando quer<em&gt; In vitro</em&gt; Ou<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema de indução, as células iPS são capazes de se diferenciar em linfócitos T convencionais e antigénio-específica.

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

A transferência adotiva de células (ACT) de linfócitos T citotóxicos (CTLs) CD8+ antígeno-específicos é um tratamento promissor para diversas neoplasias malignas 1. Os CTLs podem ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar e caracterizar linfócitos T a partir de células-tronco pluripotentes induzidas ou células IPS. As células IPS podem então ser diferenciadas in vitro em um sistema de cultura OP9-DL1 e posteriormente amadurecidas in vivo em um camundongo deficiente para rag. Alternativamente, as células podem ser geneticamente modificadas para superexpressar o TCR OT-I e então transferidas adotivamente para desenvolvimento in vivo.Após seis semanas de diferenciação in vivo, os camundongos podem ser desafiados por injeção intraperitoneal com sete células tumorais EEG e, em seguida, a especificidade antigênica das células T derivadas de IPS pode ser avaliada. Em última análise, as células IPS podem se diferenciar em células T convencionais e específicas para antígenos, sendo estas últimas capazes de proteger os animais contra o desafio tumoral. As implicações dessa técnica estendem-se para a imunoterapia contra o câncer individualizada.O método permite a geração de grande quantidade de linfócitos T reativos a tumores a partir de uma quantidade mínima de sangue ou tecido cutâneo do paciente. No dia zero, transfira cinco vezes 10 à quarta potência de células IPS para uma placa de cultura de 100 milímetros contendo uma monocamada confluente de células OP9-DL1 em meio alfa MEM com 20% de FBS. No dia cinco, faça a tripsinização. Em seguida, centrifugue as células após incubá-las em uma placa de cultura fresca de 100 milímetros por 30 minutos em incubadora a 37 graus Celsius. Plaque cinco vezes 10 à quinta potência das células em suspensão em meio alfa MEM com 20% de FBS e ligante de FLT3 murino em uma nova placa de cultura de 100 milímetros contendo uma monocamada de células OP9-DL1. No dia oito, pipete suavemente para baixo as células fracamente aderidas, centrifugue as células e, em seguida, transfira-as para um único poço de uma placa de cultura de seis poços revestida com células OP9-DL1 confluente. Incube as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por mais duas semanas. No dia 22.Incube as células IPS destacadas em meio fresco em uma nova placa de cultura a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, remova cerca de metade das células em suspensão e passe-as por uma peneira de náilon de 70 mícrons para excluir agregados celulares e lave a suspensão resultante de células isoladas três vezes com PBS frio. Após a terceira lavagem, re-suspenda as células em PBS a 1,5 vezes 10 elevado à sétima células por mililitro e mantenha as células em gelo antes da injeção IV.Coloque um camundongo deficiente em rag com quatro semanas de idade sob uma luz infravermelha para dilatar a veia da cauda. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de 26 e meia polegadas com 200 microlitros da suspensão celular e transfira adotivamente as células através da veia da cauda dilatada. Três semanas depois, após confirmar a eutanásia do camundongo que recebeu a transferência adotiva, remova os linfonodos e o baço após a desagregação mecânica dos tecidos.Lise a suspensão de células isoladas com um tampão de lise CK e, em seguida, lave os mononucleócitos resultantes duas vezes em PBS frio. Após a coloração para marcadores de superfície celular, avalie as células por análise citométrica de fluxo no dia zero; no dia um, utilize o reagente de transfeção JAMA para transfectar células empacotadoras platE previamente semeadas durante a noite com um OT one MIDR; no dia dois, semeie um vezes 10 à sexta potência de células IPS em um poço de uma placa de 24 poços pré-revestida com gelatina a 0,1%, colete o pseudovírus contendo S natin das células platE e, em seguida, filtre-o através de um filtro de 0,4 mícron para excluir possíveis contaminantes após a centrifugação. Transduza as células na presença de polibrena por uma hora a 330 vezes G a 32 graus Celsius.Incube-os durante a noite à mesma temperatura após repetir o procedimento de transdução. No quarto dia, trypsinize os olhos nas células IPS transduzidas e, em seguida, após a centrifugação, ressuspenda as células em meio fresco e semeie-as em células alimentadoras pré-codificadas e irradiadas snl 7 6 7. Assim que as células transduzidas atingirem confluência, selecione as células duplamente positivas para GFP e DS red por citometria de fluxo.Seis semanas após a transferência adotiva das células IPS, injete 50 microlitros de células EEG sete thoma na cavidade peritoneal do mesmo camundongo no dia 50 do desafio tumoral. Utilize um kit de isolamento de células T CD oito positivas da Mil E Biotech para separar células T CD oito positivas do baço e dos linfonodos do animal que recebeu a transferência adotiva. Misture as células T CD oito positivas isoladas com esplenócitos irradiados de um camundongo C 57 black six J ingênuo numa proporção de um para 10 e estimule a co-cultura com 0,5 micromols por mil de ova durante 40 horas.Posteriormente, adicione o felden A às células por mais quatro horas. Por fim, avalie as populações celulares por análise citométrica de fluxo após o isolamento de células SP de um camundongo C57BL/6J ingênuo. Divida a suspensão celular em dois grupos.Rotule o grupo CFSE alto com cinco micromols por mililitro de CFSE e estimule as células com 10 microgramas por mililitro de peptídeo ova por uma hora; rotule o grupo CFSE baixo com 0,5 MICROMOL por mililitro de CFSE e não realize a estimulação. Misture 2,5 vezes 10 à sexta potência das células CFSE alta com 2,5 vezes 10 à sexta potência das células CFSE baixa em PBS. Em seguida, analise as células por citometria de fluxo quanto à expressão de CFSE.16 horas após a transferência adotiva para o camundongo de interesse, conte as células tumorais intraperitoneais no dia 20 do desafio tumoral. Utilize uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de 18 e meia polegadas e PBS frio para lavar a cavidade peritoneal. Conte as células tumorais recuperadas para identificar as células infiltrantes tumorais.Remova o tumor em um estágio avançado do desafio tumoral e, em seguida, corte o tumor em três pedaços. Coloque o primeiro pedaço do tumor em um tubo criogênico e posicione o tubo sobre gelo seco. Fixe imediatamente o segundo pedaço em formaldeído.Preserve o terceiro fragmento em meio RPMI 1640 condicionado após secar ao ar as seções de tecido criopreservadas. Fixe-as em acetona fria por 15 minutos após secar ao ar as seções fixadas por mais 15 minutos. Lave as lâminas por cinco minutos em PBS após a lavagem.Coloque as lâminas em uma câmara úmida e cubra as seções de tecido com 30 microlitros de 3% B, SA e PBS durante 30 minutos para bloquear a ligação não específica. Em seguida, remova o tampão de bloqueio por aspiração e incube as seções de tecido com uma mistura de 50 microlitros de anticorpo pe anti-TCR RV alfa dois e anticorpo fitzy anti-ova, diluídos em 3% PSA em PBS, na câmara úmida por duas horas. Ao final da incubação, lave as lâminas três vezes em PBS frio e, por fim, monte as seções com um meio de montagem à base de água antes da análise por microscopia fluorescente para exame citométrico de fluxo de linfócitos T infiltrantes no tumor.Esmague o tumor para obter uma suspensão de células únicas. Em seguida, analise as células quanto a marcadores superficiais específicos. C CD três e TCR beta são utilizados como marcadores de células T para determinar se a estimulação de células IPS com o ligante Notch DL um poderia contribuir para a expressão na superfície celular de CD quatro e CD oito em células derivadas de células IPS positivas para CD três e TCR beta positivas.Observe o gráfico de dispersão à direita, que mostra células T positivas para CD3, positivas para TCRβ, negativas para CD4 e positivas para CD8, geradas a partir de células IPS in vitro no dia 22. Além disso, as células únicas positivas derivadas de células IPS da figura anterior produziram interleucina-2 e interferon gama quando estimuladas in vitro por anticorpos anti-CD3 revestidos em placa e anticorpos anti-CD28 solúveis, confirmando que as células T derivadas de células IPS são funcionais após transferência adotiva em camundongos receptores. A maioria das células IPS transduzidas com o gene do TCR sofreu diferenciação em linfócitos T citotóxicos positivos para CD8, que responderam in vitro à estimulação com peptídeos por meio da secreção de interleucina-2 e interferon gama nestes gráficos de dispersão obtidos de células linfonodais e esplênicas agrupadas.Células T CD8 positivas Vβ5 positivas foram geradas em camundongos que receberam células IPS transduzidas com TCR, mas não em camundongos que receberam células IPS transduzidas controle. As populações CD8 positivas Vβ5 positivas foram positivas para coloração intracelular de citocinas, demonstrando produção de interleucina-2 e interferon-gama, representadas nestes histogramas pelas linhas escuras, em comparação com os histogramas de controle de isotipo sombreados, indicando que os CTLs derivados de IPS eram funcionais. Esses dados mostram que células CFSE altas pulsadas com epítopo, representadas pelos picos à direita em cada gráfico, e células controle CFSE baixas, representadas pelos picos à esquerda, foram injetadas em camundongos 10 semanas após a transferência de células IPS ou um dia após a transferência de CTLs OVA-específicos.Os CTLs derivados de IPS específicos para o antígeno responderam à estimulação com antígeno e apresentaram atividade citotóxica, conforme indicado pela ausência de células CFSE altas aqui. Células IPS transduzidas com o gene do TCR OT-I foram transferidas adotivamente para camundongos C57BL/6 e, em seguida, os animais foram desafiados com células tumorais OVA7 na vigésima-feira; as células tumorais na cavidade peritoneal foram enumeradas. Observe a redução significativa no número de células tumorais em camundongos que receberam IPS transduzidas com TCR em comparação com os grupos-controle.Acima de tudo, a transferência adotiva de células IPS TRANSDUZIDAS com TCR induziu a infiltração de CTLs hiperreativos nos tecidos tumorais e protegeu os animais do desafio tumoral, conforme observado nesta coloração de h e e de tecidos tumorais recuperados entre os dias 30 e 35 após o desafio tumoral, provenientes de camundongos que receberam transferência adotiva de células transduzidas com TCR ou CTLs OT um, mas não de animais injetados com controle simulado ou controle. As células transduzidas foram infiltradas por células inflamatórias, conforme indicado pelas setas vermelhas aqui. CTLs V alfa dois positivos específicos para ova, em vermelho, foram encontrados infiltrando tecidos tumorais que expressam ova, em verde.Embora os tumores em camundongos dos grupos controle tivessem poucas ou nenhuma célula infiltrante tumoral nesta figura, suspensões de células individuais provenientes de tecidos tumorais foram analisadas quanto à expressão da positividade para V alfa dois e positividade para V beta cinco por citometria de fluxo após seleção da população positiva para CD oito. Observe que os tecidos tumorais de camundongos que receberam transferência adotiva de células IPS transduzidas com TCR exibiram o maior nível de células infiltrantes tumorais, enquanto os tumores de camundongos que receberam IPS transduzidas controle não apresentaram infiltração por linfócitos T positivos para CD oito e específicos para ova.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar linfócitos T específicos para antígenos a partir de células IPS e como avaliar as funções dos linfócitos T derivados de IPS.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O vídeo demonstra um ensaio usando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) Essas células T, projetadas com receptores específicos do HBV, são transferidas para camundongos transgênicos. Os plasmídeos do genoma do HBV competentes para replicação são então injetados diretamente no fígado, permitindo a captação do DNA viral. Uma vez que os antígenos virais são expressos e apresentados por moléculas híbridas de MHC-I, as células T modificadas reconhecem e se ligam a esses...

Suprimindo a replicação do vírus da hepatite B usando células T específicas do antígeno viral

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno tumoral (iPSC) derivadas de células-tronco pluripotentes (iPSC) derivadas de células T CD8αβ+. As iPSCs específicas do antígeno tumoral são cultivadas em uma monocamada de células estromais e diferenciadas em células progenitoras hematopoiéticas (HPCs). Os HPCs são diferenciados em células T CD4 + CD8 + duplamente positivas usando um meio de diferenciação. Essas células são então estimuladas a gerar...

Geração de células T CD8 positivas únicas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas

As células-tronco embrionárias de camundongos podem ser diferenciadas em células T in vitro usando o sistema de co-cultura OP9-DL1. O sucesso neste procedimento requer atenção cuidadosa à manutenção do reagente/célula e às principais etapas sensíveis à técnica. Aqui, discutimos esses parâmetros críticos e fornecemos um protocolo detalhado para incentivar a adoção dessa tecnologia.

Derivação de células T In Vitro De Mouse Células-Tronco Embrionárias

Este protocolo descreve a indução eficiente de endotélio hemogênico e progenitores hematopoiéticos multipotenciais a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio da expressão forçada de fatores de transcrição.

A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

Este protocolo descreve como gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas em condições livres de alimentador usando uma combinação de vetores de vírus matrigel e Sendai contendo fatores de reprogramação.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

O objetivo deste protocolo é mostrar o protocolo de reprogramação de linfócitos infiltrantes de tumor de melanoma em células-tronco pluripotentes induzidas.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes

Apresentamos aqui um método para desenvolver células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) para imunoterapia de artrite autoimune em um modelo murino.

Desenvolvimento de Células-Tronco de derivados de células T regulatórias antígeno específico da Contra Auto-imunidade

Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

Este artigo descreve um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno funcional do tumor derivadas de CD8αβ+ únicas células T positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1.

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

Aprenda a diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas em linfócitos T convencionais e antigênico-específicos usando sistema OP9-DL1 e camundongos deficientes em rag. Este método viabiliza imunoterapia antitumoral personalizada.

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

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