Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

O objetivo geral deste procedimento é gerar e caracterizar linfócitos T a partir de células-tronco pluripotentes induzidas ou IPS. As células IPS podem então ser diferenciadas in vitro em um sistema de cultura OP nine DL one e depois amadurecidas in vivo em um camundongo deficiente em rag. Ou as células podem ser geneticamente modificadas para expressar OT em excesso um TCR e, em seguida, transferidas adotivamente para o desenvolvimento in vivo.

Após seis semanas de diferenciação in vivo, os camundongos podem ser desafiados por injeção intraperitoneal com EEG sete células tumorais e, em seguida, a especificidade do antígeno das células T derivadas do IPS pode ser avaliada. Em última análise, as células IPS podem se diferenciar em células T convencionais e específicas do antígeno, as últimas das quais são capazes de proteger os animais do desafio tumoral. As implicações desta técnica se estendem à imunoterapia individualizada contra o câncer.

O método permite uma geração de um grande número de células T reativas ao tumor derivadas de uma quantidade mínima de sangue ou tecido cutâneo do paciente No dia zero, transfira cinco vezes 10 para as células IPS quartas em uma placa de cultura de 100 milímetros contendo um OP nove confluente, DL uma monocamada de célula em meio MEM alfa 20% FBS no dia cinco, olhos de tripsina. Em seguida, centrifugue as células depois de incubá-las em uma placa de cultura fresca de 100 milímetros por 30 minutos e placa de incubadora de 37 graus, cinco vezes 10 elevado a quinto das células flutuantes em 20% FBS alfa, meio MEM e ligante plano de camundongo três em uma nova placa de 100 milímetros contendo uma monocamada de OP nove. As células DL um no dia oito pipetam suavemente as células frouxamente ligadas, centrifugam as células e, em seguida, transferem as células para um único poço de uma placa de cultura de seis poços revestida com OP confluente nove células DL uma incubam as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por mais duas semanas no dia 22.

Incubar células IPS destacadas em meio fresco em uma nova placa de cultura a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, remova cerca de metade das células flutuantes e passe-as por um filtro de náilon de 70 mícrons para excluir aglomerados de células e lave a suspensão de célula única resultante três vezes com PBS frio. Após a terceira lavagem, ressuspenda as células em PBS a 1,5 vezes a 10ª das sétimas células por mililitro e mantenha as células congeladas antes da injeção intravenosa.

Coloque um rato deficiente em pano de quatro semanas sob uma luz infravermelha para dilatar a veia da cauda. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26 e meio com 200 microlitros da suspensão celular e transfira adotivamente as células através da veia da cauda dilatada. Três semanas depois, após a confirmação da eutanásia do camundongo transferido adotivamente, remova os gânglios linfáticos e o baço após quebrar mecanicamente os tecidos.

Ligue a suspensão de célula única com um tampão de lise CK e, em seguida, lave os citos mononucleo resultantes duas vezes em PBS frio. Em seguida, após a coloração para marcadores de superfície celular, avalie as células por análise citométrica de fluxo no dia zero, use o reagente de transfecção do gene JAMA para transfectar células de embalagem de placa E banhadas durante a noite com um OT um MIDR no primeiro dia semente uma vez 10 para as seis células IPS em um poço de uma placa de 24 poços pré-codificada com 0,1% de gelatina no segundo dia, coletar o pseudovírus contendo S natin das células plat E e, em seguida, passá-lo por um filtro de 0,4 mícron para excluir contaminantes potenciais após a centrífuga. Transduzindo as células na presença de poli cérebro por uma hora a 330 vezes G a 32 graus Celsius.

Incube-os durante a noite na mesma temperatura após repetir o procedimento de transdução. A tripsina olha para as células IPS transduzidas no quarto dia e, após a peletização, as células suspendem as células em meio fresco e as semeiam em células alimentadoras snl 7 6 7 irradiadas pré-codificadas. Uma vez que as células transduzidas tenham atingido a confluência, classificar as células vermelhas duplamente positivas GFP e DS por citometria de fluxo.

Seis semanas após a transferência adotiva das células IPS, injetar 50 microlitros de EEG sete células thoma na cavidade peritoneal do mesmo camundongo no dia 50 do desafio tumoral. Use um kit de isolamento de oito células T positivas para CD oito biotech mil E para classificar as células T oito positivas do baço e dos gânglios linfáticos do animal transferido adotivamente. Misture as células T positivas CD oito isoladas com tamanho SPOC irradiado de um camundongo C 57 preto e seis J ingênuo na proporção de um para 10 e pulse a co-cultura com 0,5 micromoles por mil de óvulos por 40 horas.

Depois disso, adicione felden A às células por mais quatro horas. Finalmente, avalie as populações de células por análise de citometria de fluxo após isolar os citos SP de um camundongo C 57 preto e seis J ingênuo. Divida a suspensão celular em dois grupos.

Rotule o grupo CFSE alto com cinco micromoles por mil de CFSE e pulse as células com 10 microgramas por mil de peptídeo de óvulos por uma hora, rotule o grupo baixo A-C-F-S-E com 0,5 MICROMOLES por mil CFSE e não pulse. Misture 2,5 vezes 10 elevado à sexta, as células altas do CFSE com 2,5 vezes 10 elevado à sexta, as células baixas do CFSE em PBS. Em seguida, analise os citatos por citometria de fluxo para expressão de CFSE.

16 horas após a transferência adotiva para o camundongo de interesse Para contar células tumorais intraperitoneais no dia 20 do desafio tumoral. Use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 18 e meio e PBS frio para lavar a cavidade peritoneal. Conte as células tumorais recuperadas para identificar células infiltrantes de tumores.

Remova o tumor em um estágio tardio do desafio do tumor e, em seguida, corte-o em três pedaços. Coloque o primeiro pedaço de tumor em um frasco criogênico e coloque o frasco em gelo seco. Fixe imediatamente a segunda peça de formaldeído.

Preserve a terceira peça em meio RPMI 1640 condicionado após a secagem ao ar das seções de tecido criopreservado. Fixe-os em acetona fria por 15 minutos após secar ao ar as seções fixas por mais 15 minutos. Lave as lâminas por cinco minutos em PBS após a lavagem.

Coloque as lâminas em uma câmara úmida e cubra as seções de tecido com 30 microlitros de 3%B, SA e PBS por 30 minutos para bloquear a ligação não específica. Em seguida, seque o tampão de bloqueio e incube as seções de tecido com uma mistura de 50 microlitros de anticorpo pe anti TCR RV alfa dois e anticorpo anti-óvulos fitzy diluído em 3% PSA em PBS na câmara úmida por duas horas no final da incubação. Lave as lâminas três vezes em PBS frio, finalmente monte as seções com um meio de montagem à base de água antes do exame microscópico fluorescente para análise de citometria de fluxo de células T infiltrantes de tumor.

Esmague o tumor em uma única suspensão celular. Em seguida, analise as células em busca de marcadores de superfície específicos. C, CD três e TCR beta são usados como marcadores de células T para determinar se a estimulação de células IPS com o ligante de entalhe DL um poderia contribuir para a expressão da superfície celular de células T CD quatro e CD oito em células derivadas de células IPS positivas de TCR r beta positivas foi avaliada.

Observe o gráfico de pontos à direita que mostra o dia 22 CD, três TCR R, beta positivo, CD quatro CD negativo, oito células T positivas positivas geradas a partir de células IPS in vitro. Além disso, as células IPS derivadas de células positivas únicas da figura anterior produziram interleucina dois e interferon gama quando estimuladas in vitro por anticorpos anti CD três e anti CD 28 solúveis revestidos em placa, confirmando que as células T derivadas de células IPS são funcionais após a transferência adotiva para camundongos receptores. A maioria das células IPS transduzidas pelo gene TCR sofreu diferenciação em CTLs CDs oito positivos, que responderam in vitro à estimulação peptídica secretando interleucina dois e interferon gama nesses gráficos de pontos de células linfonodal e baço agrupadas.

CD oito células T positivas V beta cinco positivas foram geradas em camundongos transferidos adotivamente com células IPS transduzidas por TCR, mas não por controle. As populações positivas para CD oito positivas V beta cinco foram positivas para coloração de citocinas intracelulares para interleucina dois e produção de interferon gama representada nesses histogramas pelas linhas escuras em comparação com os histogramas de controle de isotipo sombreados, indicando que os CTLs derivados do IPS eram funcionais. Esses dados mostram que as células de alto CFSE pulsaram com eptídeo representado pelos picos à direita em cada gráfico e as células de controle baixo do CFSE representadas pelos picos à esquerda que foram injetadas em camundongos 10 semanas após a transferência de células IPS ou um dia após A OT uma transferência de CTL.

Os CTLs derivados de IPS específicos do antígeno responderam à estimulação do antígeno e tiveram atividade citotóxica, conforme indicado pela ausência de células altas do CFSE aqui. OT um gene TCR transduzido células IPS foram adotivamente transferidas para C 57 camundongos pretos seis e, em seguida, os camundongos foram submetidos a desafio com EEG sete células tumorais no dia 20 células tumorais na cavidade peritoneal foram enumeradas. Observe a redução significativa no número de células tumorais em camundongos que receberam IPS transduzido por TCR em comparação com os grupos de controle.

Mais importante ainda, a transferência adotiva de células IPS transduzidas por TCR desencadeou a infiltração de CTLs superreativos em tecidos tumorais e protegeu os animais do desafio tumoral, como visto nesta coloração h e e de tecidos tumorais recuperados dias 30 a 35 após tumores de desafio tumoral de camundongos transferidos adotivamente com células transduzidas por TCR ou CTLs OT um, mas não simulados injetados ou controle. As células transduzidas foram infiltradas por células inflamatórias, conforme indicado pelas setas vermelhas aqui. Ovos específicos V alfa dois CTLs positivos em vermelho foram encontrados infiltrando óvulos expressando tecidos tumorais em verde.

Enquanto os tumores em camundongos dos grupos de controle tinham menos ou nenhuma célula infiltrante de tumor nesta figura, suspensões de células únicas de tecidos tumorais foram analisadas quanto à expressão de positividade V alfa dois e V beta cinco por citometria de fluxo após gating na população positiva para CD oito. Observe que os tecidos tumorais de camundongos transferidos adotivamente com células IPS transduzidas por TCR exibiram o nível mais alto de células infiltrantes de tumor, enquanto os tumores de camundongos que receberam controle. O IPS transduzido não exibiu infiltração por óvulos específicos de oito células T positivas para CD.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar células T específicas do antígeno a partir de células IPS e como avaliar as funções das células T derivadas do IPS.