Análise sistemática de In Vitro Célula de rolamento usando um sistema microfluídicos Multi-bem placa

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar estudos de rolamento celular com maior rendimento sob um fluxo de cisalhamento fisiologicamente relevante e rigidamente controlado. Isso é obtido usando um sistema microfluídico de vários poços no qual os poços adjacentes em uma placa especializada são conectados por meio de um canal microfluídico. A interface do sistema conecta uma bomba eletropneumática ao topo da placa de vários poços e aplica uma pressão pneumática que conduz o fluido de dentro dos poços através dos canais microfluídicos a uma taxa de fluxo definida.

Uma vez que o canal microfluídico é revestido com o substrato desejado ou monocamada de célula, as células de interesse são introduzidas no canal microfluídico para explorar suas interações específicas de rolamento com a superfície revestida, as propriedades de rolamento das células à medida que interagem com o substrato ou superfície revestida de monocamada sob diferentes condições experimentais podem então ser analisadas com o software apropriado. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a câmara de fluxo de placas paralelas, é que esta técnica permite o estudo das propriedades de laminação de prata com um rendimento significativamente maior sob fluxo de tubo fisiologicamente relevante e controlado com precisão, minimizando o consumo de reagentes e células. Essa plataforma pode ajudar a promover terapias baseadas em células exógenas, permitindo a análise rápida e precisa de abordagens de engenharia projetadas para impactar o rolamento e o retorno celular.

Para revestir um canal microfluídico com um substrato proteico, primeiro adicione 25 a 50 microlitros da solução proteica recém-preparada na entrada. Bem, então aplique uma força absoluta de dois dentes por centímetro quadrado por cinco minutos para perfundir a solução no canal. Quando uma gota de líquido se tornar visível na saída, interrompa o fluxo, incube a placa pelo período de tempo apropriado com a proteína de interesse e, em seguida, aspire a solução de cada uma. Poço.

Em seguida, adicione 200 a 500 microlitros de PBS no poço de saída e, em seguida, aplique um fluxo puro de dois jantares por centímetro quadrado por cinco minutos para lavar o canal e criar uma monocamada de células dentro do canal microfluídico. Comece com uma tripsina suave nas células de interesse de sua placa de cultura por três minutos, pare a reação com um volume duplo de meio completo e, em seguida, centrifugue as células por cinco minutos a 400 Gs e rt. Em seguida, lave o pellet em 10 mililitros de mídia cheia.

Em seguida, ressuspenda as células em um mililitro de meio cheio fresco e conte-as, ajuste a solução celular para a concentração apropriada e, em seguida, coloque 25 a 50 microlitros da suspensão celular em cada entrada. Bem, agora coloque a placa no estágio do microscópio e aplique um fluxo puro de dois dines por centímetro quadrado para fluir as células para o canal até que as células estejam preenchendo todo o canal. Depois de interromper o fluxo, encha os poços de saída e do interior com 200 microlitros do meio celular apropriado e, em seguida, deixe as células assentarem e aderirem a 37 graus Celsius em 5% de CO2.

Após três horas, lave o canal com mídia cheia para remover as células soltas. As células agora devem estar completamente confluentes e prontas para uso para induzir a ativação inflamatória das células endoteliais nos canais. Adicione 100 microlitros de solução alfa de TNF recém-preparada ao poço de entrada e, em seguida, introduza a solução no canal aplicando um fluxo absoluto de dois jantares por centímetro quadrado por cinco minutos.

Para os canais de células endoteliais não ativadas de controle, adicione 100 microlitros de meio basal de células endoteliais à entrada. Bem, para bloquear a selectina P ou E na superfície da célula endotelial, introduza cinco microgramas por mililitro do anticorpo neutralizante apropriado no canal e incube a placa por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, lave os canais com meio basal antes de iniciar o ensaio de laminação.

Examine cuidadosamente os canais ao microscópio para confirmar se os canais estão revestidos corretamente. Em seguida, lave a suspensão de células HL 60 com meio basal duas vezes após a segunda contagem de lavagem e, em seguida, ressuspenda as células no IMDM em cinco vezes 10 elevado à sexta concentração de células por mililitro. Depois de adicionar 25 a 50 microlitros da suspensão da célula na saída, coloque a placa no suporte da placa com temperatura controlada a 37 graus Celsius e coloque o suporte da placa no microscópio stage.

Introduza as células no canal microfluídico. Eles devem ser observados dentro de 10 a 15 segundos fluindo da saída para a entrada. Aqui, as células HL 60 marcadas com fluorescência podem ser observadas, interagindo com a superfície codificada de seleção P, exibindo uma resposta de rolamento para examinar a resposta de rolamento em função da tensão de cisalhamento, reduzir o cisalhamento para 0,25 dines por centímetro quadrado e adquirir de 20 a 32 vídeos usando a função de aquisição de fluxo em cada cisalhamento desejado, e aumentando gradualmente o cisalhamento de 0,25 até cinco dines por centímetro quadrado.

Por fim, use uma câmera CCD para adquirir o vídeo do ensaio com a aquisição de fluxo de 11 quadros por segundo. Por exemplo, aqui, uma célula HL 60 rolando em uma monocamada de células chope é mostrada. Analise os caminhos de rolamento e as velocidades com o software compatível apropriado.

As células HL 60 são consideradas rolos padrão-ouro, pois expressam uma variedade de ligantes homing, incluindo os ligantes de rolamento, P select e ligante de glicoproteína um e CI Lewis X.To testar as capacidades do sistema microfluídico de placa multipoço, vários canais microfluídicos foram revestidos simultaneamente com diferentes substratos e as interações de rolamento das células HL 60. Com esses substratos analisados, as células exibiram um comportamento de rolamento robusto na superfície codificada de seleção de P com as células capturadas primeiro do fluxo, seguidas por um movimento de rolamento distinto. Conforme ilustrado neste gráfico e consistente com a literatura, as células HL 60 exibem um comportamento de rolamento semelhante nas superfícies de selectina e p, mas não em substratos revestidos com FiberInc.

A velocidade celular, conforme analisada por meio de software compatível, foi plotada contra o estresse absoluto, mostrando uma resposta robusta de rolamento das células na selectina p e e com uma velocidade média entre um e 12 mícrons por segundo. Para avaliar a viabilidade deste sistema microfluídico em testar eficientemente as interações entre as células de interesse e uma monocamada celular que reveste as células CHO P de superfície, que foram transfectadas para expressar P de forma estável, mas não e selectina, foram usadas como mostrado aqui. As células HL 60 exibem uma resposta de rolamento significativa em uma monocamada de células CHO P para testar se o movimento de rolamento do HL 60 é realmente mediado pela pectina.

A monocamada foi pré-incubada com anticorpos bloqueadores para selectina P ou E antes da profusão de células HL 60 no canal. Conforme mostrado neste gráfico, o bloqueio da monocamada de CHO p com um anticorpo de selectina P resultou em uma diminuição significativa no número de células HL 60 rolando na superfície, demonstrando que P seleciona e de fato medeia o rolamento HL 60. Conforme descrito anteriormente, a placa microfluídica de vários poços consiste em vários canais microfluídicos separados, permitindo testes de maior rendimento de várias condições diferentes.

Este design vantajoso foi usado para plaquear células endoteliais dentro dos canais microfluídicos para análise rápida das interações entre células HL 60 e células endoteliais sob uma variedade de condições experimentais para simular condições inflamatórias, as células endoteliais foram pré-tratadas com a citocina pró-inflamatória TNF alfa, resultando em regulação positiva de E, mas não de P selectina na superfície da célula endotelial. Curiosamente, as células HL 60 não interagiram com as células endoteliais inativadas e as células não foram observadas rolando nessa superfície. Pelo contrário, as células HL 60 exibiram um comportamento de rolamento robusto em células endoteliais ativadas por TNF alfa com uma velocidade média de cinco a 15 mícrons por segundo para explorar o envolvimento da selectina p ou E nas interações de rolamento entre células HL 60 e células endoteliais ativadas.

As células endoteliais ativadas por TNF alfa foram pré-incubadas com P ou E select em anticorpos bloqueadores, e o rolamento de células HL 60 foi analisado conforme ilustrado no gráfico de bloqueio selecionado em células endoteliais de TNF alfa resultou em um declínio significativo no número de células rolantes na monocamada endotelial ativada. Em contraste, o uso de um controle isotópico ou um anticorpo contra a pectina, que não é expresso nas células endoteliais ativadas, não teve um efeito significativo no rolamento do HL 60 na camada endotelial ativada. Esses dados demonstram o envolvimento direto da S selectina no rolamento de HL 60 em células endoteliais ativadas por TNF alfa, consistente com relatos anteriores.

O software de análise permite o rastreamento dos caminhos de células individuais à medida que interagem com a superfície. Assim, os caminhos de células individuais à medida que interagiam com células endoteliais ativadas por TNF alfa com ou sem e select e bloqueio de anticorpos foram especificamente rastreados Conforme ilustrado nesta figura, o número de células rolantes em células endoteliais ativadas não bloqueadas foi significativamente maior do que em células endoteliais ativadas eleitas e bloqueadas. Além disso, parecia que o movimento de rolamento das células HL 60 nas células endoteliais desbloqueadas era contínuo e robusto, enquanto os caminhos de rolamento das células nas células endoteliais eleitas e bloqueadas eram fragmentados.

Consistente com esse achado, a velocidade de rolamento das células HL 60 em células endoteliais ativadas por TNF alfa desbloqueadas foi significativamente menor do que a velocidade de rolamento em células endoteliais e selecionadas e bloqueadas. Este estudo demonstra o uso de um sistema microfluídico múltiplo para realizar com eficiência experimentos de laminação de células com maior rendimento de até 10 gases de laminação por hora sob fluxo de tubo rigidamente controlado. No geral, esse sistema microfluídico surge como uma técnica poderosa para estudar o rolamento celular, um aspecto fundamental do caping celular.

Por exemplo, nosso laboratório está atualmente usando esse sistema para rastrear condições para melhorar o homing de células-tronco mesenquimais como uma estratégia para melhorar seu impacto terapêutico.