Otimização e Utilização de Agrobacterium Mediada produção de proteína transiente em Nicotiana

Produção de proteína transiente em plantas de Nicotiana baseado na infiltração de vácuo com Agrobacterium levando vetores de lançamento (Tobacco mosaic vírus-base) é uma abordagem rápida e econômica para a produção de antígenos vacinais e proteínas terapêuticas. Nós simplificamos o processo e melhorado acumulação alvo, otimizando as condições de cultivo de bactérias, a seleção de espécies hospedeiras, e co-introdução de RNA silenciar supressores.

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um método simples, eficiente e escalável para a produção de proteína recombinante transitória em um sistema baseado em plantas usando a técnica de infiltração agrícola. Isso é feito otimizando primeiro as condições de crescimento das plantas. O segundo passo é transformar agrobacterium com vetores de lançamento que combinam componentes de vírus de plantas e plasmídeos binários, seguido de cultura do agrobacterium transformado para uso nos experimentos agrícolas.

Durante a infiltração de agrobacterium, as plantas são viradas de cabeça para baixo e as partes aéreas são submersas em uma suspensão de agrobacterium. Um vácuo é então aplicado, fazendo com que o ar seja evacuado dos espaços intercelulares nos tecidos das folhas. Através da St Rapid, a repressurização após a liberação do vácuo resulta na infusão da suspensão de agrobacterium nas folhas.

Em última análise, ensaios de immunoblotting e fluorescência são usados para mostrar a produção de proteínas recombinantes nas plantas infiltradas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a infiltração manual, é que o método de infiltração a vácuo pode ser ampliado para a produção industrial de proteínas recombinantes, incluindo vacinas e proteínas terapêuticas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biotecnologia vegetal e facilitar ainda mais o uso de plantas como uma plataforma alternativa para a produção comercial de proteínas recombinantes.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando descobrimos que aumentar a filtragem agrícola em plantas que crescem no solo é um desafio. Por várias razões, o solo contém uchina, como vírus, bactérias, nematóides e, além disso, o conteúdo do solo e a água de irrigação variam de lote para lote e de estação para estação, e os ovos do solo ao longo do tempo de armazenamento. Além disso, a inversão de plantas em crescimento no solo resultaria em gotejamento indesejado de solo na cultura de agrobactérias durante a infiltração.

Demonstrando esse procedimento estarão Rebecca Snow, assistente de pesquisa sênior do laboratório de biologia vegetal e engenharia, e Emma Gut Robin Lobe. Ela, ela e Adam Trevor, que são assistentes de pesquisa do meu laboratório. Este estudo usa meio de crescimento hidropônico e solução nutritiva para garantir a uniformidade do crescimento das plantas e eliminar as complexidades associadas ao uso do solo para o cultivo de plantas.

Para iniciar este procedimento, mergulhe as placas de lã de rocha em uma solução de fertilizante vegetal por cinco minutos, semeie manualmente as sementes na superfície da lã de rocha embebida em nutrientes. Utilizando o Cedro serão avaliadas três espécies de Nico Oceana neste estudo, duas espécies selvagens, Nico Oceana, Benham Ana e Nico Oceana Excelsior, e um híbrido de Benham, Ana e Excelsior denominado Nico Oceana. A Excela cultiva plantas a partir das sementes sob condições controladas e um longo período de fotos de um dia em um sistema hidropônico em cascata.

Nico Oceana, Bentham Meana e Nico Oceana Excela por quatro a cinco semanas, e Nico Oceana Excelsior por cinco a seis semanas. As cepas de Agrobacterium tumor Fasion usadas neste experimento foram transformadas com os vetores de lançamento apropriados, conforme descrito no manuscrito anexo. Para os fins desta demonstração, são utilizadas cinco cepas de agrobactérias transformadas.

GV 3 1 0 1, carregando uma proteína fluorescente verde repórter, ou gene GFP GV 3 1 0 1, carregando o gene viral do supressor silenciador do vírus do enfezamento espesso do tomate P 19 e A quatro GV 3 1 0 1 e um T 10. Carregando o gene de uma proteína transportadora modificada liase ou lick KM cultivam cepas de agrobacterium durante a noite em meio LB, suplementado com 50 miligramas por litro de micina de lata a 28 graus Celsius com agitação de 200 a 250 RPM no dia seguinte. Prepare suspensões de agrobacterium para os experimentos desejados para examinar a viabilidade de usar várias cepas de agrobacterium para produção de proteínas transitórias, diluir uma cepa de laboratório e duas cepas do tipo selvagem, abrigando o vetor PBI de quatro km de lambida em água mili Q a uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,5.

Para investigar a necessidade de induzir genes de virulência de agrobactérias antes da infiltração, primeiro centrifugue culturas de agrobactérias carregando o vetor P bid 4G FP cultivado em meio LB a 4.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, ressuspenda em meio de indução MMA para uma densidade óptica a 600 nanômetros de 0,5 e agite em temperatura ambiente por duas horas para testar se o cone de acetila aumenta a produção transitória de proteínas, centrífuga e cultura de agrobactérias. Carregando o vetor PBI 4G FP cultivado durante a noite em meio LB e ressuspendido em tampão de infiltração contendo um sal X ms 10 milimolar, MES e 2% de glicose.

Divida a suspensão celular em quatro recipientes. Adicionar uma concentração diferente de cone de aceto a cada uma das suspensões de agrobacterium e incubar à temperatura ambiente durante três horas. Testar o efeito da co-infiltração de um supressor de silenciamento viral na mistura transitória de produção de proteínas GFP.

Uma cultura de agrobactéria diluída em água mili Q carregando o gene GFP e uma cultura carregando o supressor silenciador viral P 19 na proporção de quatro para um durante a infiltração a vácuo das plantas, que será demonstrada. Em seguida, é fundamental controlar a pressão de vácuo e a duração da infiltração de vácuo para infiltrar as plantas de vácuo. Primeiro, transfira a suspensão de agrobacterium preparada para um recipiente dentro da câmara de vácuo.

Em seguida, vire a planta de cabeça para baixo na agrobactéria diluída e aplique um vácuo de 50 a 400 milibares por 30 ou 60 segundos. A infiltração ideal é aplicada rotineiramente a 50 a 100 milibares por 60 segundos. Assim que o vácuo for quebrado, remova as plantas da câmara de vácuo, enxágue com água e cresça por cinco a sete dias sob as mesmas condições de crescimento usadas para o crescimento pré-filtração.

Para preparar amostras para análise ocidental, primeiro, colete amostras aleatórias de folhas das plantas Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior ou Nico Oceana Excela quatro a sete dias após a infiltração ou DPI pulverize as amostras de folhas em nitrogênio líquido até formar um pó fino. Adicione três volumes de um tampão XPBS contendo 0,5% Triton X 100 a cada amostra e transfira a amostra para um tubo einor. Agite suavemente ou gire as amostras extraídas por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Centrifugar o extracto durante cinco minutos e recolher a proteína solúvel total num tubo einor limpo. Diluir os extractos até uma diluição adequada num tampão de extracção XPBS e adicionar cinco tampão de amostra a uma concentração final de X. Ferva as amostras por cinco minutos antes de separar as proteínas por página SDS.

Depois que as proteínas foram transferidas para uma membrana de transferência de P imóvel e detectar GFP usando anti-soro anti-GFP policlonal de coelho em uma diluição de um a 5.000 em solução de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente durante uma hora com um balanço suave depois de lavar as membranas três vezes com um X-P-B-S-T 20. Incubar com o anticorpo anti-raivoso conjugado com peroxidase de rabanete e adicionar uma diluição de um a 5.000 por uma hora para detecção de GFP.

Posteriormente, os western blots são processados e as intensidades das bandas correspondentes às proteínas são analisadas conforme descrito no manuscrito anexo. A detecção visual da fluorescência GFP em plantas inteiras transformadas transitoriamente é realizada usando uma lâmpada UV portátil de comprimento de onda longo, use uma câmera digital e um tempo de exposição de 15 segundos para fotografar plantas transformadas transitoriamente através de um filtro amarelo oito ES 52. Obtenha imagens de análises de western blot usando o software de gene ssnappped em um genoma.

Quantifique os resultados usando o software da ferramenta genética com uma curva de calibração baseada em um padrão GFP purificado, Nick Oceana Bentham Miana foi cultivada em placas Rockwell embebidas em fertilizantes disponíveis comercialmente para determinar as condições ideais para o crescimento das plantas e o acúmulo de biomassa. A presença de fósforo é fundamental para alcançar a germinação e o crescimento de NICO Oceana. Sementes de Bentham, conforme mostrado por essas plantas de seis semanas de idade, crescendo em uma solução fertilizante contendo 4,8% de fósforo ou uma solução fertilizante contendo 0% de fósforo.

Os efeitos do crescimento de agrobactérias e meios de infiltração na fitossanidade e na produção de proteínas foram examinados comparando a produção de GFP em nicotiana. Plantas de Hamana infiltradas a vácuo com PBI 4G FP abrigando culturas de agrobactérias cultivadas em três meios diferentes. As culturas YEB AB e LB cultivadas durante a noite em meio YEB ou LB foram centrifugadas em baixa velocidade e ressuspensas em meio de indução MMA ou cultivadas durante a noite em meio YEB LB ou AB e diretamente diluídas de um a cinco ou um a 10 com água Milli Q conforme ilustrado neste resultado de western blot, plantas infiltradas com culturas de agrobactérias cultivadas em meio YEB LB ou AB e diluídas com Milli Q. na produção média de GFP a partir de culturas centrifugadas e ressuspensas em MMA.

Portanto, a água milli Q é recomendada para diluir culturas de agrobactérias para infiltração de plantas e foi rotineiramente usada em experimentos subsequentes para atingir uma densidade óptica de 600 nanômetros de 0,5. Em seguida, foram examinados os efeitos da densidade da suspensão de células de agrobacterium e do curso do tempo na expressão do alvo. Quatro densidades diferentes de suspensão celular de agrobacterium portadora de PBI 4G FP foram avaliadas e amostras de folhas foram coletadas em quatro, sete e 10 dias após a infiltração ou DPI para análise de western blot em quatro DPI, houve diferenças perceptíveis na fluorescência de GFP entre as plantas infiltradas com diferentes densidades de suspensão celular de agrobacterium, nenhuma expressão de GFP foi observada em 600 de 0,05 em sete D-P-I-G-F-P.

A fluorescência foi semelhante nas plantas infiltradas na suspensão celular. Densidades de 601,0, 0,5 e 0,1, mas foi implantes mais baixos infiltrados em um A 600 de 0,05 em contraste com 10 DPI. Não foram observadas diferenças na produção de GFP entre as plantas infiltradas com qualquer uma das quatro densidades de suspensão celular para aumentar a diversidade de cepas de agrobactérias disponíveis para a produção de proteínas transitórias.

As plantas de Nicotiana Benham miana foram infiltradas a vácuo com sete cepas diferentes de bactérias agrícolas que abrigam o vetor KBI quatro lick km. As folhas infiltradas foram coletadas aos sete DPI e o nível de expressão de quinase foi estimado por Western blot. Conforme mostrado neste gráfico, o maior nível de produção de liase foi alcançado com as cepas GV 3 1 10, 1 A quatro e LBA 4 4 0 4 com pequenas diferenças.

Enquanto o menor nível de expressão foi com C cinco, oito, C, uma produção intermediária de liase foi alcançada com cepas, uma atividade enzimática de T 77, A T zero seis e T 10 liase foi demonstrada usando um ensaio XMO Graham. A proteína liase bacteriana purificada foi usada como controle positivo para a atividade enzimática. É interessante notar que as plantas de nicotiana Benham miana infiltradas com as cepas de agrobacterium A quatro e sete T sete tipos selvagens apresentaram sintomas patológicos como nanismo, alongamento e ondulação de animais de estimação e enrolamento das folhas aos sete DPI.

Os sintomas foram leves em plantas de nicotiana benham infiltradas com o tipo selvagem na cepa T 10. Não foram observados sintomas nas plantas de Nico Oceana Benham infiltradas com a cepa de laboratório GV 3 1 0 1. Uma comparação da produção de biomassa vegetal nas espécies selvagens revelou que, sob as mesmas condições de crescimento, a maior biomassa foliar que pode ser gerada a partir de Nico Oceana Excela é aproximadamente duas vezes maior em comparação com Nico Oceana.

A produção de proteína Benham foi examinada em Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior e Nico Oceana Excela infiltrados com a cepa agrobacterium. GV 3 1 0 1 abrigando PBI 4G F-P-G-F-P o acúmulo foi avaliado em sete DPI em folhas inteiras infiltradas. O exame visual da expressão de GFP sob luz UV mostrou uma distribuição uniforme de GFP em Nico Oceana Hamana e Nico Oceana Excela e uma distribuição desigual em Nico Oceana Excelsior devido à dificuldade de infiltrar uma área foliar inteira de Nico Oceana Excelsior A análise de Western blot do acúmulo de GFP nessas folhas infiltradas a sete DPI mostrou que o nível de GFP foi maior em Nico Oceana Hamana do que em Nico Oceana Excela e Nico Oceana Excelsior o baixo nível de produção de proteínas em Nico Oceana.

Excelsior é devido à infiltração desigual e distribuição desigual de GFP acumulada na folha coletada. Para testar o efeito da pressão de vácuo nas folhas, as plantas de Nico Oceana Benham foram infiltradas com a cepa agrobacterium, GV 3 1 0 1 abrigando PBI 4G FP sob pressões de vácuo de 400, 200, 100 ou 50 milibar a um tempo de retenção de vácuo de 30 ou 60 segundos. Não foram observadas diferenças na produção de GFP e impacto leve ou nenhum impacto prejudicial na saúde das plantas quando pressões de vácuo de 5, 100 e 200 milibar foram aplicadas por 30 ou 60 segundos.

O efeito da duração do vácuo na expressão do alvo foi avaliado infiltrando-se em um plano de plantas Nico Oceana Benham a cada hora com um A 600 de 0,5 de GV 3 1 0 1 abrigando PBI 4G FP por oito horas. Na mesma cultura de agrobacterium mostrada neste resultado representativo, o nível de produção de GFP foi semelhante em todos os tempos, aponta até oito horas, sugerindo que durante esse período de tempo a agrobacterium mantém sua capacidade de lançar um DNA de fita simples. Uma vez que muitos produtos químicos e monossacarídeos foram relatados para aumentar a produção de proteínas transitórias em várias espécies de plantas.

Este estudo também avaliou o efeito de diferentes concentrações de aceto, crinona e glicose. Na produção transitória de proteína GFP em Nico Oceana Benham, Ana se infiltrou com a cepa de agrobactéria, GV 3 1 0 1 abrigando PBI 4G FP. As agrobactérias foram cultivadas durante a noite em meio YEB, centrifugadas e ressuspensas a um 600 de 0,5 em MMA contendo 2% de glicose com acetil serona nas concentrações indicadas ou em MMA contendo 200 acetofenona micromolar com glicose nas concentrações indicadas. Como mostrado aqui, nenhuma das concentrações testadas desses compostos induziu um aumento significativo na produção de proteína GFP em comparação com o controle onde o meio de indução não continha acetofenona ou glicose.

Em seguida, o efeito da co-infiltração de um supressor silenciador na expressão transitória dos genes GFP e HAC one em Nico Oceana. As folhas de Benham foram examinadas antes da infiltração agrobacterium GV três culturas de um dez e um contendo PBI 4G FP e o supressor de silenciamento viral P 19 do vírus do enfezamento espesso do tomate foram respectivamente misturadas nas proporções de um para um, dois para um, três para um e quatro para um. Conforme indicado pelos resultados da análise de Western blot a sete DPI, a presença de P 19 não aumentou ou diminuiu a produção de GFP em nicotiana Benham Miana em qualquer proporção de duas das suspensões de agrobacterium.

Além disso, foi investigado o efeito de dois supressores de silenciamento de genes virais P 23 e P 19 na prevenção do silenciamento de genes pós-transcricionais para HAC um. POS de agrobacterium carregando o vetor de lançamento PBI, quatro HAC, um e um dos dois plasmídeos supressores silenciadores virais foram misturados na proporção de quatro para um, respectivamente, e co-infiltrados em Nicotiana Bentham Miana. As amostras foliares infiltradas foram coletadas de três a oito DPI.

Este gráfico mostra os níveis médios de expressão de HAC um de três experimentos, conforme determinado pela análise de Western blot. A co-infiltração de Nico Oceana Benham com P 23 ou P 19 resultou em um aumento na produção de HAC um em comparação com o uso de nenhum supressor silenciador a 60 pi. Isso sugere que P 23 e P 19 são eficientes neste sistema.

Observou-se também que, tanto na presença quanto na ausência de um supressor silenciador, o nível de produção da proteína HAC um começou a diminuir em sete DPI. Isso indica que o momento do declínio na produção de proteínas transitórias em Nico Oceana Benham Miana infiltrado com o vetor de lançamento é específico do alvo. Por fim, a estabilidade do Banco de Células Agrobacterium é avaliada todos os anos infiltrando plantas nicotiana benham com o mesmo lote do banco de células Agrobacterium para avaliar o acúmulo de proteínas.

Esses resultados representativos indicam que a produção de proteína HA um tem sido muito estável por mais de três anos. A produção média de HAC um nas plantas Nicotiana benam é de 651 mais ou menos 49,4 miligramas por quilograma. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como aplicar a técnica de infiltração agrícola para produção de proteínas recombinantes em larga escala, que podem ser usadas para fabricação de vacinas de subunidades, anticorpos de proteínas teogênicas e antígenos diagnósticos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de controlar o cruzamento da planta hidroponicamente, usar agrobactérias viáveis, controlar a pressão e ação do vácuo e monitorar o veículo de expressão da proteína. Uma vez dominada, a técnica de agrofiltração pode ser feita em 24 horas se for realizada adequadamente em condições controladas.