Otimização e Utilização de

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um método simples, eficiente e escalonável para a produção transitória de proteínas recombinantes em um sistema baseado em plantas, utilizando a técnica de agroinfiltração. Isso é realizado primeiramente pela otimização das condições de crescimento das plantas. O segundo passo consiste em transformar a *Agrobacterium* com vetores lançadores que combinam componentes de vírus vegetais e plasmídeos binários, seguido pelo cultivo da *Agrobacterium* transformada para uso nos experimentos de agroinfiltração.

Durante a infiltração por agrobactérias, as plantas são viradas de cabeça para baixo e as partes aéreas são submersas em uma suspensão de agrobactérias. Em seguida, aplica-se vácuo, o que provoca a evacuação do ar dos espaços intercelulares nos tecidos foliares. Através de St Rapid, a repressurização após a liberação do vácuo resulta na infusão da suspensão de agrobactérias nas folhas.

Por fim, o eletroblotamento imunológico e ensaios de fluorescência são utilizados para demonstrar a produção de proteínas recombinantes nas plantas infiltradas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a infiltração manual, é que o método de infiltração a vácuo pode ser ampliado para a produção industrial de proteínas recombinantes, incluindo vacinas e proteínas terapêuticas. Este método pode auxiliar na resposta a questões-chave na biotecnologia vegetal e facilitar ainda mais o uso de plantas como uma plataforma alternativa para a produção comercial de proteínas recombinantes.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando descobrimos que ampliar a filtração agro em plantas cultivadas em solo é desafiador. Por várias razões, o solo contém agentes como vírus, bactérias, nematoides e, além disso, a composição do solo e a água de irrigação variam de lote para lote e de estação para estação, e os ovos do solo envelhecem ao longo do tempo durante o armazenamento. Além disso, o inversão de plantas cultivadas em solo resultaria em gotejamento indesejado de solo na cultura de agrobactérias durante a infiltração.

Rebecca Snow, assistente sênior de pesquisa do laboratório de biologia vegetal e engenharia, e Emma Gut Robin Lobe demonstrarão este procedimento. Ela, juntamente com Adam Trevor, que são assistentes de pesquisa do meu laboratório. Este estudo utiliza meio de crescimento vegetal hidropônico e solução nutritiva para garantir a uniformidade do crescimento das plantas e eliminar as complexidades associadas ao uso de solo no cultivo de plantas.

Para iniciar este procedimento, embeba placas de lã de rocha em uma solução de fertilizante para plantas por cinco minutos e semeie manualmente as sementes sobre a superfície da lã de rocha enriquecida com nutrientes. Neste estudo, serão avaliadas três espécies do Cedro Nico Oceana: duas espécies selvagens, Nico Oceana Benham Ana e Nico Oceana Excelsior, e um híbrido de Benham, Ana e Excelsior denominado Nico Oceana Excela. Cultive as plantas a partir das sementes em condições controladas e com fotoperíodo longo, utilizando um sistema hidropônico em cascata.

Nico Oceana, Bentham Miana e Nico Oceana Excela por quatro a cinco semanas, e Nico Oceana Excelsior por cinco a seis semanas. As cepas de Agrobacterium tumefaciens utilizadas neste experimento foram transformadas com os vetores de indução apropriados, conforme descrito no manuscrito suplementar. Para fins desta demonstração, são utilizadas cinco cepas de agrobactérias transformadas.

GV3101, carregando um gene repórter de proteína verde fluorescente, ou GFP; GV3101, carregando o gene viral do supressor de silenciamento do Tomato Bushy Stunt Virus P19; e GV3101, contendo o vetor PBI4-lickKM. Cultive cepas de Agrobacterium durante a noite em meio LB, suplementado com 50 miligramas por litro de canamicina a 28 graus Celsius, com agitação de 200 a 250 RPM. No dia seguinte, prepare suspensões de Agrobacterium para os experimentos desejados, a fim de examinar a viabilidade do uso de múltiplas cepas de Agrobacterium para produção transitória de proteínas. Dilua uma cepa de laboratório e duas cepas selvagens, contendo o vetor PBI4-lickKM, em água Milli-Q até uma densidade óptica a 600 nanômetros de 0,5.

Para investigar a necessidade de induzir os genes de virulência de agrobactérias antes da infiltração, primeiramente centrifugue culturas de agrobactérias contendo o vetor P bid 4G FP cultivadas em meio LB a 4.000 × g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, re-suspenda-as em meio de indução MMA até uma densidade óptica a 600 nanômetros de 0,5 e agite à temperatura ambiente por duas horas. Para testar se acetil cona aumenta a produção transitória de proteína, centrifugue e re-suspenda a cultura de agrobactéria contendo o vetor PBI 4G FP cultivada durante a noite em meio LB e re-suspenda-a em tampão de infiltração contendo 1 × sal MS, 10 milimolar de MES e 2% de glicose.

Divida a suspensão celular em quatro recipientes. Adicione uma concentração diferente de acetona a cada uma das suspensões de agrobactérias e incube à temperatura ambiente por três horas. Para testar o efeito da co-infiltração de um supressor viral de silenciamento na produção transitória de proteína GFP, faça uma mistura.

Uma cultura de agrobactéria diluída em água milli Q, contendo o gene GFP, e uma cultura contendo o supressor de silenciamento viral P19 em uma proporção de quatro para um durante a infiltração a vácuo das plantas, o que será demonstrado. Em seguida, é fundamental controlar a pressão do vácuo e a duração da infiltração para realizar a infiltração a vácuo das plantas. Primeiro, transfira a suspensão de agrobactéria preparada para um recipiente dentro da câmara de vácuo.

Em seguida, vire a planta de cabeça para baixo na solução de agrobactéria diluída e aplique um vácuo de 50 a 400 milibares por 30 ou 60 segundos. A infiltração ideal é rotineiramente aplicada a 50-100 milibares por 60 segundos. Após a liberação do vácuo, retire as plantas da câmara de vácuo, enxágue em água e cultive por cinco a sete dias nas mesmas condições de crescimento utilizadas para o crescimento pré-filtração.

Para preparar amostras para análise Western, primeiro, colete amostras aleatórias de folhas de plantas de Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior ou Nico Oceana Excela entre quatro e sete dias após a infiltração ou DPI. Pise as amostras de folhas em nitrogênio líquido até obter um pó fino. Adicione três volumes de tampão 1XPBS contendo 0,5% de Triton X-100 a cada amostra e transfira a amostra para um tubo eppendorf. Agite ou gire suavemente as amostras extraídas por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Centrifugue o extrato por cinco minutos e colete a proteína solúvel total em um tubo eppendorf limpo. Dilua os extratos a uma diluição apropriada em tampão de extração PBS 1X e adicione tampão de amostra 5X para obter uma concentração final de 1X. Ferva as amostras por cinco minutos antes de separar as proteínas por eletroforese SDS-PAGE.

Após a transferência das proteínas para uma membrana de transferência P imóvel, detecte GFP usando anticorpo policlonal de coelho anti-GFP em uma diluição de 1:5.000 na solução bloqueadora. Incube à temperatura ambiente por uma hora com agitação suave, após lavar as membranas três vezes com PBS-T 1X. Incube com o anticorpo secundário conjugado à peroxidase de rábano (anti-coelho) na diluição de 1:5.000 por uma hora para detecção de GFP.

Posteriormente, os blot ocidentais são processados e as intensidades das bandas correspondentes às proteínas são analisadas conforme descrito no manuscrito suplementar. A detecção visual da fluorescência de GFP em plantas transitoriamente transformadas é realizada utilizando uma lanterna de luz ultravioleta de onda longa; utilize uma câmera digital e um tempo de exposição de 15 segundos para fotografar as plantas transitoriamente transformadas através de um filtro amarelo eight ES 52. Obtenha imagens provenientes das análises de blot ocidental utilizando o software gene snapped em um genoma.

Quantifique os resultados utilizando o software da ferramenta gênica com uma curva de calibração baseada em um padrão purificado de GFP. Nick Oceana Bentham Miana foi cultivado em placas Rockwell embebidas em fertilizantes comercialmente disponíveis para determinar as condições ideais para o crescimento vegetal e o acúmulo de biomassa. A presença de fósforo é essencial para alcançar a germinação e o crescimento de NICO Oceana. As sementes de Bentham, conforme mostrado por estas plantas com seis semanas de idade crescendo em uma solução fertilizante contendo 4,8% de fósforo ou em uma solução fertilizante contendo 0% de fósforo.

Os efeitos do crescimento da agrobactéria e do meio de infiltração na saúde da planta e na produção de proteínas foram examinados comparando a produção de GFP em nicotiana. Plantas Hamana foram submetidas à infiltração a vácuo com PBI 4G FP contendo culturas de agrobactéria cultivadas em três meios diferentes. Culturas de YEB, AB e LB cultivadas durante a noite em meio YEB ou LB foram centrifugadas em baixa velocidade e re-suspendidas no meio de indução MMA ou cultivadas durante a noite em meios YEB, LB ou AB e diretamente diluídas na proporção de um para cinco ou um para 10 com água Milli Q. Conforme ilustrado neste resultado de blot de western, plantas infiltradas com culturas de agrobactéria cultivadas em meios YEB, LB ou AB e diluídas com água Milli Q não mostraram diferença significativa na produção média de GFP em comparação com culturas centrifugadas e re-suspendidas em MMA.

Portanto, recomenda-se água milli Q para a diluição de culturas de agrobactérias para infiltração em plantas e foi rotineiramente utilizada em experimentos subsequentes para atingir uma densidade óptica a 600 nanômetros de 0,5. Em seguida, foram examinados os efeitos da densidade da suspensão celular de agrobactéria e do tempo sobre a expressão do alvo. Quatro diferentes densidades de suspensão celular de agrobactéria carregando PBI 4G FP foram avaliadas e amostras de folhas foram coletadas aos quatro, sete e dez dias após a infiltração, ou DPI. Na análise por western blot realizada aos quatro DPI, foram observadas diferenças notáveis na fluorescência de GFP entre plantas infiltradas com diferentes densidades de suspensão celular de agrobactéria; nenhuma expressão de GFP foi observada em 600 de 0,05 aos sete DPI-GFP.

A fluorescência foi semelhante em plantas infiltradas com densidades de suspensão celular de 600 de 1,0, 0,5 e 0,1, mas foi menor em plantas infiltradas com densidade de 600 de 0,05 em contraste com 10 DPI. Nenhuma diferença na produção de GFP foi observada entre plantas infiltradas com qualquer uma das quatro densidades de suspensão celular para aumentar a diversidade de cepas de agrobactérias disponíveis para produção transitória de proteínas.

Plantas de Nicotiana Benham miana foram submetidas à infiltração a vácuo com sete cepas diferentes de bactérias agro que continham o vetor KBI four lick km. As folhas infiltradas foram coletadas aos sete DPI e o nível de expressão da quinase foi estimado por meio de Western blot. Como mostrado neste gráfico, o maior nível de produção de liase foi obtido com as cepas GV 3 1 10, 1 A four e LBA 4 4 0 4, com pequenas diferenças entre elas.

Embora o menor nível de expressão tenha sido observado com C cinco oito, produção intermediária de liase foi obtida com as linhagens a T 77, A T zero seis e a T 10. A atividade enzimática da liase foi demonstrada utilizando o ensaio de XMO Graham. A proteína bacteriana de liase purificada foi utilizada como controle positivo para atividade enzimática. É interessante notar que plantas de nicotiana Benham miana infiltradas com as linhagens selvagens de agrobactérias A quatro e a T setenta e sete apresentaram sintomas patológicos, tais como nanismo, alongamento e enrolamento de pecíolos e enrolamento foliar aos sete DPI.

Os sintomas foram leves em plantas de nicotiana benham infiltradas com a linhagem selvagem T 10. Nenhum sintoma foi observado em plantas de Nico Oceana Benham infiltradas com a linhagem de laboratório GV 3 1 0 1. Uma comparação da produção de biomassa vegetal na espécie selvagem revelou que, sob as mesmas condições de crescimento, a biomassa foliar máxima que pode ser gerada a partir de Nico Oceana Excela é aproximadamente duas vezes maior em comparação com Nico Oceana.

A produção de proteína Benham foi examinada em Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior e Nico Oceana Excela infiltradas com a linhagem de agrobactéria. A acumulação GV 3 1 0 1 portando PBI 4G F-P-G-F-P foi avaliada aos sete DPI em folhas inteiras infiltradas. O exame visual da expressão de GFP sob luz UV mostrou uma distribuição uniforme de GFP em Nico Oceana Hamana e Nico Oceana Excela e uma distribuição irregular em Nico Oceana Excelsior, devido à dificuldade de infiltrar toda a área foliar de Nico Oceana Excelsior. A análise por Western blot da acumulação de GFP nessas folhas infiltradas aos sete DPI mostrou que o nível de GFP foi maior em Nico Oceana Hamana do que em Nico Oceana Excela e Nico Oceana Excelsior, indicando o baixo nível de produção proteica em Nico Oceana.

Excelsior é devido à infiltração desigual e à distribuição desigual da GFP acumulada na folha coletada. Para testar o efeito da pressão de vácuo sobre as folhas, plantas de Nico Oceana Benham foram infiltradas com a linhagem de agrobactéria GV 3 1 0 1 portadora de PBI 4G FP sob pressões de vácuo de 400, 200, 100 ou 50 milibares, com tempo de retenção no vácuo de 30 ou 60 segundos. Nenhuma diferença na produção de GFP e impacto leve a nenhum efeito prejudicial sobre a saúde da planta foi observado quando pressões de vácuo de 5, 100 e 200 milibares foram aplicadas por 30 ou 60 segundos.

O efeito da duração do vácuo sobre a expressão do alvo foi avaliado infiltrando uma bandeja de plantas Nico Oceana Benham a cada hora com uma A 600 de 0,5 de GV 3 1 0 1 contendo PBI 4G FP, durante oito horas. Na mesma cultura de agrobactéria apresentada neste resultado representativo, o nível de produção de GFP foi semelhante em todos os momentos, até oito horas, sugerindo que, durante esse período, a agrobactéria mantém sua capacidade de lançar um DNA de fita simples. Uma vez que muitos produtos químicos e monossacarídeos já foram relatados como potencializadores da produção transitória de proteínas em várias espécies vegetais.

Este estudo também avaliou o efeito de diferentes concentrações de acetofenona, crinona e glicose na produção transitória da proteína GFP em Nicotiana benthamiana, infiltrada com a linhagem de Agrobacterium GV3101 portadora do vetor PBI4GFP. As bactérias agrotransformantes foram cultivadas durante a noite em meio YEB, centrifugadas e re-suspensas até uma OD600 de 0,5, em MMA contendo 2% de glicose com acetofenona nas concentrações indicadas, ou em MMA contendo 200 micromolares de acetofenona com glicose nas concentrações indicadas. Como mostrado aqui, nenhuma das concentrações testadas desses compostos induziu um aumento significativo na produção da proteína GFP em comparação com o controle, no qual o meio de indução não continha acetofenona ou glicose.

Em seguida, foi examinado o efeito da co-infiltração de um supressor de silenciamento na expressão transitória dos genes GFP e HAC um em folhas de Nico Oceana. Benham antes da infiltração. Culturas de agrobactérias GV três um zero um contendo PBI 4G FP e o supressor viral de silenciamento P 19 do vírus do enfezamento amarelo do tomateiro foram respectivamente misturadas em proporções de um para um, dois para um, três para um e quatro para um. Conforme indicado pelos resultados da análise de Western blot realizada sete dias após a infiltração (DPI), a presença de P 19 não aumentou nem diminuiu a produção de GFP em nicotiana Benham Miana em nenhuma das proporções utilizadas entre as suspensões de agrobactérias.

Além disso, foi investigado o efeito de dois supressores virais de silenciamento gênico, P 23 e P 19, na prevenção do silenciamento pós-transcricional de HAC um. POS de agrobactérias portando o vetor launch PBI quatro HAC um e um dos dois plasmídeos de supressores virais de silenciamento foram misturados em uma proporção de quatro para um, respectivamente, e co-infiltrados em Nicotiana Benthamiana. As amostras de folhas infiltradas foram coletadas de três a oito DPI.

Este gráfico mostra os níveis médios de expressão de HAC um de três experimentos, conforme determinado por análise de Western blot. A co-infiltração de Nico Oceana Benham com P 23 ou P 19 resultou em um aumento na produção de HAC um em comparação com o uso de nenhum supressor de silenciamento aos 60 pi. Isso sugere que P 23 e P 19 são eficientes neste sistema.

Também foi observado que tanto na presença quanto na ausência de um supressor de silenciamento, o nível de produção da proteína HAC1 começou a declinar no sétimo DPI. Isso indica que o momento do declínio na produção transitória de proteína em *Nicotiana benthamiana* infiltrada com o vetor launch é específico para o alvo. Por fim, a estabilidade do banco de células de *Agrobacterium* é avaliada anualmente por meio da infiltração de plantas de *Nicotiana benthamiana* com o mesmo lote do banco de células de *Agrobacterium* para avaliar o acúmulo de proteína.

Esses resultados representativos indicam que a produção da proteína HA um tem sido muito estável por mais de três anos. A produção média de HAC um em plantas de Nicotiana benthamiana é de 651 ± 49,4 miligramas por quilograma. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aplicar a técnica de agroinfiltração para a produção de proteínas recombinantes em larga escala, que pode ser utilizada na fabricação de vacinas de subunidades, anticorpos contra proteínas terapêuticas e antígenos diagnósticos.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de controlar o cruzamento de plantas hidroponicamente, usar bactérias agro viáveis, controlar a pressão e aeração do vácuo e monitorar o vetor de expressão proteica. Uma vez dominado, o técnica de filtração agro pode ser realizada em 24 horas, se for executada corretamente sob condições controladas.