Estudando os efeitos da rigidez Matrix em função celular usando acrilamida baseado Hidrogéis

Modelar a complacência tecidual in vivo usando hidrogéis de acrilamida. Isso é feito gerando primeiro lamínulas inferiores reativas e lamínulas superiores siliconizadas. A segunda etapa do procedimento é derramar e criar os hidrogéis de acrilamida.

A terceira etapa do procedimento é a reticulação da proteína da matriz extracelular de escolha ao hidrogel. A etapa final do procedimento é a incubação e análise das células. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram como a variação da complacência da matriz extracelular in vitro regula o comportamento celular por meio de análise usando microscopia de imunofluorescência, PCR quantitativo em tempo real e western blotting.

Hoje mostraremos o procedimento para a geração e uso de hidrogéis de acrilamida. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar nossa rigidez da matriz extracelular, regular a morfologia celular, a sinalização e a proliferação celular. Então vamos começar.

Inicie este procedimento gerando lamínulas reativas. Primeiro coloque uma camada de paraforma na metade inferior de uma placa de Petri de 150 milímetros. Em seguida, transfira até nove lamínulas de autoclave de 25 milímetros para o filme para e cubra-as com um mililitro de hidróxido de sódio 0,1 molar.

Incube as lamínulas por três minutos Após a incubação, aspire o hidróxido de sódio com uma linha de vácuo trabalhando em uma pipeta química de capuz 0,5 mililitros de três amino profile trimetil ou três APTMS em cada lamínula. Incubar as lamínulas durante três minutos e, em seguida, aspirar as três A-P-T-M-S. Tome cuidado para não incubar por muito tempo para evitar a formação de espuma na tampa.

Deslizamentos após o tratamento. Enxágue as lamínulas uma vez com 20 mililitros de água deionizada no mesmo prato. Remova as lamínulas do prato usando uma pinça curva e transfira-as para um novo prato de 150 milímetros.

Em seguida, lave novamente as lamínulas com água deionizada e coloque-as no balancim por 10 minutos. Após a incubação, remova a água e lave mais duas vezes. É muito importante remover todos os três A-P-T-M-S para que não reaja com o glutaraldeído e deixe um precipitado branco turvo 10 minutos antes do uso do glutaraldeído.

Usando uma pinça curva, transfira as lamínulas para um prato limpo com camadas de param e aspire qualquer líquido restante Usando uma linha de vácuo, cubra cada lamínula completamente com 0,5 mililitros de glutaraldeído a 0,5% em água deionizada estéril para reticular os três APTS e o gel de poliacrilamida. Incube as lamínulas por 30 minutos em uma capa química. Em seguida, aspire o enxágue com glutaraldeído e lave novamente as lamínulas com água deionizada.

Em seguida, seque completamente as lamínulas. Adicione novas lamínulas a um tubo Falcon de 50 mililitros contendo uma solução de vedação de superfície a 10% em clorofórmio e rocha por pelo menos 10 minutos. Transvase a solução de vedação da superfície e seque ao ar.

As lamínulas de cobertura dos lenços umedecidos Kim no gabinete de segurança biológica, onde os hidrogéis serão preparados para iniciar a preparação do hidrogel. Use uma pinça curva para transferir as lamínulas do lado reativo para uma folha de paraforma que foi colada na superfície do gabinete de segurança biológica. Certifique-se de que as lamínulas estejam planas na superfície da paraforma.

Em seguida, prepare um auxiliar de CIN saturado e hidroxi ou solução NHS em tolueno, dissolvendo uma pequena quantidade de NHS em tolueno suficiente. Para os experimentos específicos, adicione pequenas quantidades de NHS até que o NHS não se dissolva mais. A solução saturada é geralmente turva e rosa.

Em seguida, prepare a acrilamida BIS água de acrilamida e um PS para atingir a porcentagem de acrilamida desejada. Adicione os reagentes aos tubos de microuso conforme descrito no protocolo escrito. Em seguida, uma alíquota de cada vez.

Adicione o NHS e o TM me. Vortex o tubo breve e imediatamente Despeje entre três a cinco géis usando 140 microlitros por lamínula nos armários de segurança biológica. Coloque rapidamente a lamínula SILICONIZADA de 25 milímetros em cima de cada gel antes que ele comece a polimerizar.

A adição da lamínula superior permitirá que a acrilamida cubra completamente a lamínula inferior. Incube este sanduíche em temperatura ambiente até que a acrilamida polimerize para determinar quando ocorreu a polimerização. Verifique a solução residual de acrilamida no tubo da microcentrífuga.

A polimerização levará alguns minutos para géis rígidos e um pouco mais para géis macios. Uma vez que a polimerização tenha ocorrido, pegue cuidadosamente o sanduíche usando luvas estéreis. Em seguida, deslize a lamínula superior até que ela fique saliente sobre o gel polimerizado.

Em seguida, levante a tampa. Retire o gel, descarte a lamínula superior. Coloque cada lamínula de cobertura de gel inferior, doravante chamada de hidrogel, em uma placa de seis poços.

Em seguida, adicione dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS por poço de uma placa de seis poços. Em seguida, lave os hidrogéis com PBS e incube em um balancim por cinco minutos. Repita esta lavagem duas vezes.

Para iniciar o experimento, cubra cada hidrogel com dois mililitros de uma solução de fibronectina ou outra proteína da matriz extracelular. Incube a proteína no hidrogel durante a noite a quatro graus Celsius para permitir que ela se ligue covalentemente ao hidrogel após a incubação noturna aspirar a solução de ECM. Em seguida, bloqueie o NHS não reativo com um miligrama por mililitro de albumina sérica bovina livre de ácidos graxos ativados por aquecimento em meio livre de soro e incube por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius.

Após a incubação, lave os hidrogéis uma vez com PBS estéril. Em seguida, coloque as células no meio de cultura apropriado contendo soro fetal bovino. Para o hidrogel aqui.

Estabelecer fibroblastos embrionários de camundongos são usados. Determine o número de células a serem semeadas no hidrogel com base no grau de espalhamento e confluência das células necessárias para a experimentação. Aproximadamente 10 a cinco células necessárias para western blot e análise quantitativa de PCR.

Em seguida, incube as células nas condições apropriadas para o tipo específico de célula. Após o período de incubação. Extraia a proteína celular ou mRNA de acordo com a necessidade.

Pipete gotículas de 100 microlitros de tampão de lise em uma folha de paraforma na bancada do laboratório, deixando aproximadamente dois a três centímetros entre cada gota. Em seguida, remova cuidadosamente cada hidrogel levantando a lamínula inferior do poço. Usando uma pinça curva e colocando o lado da célula voltado para baixo em cima das gotículas.

Incubar as células com o tampão de lise durante exactamente um minuto. Por fim, remova as lamínulas e transfira o tampão de lise para um tubo de microcentrífuga. Alternativamente, ao extrair RNA, transfira cada hidrogel para uma nova placa de seis poços e adicione um mililitro de triazol por poço.

Incubar os géis durante três minutos após a incubação. Remova a solução de triazol para armazenamento em um tubo de microcentrífuga. A lavagem completa das lamínulas após a adição de A-P-T-M-S é uma etapa importante na produção de lamínulas reativas.

As lamínulas devidamente lavadas e secas estão livres de qualquer resíduo de precipitado. A-P-T-M-S reagirá com o glutaraldeído e produzirá um precipitado branco turvo. Se o precipitado, todo o procedimento deve ser repetido, pois a lamínula não é mais utilizável.

Após a formação do hidrogel e o revestimento com proteínas ECM, as células durante a noite são semeadas. Há uma diferença distinta entre as células que se espalham em hidrogéis rígidos versus moles, como pode ser visto pelo foid na coloração, e as células de fibroblastos embrionários de camundongos se espalham em maior extensão em células rígidas em comparação com os hidrogéis moles. De fato, a maioria das células que se ligam a um hidrogel macio permanecerá compacta e se ligará com menos eficiência.

Os resultados quantitativos representativos de PCR dos níveis de mRNA do ciclagem de D one em fibroblastos embrionários de camundongos mostram que o ciclagem de D one é significativamente regulado positivamente em uma matriz rígida, mas não em uma matriz mole. Isso sugere que a rigidez da matriz regula a progressão do ciclo celular in vitro. Acabamos de mostrar como gerar rigidez de corte de hidrogel, modelando condições fisiológicas in vivo Ao fazer este procedimento é importante lembrar de fazer lamínulas reativas extras, pois ocorrerão acidentes e erros.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.