Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida

O objetivo geral deste procedimento é permitir um preparo rápido, eficiente e econômico de géis de poliacrilamida em formato de placa de múltiplos poços. Isso é realizado primeiramente colocando a solução precursora do gel entre uma placa de vidro revestida com camada hidrofóbica e um suporte plástico flexível adesivo à acrilamida. O segundo passo consiste em destacar o gel da placa de vidro, que após a polimerização fica covalentemente ligado ao suporte plástico flexível, e deixá-lo secar.

Em seguida, o gel seco e o suporte plástico flexível subjacente são cortados nas formas desejadas e colados com o lado plástico voltado para baixo nos fundos de poços de uma placa de múltiplos poços ou qualquer outro recipiente para cultivo celular. O passo final é revestir os géis de poliacrilamida montados na placa de múltiplos poços com um revestimento adesivo para células, como uma monocamada de colágeno tipo I. Por fim, a microscopia, bem como outras técnicas de caracterização celular, são utilizadas para observar o efeito do substrato de poliacrilamida subjacente.

Em particular, sua rigidez sobre os comportamentos celulares. A principal vantagem deste método em relação aos métodos existentes é que ele permite o manuseio de qualquer rigidez e espessura de géis poliméricos, bem como sua montagem em formato de placa de múltiplos poços, de maneira econômica e eficiente em termos de tempo, o que não é oferecido por outros métodos. A demonstração do procedimento será realizada por um aluno em meu laboratório.

Primeiro, prepare a solução precursora de poliacrilamida misturando acrilamida, o agente reticulante bis-acrilamida e água desionizada. Dissolva Sul OPA em dimetilsulfóxido a 50 miligramas por mililitro. Aliquote 20 microlitros da solução estoque em 10 tubos de microcentrífuga. Em seguida, congele rapidamente as soluções em nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius.

Em seguida, dissolva o peroximonio de amônio em água deionizada para obter uma concentração final de peroximonio de amônio de 10% peso por volume. Aliquote 25 microlitros da solução de peroximonio de amônio em 10 tubos de microcentrífuga e armazene a -20 graus Celsius. Prepare uma solução de colágeno a 0,2 miligramas por mililitro diluindo a solução estoque de colágeno tipo I em 1x PBS a pH 7,4.

Todas as soluções são mantidas em gelo até o uso. Neste ponto, coloque algumas gotas de uma solução hidrofóbica sobre uma placa de vidro e use papel-toalha para espalhar pela superfície. Após deixar a placa secar ao ar, passe novamente papel-toalha para uniformizar o revestimento hidrofóbico.

Corte um suporte de plástico flexível para que corresponda ao tamanho da placa de vidro com revestimento hidrofóbico. Em seguida, marque o lado hidrofóbico do suporte de plástico flexível fazendo um leve arranhão na superfície com uma ferramenta pontiaguda, como um bisturi. Para o preparo do gel, adicione 4972,5 µL de solução precursora de poliacrilamida na concentração final desejada em um tubo cônico de 50 mililitros.

Coloque o tubo em uma câmara de desgaseificação por 30 minutos com a tampa aberta. Em seguida, adicione 25 microlitros da solução previamente preparada de persulfato de amônio à solução de gel de DGAs para obter uma concentração final de persulfato de amônio de 0,05%. Então, adicione 2,5 microlitros de TM me para atingir uma concentração final de TM ME de 0,5%. Misture a solução suavemente pipetando para cima e para baixo de três a cinco vezes. Em seguida, coloque espaçadores de silicone da espessura desejada no lado hidrofílico do suporte plástico flexível.

Em seguida, pipete a solução do gel sobre o suporte plástico flexível entre os espaçadores e monte um sanduíche com uma lâmina de vidro revestida hidrofóbica voltada para cima. Após deixar o gel polimerizar por 45 minutos, retire cuidadosamente o suporte plástico flexível com o gel de poliacrilamida covalentemente ligado na superfície e posicione-o com a face do gel voltada para cima para secar ao ar. Após a secagem, corte o gel de poliacrilamida nas formas desejadas.

Prepare aproximadamente 500 microlitros de polimetil soano por placa de 96 poços, conforme as instruções do fabricante, para colar os géis ao fundo de uma placa de múltiplos poços. Coloque uma pequena gota de polimetil soano no centro de cada poço utilizando pinças. Coloque um gel de poliacrilamida em cada suporte plástico flexível com o lado voltado para baixo.

Após curar o poli(dimetilsiloxano), coloque uma pequena quantidade da celulose sampa previamente preparada em cada poço com uma pipeta de transferência e agite de um lado para o outro para revestir uniformemente a superfície do gel. Coloque a placa de poços sob uma lâmpada UV de alta intensidade por cinco minutos. Ao finalizar, enxágue os géis com PBS para remover o excesso de celulose.

Em seguida, pipete cerca de 50 microlitros da solução previamente preparada de colágeno tipo I para cada poço. Deixe a placa coberta em temperatura ambiente por pelo menos duas horas após a lavagem com PBS para remover o excesso de solução de colágeno. Esterilize os géis sob luz UV em uma cabine de cultura de tecidos por duas horas.

Por fim, deixe os géis de molho em meio completo durante a noite para hidratar e equilibrar. Utilize os géis para semeadura celular imediatamente ou armazene-os na geladeira por até dois dias. O módulo de Young em função de várias concentrações de acrilamida e bis-acrilamida, designadas como A e B respectivamente, é mostrado aqui conforme esperado.

O módulo de armazenamento G linha e o módulo de perda G duas linhas são independentes da frequência. Também foi confirmado que a secagem e posterior reidratação dos géis não afetou seu módulo de Young. Ao utilizar o reticulante Sulo sampa, pode-se obter um revestimento uniforme de colágeno em hidrogéis de qualquer rigidez.

Observou-se que, quando semeadas em géis de poliacrilamida por 24 horas, as células de câncer de mama M-D-A-M-B 2 31 permaneceram arredondadas nos géis macios de 0,5 e um quilo pascal, mas foram capazes de se espalhar e alongar no gel rígido de 100 quilo pascal. Além disso, os hidrogéis confeccionados sobre o suporte plástico flexível são transparentes e permitem fácil visualização e microscopia. Além disso, o suporte plástico flexível não apresenta autofluorescência e, portanto, não interfere na obtenção de imagens de células marcadas com fluorescência.

A morfologia celular foi ainda quantificada em termos de área total de espalhamento celular e circularidade celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar de forma eficiente e econômica géis de poliamida em formato de placa de múltiplas poças. Para o estudo da biologia celular dependente de rigidez.