Name: Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a preparar géis de poliacrilamida em formato de placa multipocas para estudar respostas celulares dependentes de rigidez. Este método rápido e econômico facilita pesquisas em biologia celular sem equipamentos especializados.

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Este trabalho foi financiado por fundos iniciais fornecidos à Dra. Silviya Zustiak pela Universidade de Saint Louis, bem como por uma bolsa do Fundo de Pesquisa do Presidente (PRF) concedida à Dra. Silviya Zustiak pela Universidade de Saint Louis. Agradecemos a Naveed Ahmed e Keval Shah pela assistência técnica.

1. Preparação de Soluções de Hidrogel Alíquotas e associadas <ol><li> Preparação da solução precursora de gel de poliacrilamida. <ol><li> Preparar solução precursora em gel de poliacrilamida através da mistura de acrilamida (A) (40% w / v, M r 71,08 g / mol), a bisacrilamida reticulador (B) (2% w / v, r M 154,17 g / mol), e de- água ionizada nos percentuais de volume especificados na Tabela 1. NOTA: Estas soluções podem ser preparadas em grandes lotes e guardadas a 4 ° C durante até vários meses. <ol><li> ATENÇÃO: A acrilamida é tóxico por inalação ou ingestão, particularmente, quando em forma de pó: assim, de preferência, utilizar 40% w solução / v para reduzir os riscos de toxicidade. Manusear somente enquanto vestindo roupas de proteção, como luvas, óculos de proteção e um jaleco. Guarde em um recipiente resistente à luz, bem fechado na geladeira (&lt;23 ° C, área bem ventilada). </li><li> CUIDADO: bis-acrilamida é tóxico por inalação ou ingestão, particularmente,quando na forma de pó: assim, utilizar de preferência 2% w solução / v para reduzir os riscos de toxicidade. Manusear somente enquanto vestindo roupas de proteção, como luvas, óculos de proteção e um jaleco. Guarde em um recipiente resistente à luz, bem fechado na geladeira (&lt;4 ° C, área bem ventilada). </li></ol></li></ol></li><li> Preparação e utilização de N -Sulfosuccinimidyl-6- (4&#39;-azido-2&#39;-nitrofenilamino) hexanoato (sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) alíquotas. CUIDADO: Sulfo- SANPAH causa irritação ocular grave; lidar com luvas e adequada para os olhos ou a protecção face. Armazenar a -20 ° C após o recebimento e antes de alíquotas. <ol><li> Para armazenar sulfo-SANPAH: dissolver Sulfo-SANPAH em dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Alíquota da solução estoque em tubos de centrífuga de 50 micro de 20 ul por tubo. Congelamento flash em gelo seco ou em azoto líquido (um passo opcional, mas preferido para preservar a máxima eficiência reticulador) e armazenar a -80 ° C. NOTA: As alíquotas can ser armazenados durante vários meses. </li><li> Para utilizar sulfo-SANPAH: descongelar o brevemente aliquota e diluída em 480 ul de água desionizada. Use imediatamente. Sulfo- SANPAH hidrolisa rapidamente em água; por isso tome cuidado para realizar todas as etapas acima rapidamente. </li></ol></li><li> Preparação de persulfato de amónio (Mr 228,18 g / mol) alíquotas. NOTA: persulfato de amónio causa dos olhos, pele e irritação das vias respiratórias. Use equipamento de proteção individual adequados ao manusear. Pega de persulfato de amónio em pó em um exaustor química. Pó Armazenar em local seco, bem ventilado. Uma vez aliquotas, a solução diluída pode ser utilizada na bancada de trabalho. <ol><li> Dissolve-se o persulfato de amónio em água desionizada para se obter uma concentração final de persulfato de amónio de 10% w / v. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Descongelar imediatamente antes da utilização. </li></ol></li><li> Preparação de colágeno tipo I solução. <ol><li> Preparar solução de colagénio a 0,2 mg / ml por diluição do stock assimlução em 1x tampão fosfato salino (PBS) de pH 7,4. Guarde em breve gelo ou usar imediatamente após a diluição. </li></ol></li></ol> 2. Preparação Hidrogel (Veja a Figura 1) <ol><li> Preparação das lâminas de vidro hidrofóbicas. <ol><li> Coloque algumas gotas de uma solução hidrofóbica sobre uma placa de vidro e usar papel de seda para se espalhar por toda a superfície. Deixe o ar seco e limpe com um lenço de papel novamente para uniformizar o revestimento hidrofóbico. NOTA: Loja solução hidrofóbica em um gabinete inflamável à temperatura ambiente. Use equipamento de proteção individual ao manusear. Trabalhar em uma área bem ventilada. </li></ol></li><li> Preparação do suporte de plástico flexível. <ol><li> Cortar o suporte de plástico flexível para corresponder ao tamanho da placa de vidro com revestimento hidrofóbico. </li><li> Marcar o lado hidrofóbico do suporte de plástico flexível, arranhando a superfície levemente com uma ferramenta afiada, como um bisturi. NOTA: Uma vez que o gel - que é totalmente transparente - Seca, As marcas de arranhões vai ajudar a distinguir de que lado o apoio de plástico flexível contém o gel. NOTA: O suporte de plástico flexível tem um lado hidrofóbico e um hidrofílico. Uma vez depositado, poliacrilamida adere permanentemente ao lado hidrofílica do suporte de plástico que facilita o manuseio fácil hidrogel subseqüente. </li></ol></li><li> Preparação de Gel (exemplo volumes são dados para 5 ml de soluções precursoras de gel). NOTA: 5 ml seria suficiente para produzir 40 ~ géis quando a espessura inicial de gel é de 0,5 mm. Mais géis podem ser produzidos, se a espessura do gel é reduzida. <ol><li> Colocar 4972,5 ul de solução precursora de poliacrilamida de concentração final desejada (Tabela 1) para um tubo de 50 ml. Colocar em uma câmara de desgaseificação durante 30 minutos, com a tampa aberta. NOTA: O oxigênio age como uma armadilha de radicais livres e, quando presente, ele inibe a polimerização. </li><li> Adicionar 25 ul de 10% w / v de persulfato de amónio (ver ponto 1.3) para alcançar a solução definitivapersulfato de amónio concentração de 0,05%. </li><li> Adicionar 2,5 mL de N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilenodiamina (TEMED, M r 116,24 g / mol) para a solução de gel desgaseificado para obter uma concentração de TEMED final de 0,5%. NOTA: Loja TEMED em um gabinete inflamável à temperatura ambiente. Manusear de um fume hood química quando vestindo equipamentos de proteção individual adequados. Manter hermeticamente fechada sob um gás inerte, uma vez que é altamente sensível à humidade e ar. </li><li> Misture a solução suavemente por pipetagem cima e para baixo 3-5 vezes. Não vórtice para evitar a difusão do oxigênio na solução precursor gel. </li><li> Pipeta a solução de gel para o lado hidrofílica do suporte de plástico flexível e sanduíche com hidrofóbica revestido lâmina de vidro. Separa-se as duas lâminas com espaçadores de silicone de espessura desejada (por exemplo, 0,5 mm). Deixar um pequena quantidade (~ 100 mL) de solução de precursor de polímero no tubo de 50 ml para usar como um indicador de gelificação. NOTA:Qualquer espaçador pode ser utilizado. Por exemplo, uma única tira de Parafilm dá uma espessura de gel inchado definitiva entre 100 - 120 um. </li><li> Coloque outra placa de vidro em cima do sanduíche apoio / gel de plástico flexível para averiguar uma superfície uniforme hidrogel após polimerização. </li><li> Deixe o gel polimerizar durante 45 minutos, embora menos tempo pode ser usado para géis de maior% em peso, se desejado. Para verificar se o gel tenha polimerizado, observar a solução restante no tubo de 50 ml; se a solução restante foi gelificada, então é provável que a gelificação na placa de vidro ter sido iniciado assim. No entanto, note que a abertura prematura do molde vai evitar a polimerização completa. </li><li> Uma vez formado o gel, retire o suporte de plástico flexível com o gel de poliacrilamida covalentemente ligado no topo, e do lado do gel de definir-se secar ao ar. NOTA: convecção de calor ou de secagem também podem ser utilizados para acelerar este passo. Depois secou-se sobre o suporte de plástico flexível, o gel pode ser lojad indefinidamente. <ol><li> Marcar algum ponto desencapado do suporte de plástico flexível, onde géis de poliacrilamida não formam devido a bolhas. Mark, enquanto o gel ainda é hidratado, pois isso vai misturar-se com o apoio de plástico flexível, uma vez que o gel é seco. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Assembléia Multiwell Plate, Collagen Coating, e Esterilização <ol><li> Conjunto da placa Multiwell. <ol><li> Uma vez seca, cortada géis PA nas formas desejadas. <ol><li> Para uma placa de 96 poços, usar um furador pesado com um diâmetro de ~ 6 mm. Use um cortador de papel pesados ​​para cortar géis em formas quadradas ou retangulares. Como alternativa, use uma tesoura. </li></ol></li><li> Prepare a cerca de 500 ul de PDMS por placa de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. Para os geles de cola para a parte inferior de uma placa com múltiplas cavidades, colocar uma pequena gota (~ 5 mL) de polidimetilsiloxano (PDMS) no centro de cada poço a. Utilizando uma pinça, coloque uma poliacrilamidae gel em cada lado de suporte de plástico bem, flexível para baixo. Para permitir que o PDMS para curar, deixar a placa montada a 37 ° C durante um mínimo de 4 h. </li></ol></li><li> Revestimento de colagénio de géis de poliacrilamida. <ol><li> Com uma pipeta de transferência, coloque uma pequena quantidade (7-8 ul) de sulfo-SANPAH (vide ponto 1.2.2) em cada poço e redemoinho de lado a lado para revestir a superfície do gel uniformemente. Trabalhe rapidamente desde sulfo-SANPAH não é estável em água. </li><li> Colocar a placa bem sob uma lâmpada de UV de alta intensidade (intensidade = 37 mW, λ = 302-365 nm) durante 5 min. Lavar os géis com PBS para remover o excesso de sulfo-SANPAH. </li><li> Pipetar 50 ul de 0,2 mg / ml de colagénio tipo I solução (ver ponto 1.4) em cada poço. Deixar a placa coberta à temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas ou O / N a 4 ° C. NOTA: Para acelerar o processo de revestimento de colagénio, uma pipeta de transferência pode ser usado para adicionar a solução de colagénio. Tipicamente, 1-2 gotas da solução deve ser suficiente para completarly cobrir a superfície do gel. </li><li> Deixar a placa com cavidades à temperatura ambiente durante pelo menos 2 h, para permitir a ligação do colagénio. </li><li> Lavar com PBS para remover o excesso de solução de colagénio e esterilizar sob UV (λ = 200 nm) num capuz de cultura de tecido durante 2 horas. </li><li> Mergulhe os géis em meio completo (veja seção 4.1 para médias composição) O / N para hidratar e equilibrar. Use para celular semear imediatamente ou guarde na geladeira por até 2 dias. </li></ol></li></ol> 4. Sementeira celular no PA Rigidez Assay NOTA: Embora típico para linhas de células de mamíferos comuns, o protocolo apresentado nesta seção é usado especificamente com o câncer de mama linha de células MDA-MB-231 (ver Figuras 4 e 5). <ol><li> Recolher as células a partir de frascos de cultura de tecidos por exposição a 5% de tripsina / EDTA durante 5 minutos a 37 ° C. Use ~ 80 mL de tripsina / EDTA por cada cm 2 de área garrafa de cultura; por exemplo, utilizar 2 ml de tripsina / EDTA fora T25 frasco de cultura de células. Re-suspender as células recolhidas em meio completo suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina a uma concentração celular final desejado. Tendo em conta o tempo de duplicação celular, bem como a duração do tempo as células serão semeadas no ensaio, escolher uma concentração de células sub-confluente apropriado. Certifique-se de que o meio adicionado é o suficiente para submergir completamente os hidrogéis. NOTA: Uma vez que os hidrogéis foram pré-equilibrada em mídia (consulte a etapa 3.2.6) 100 mL de volume deve ser suficiente. Os volumes médios típicos usados ​​para placas com múltiplas cavidades deve ser suficiente uma vez que os geles tenham sido pré-equilibrada em meios na etapa anterior. NOTA: O ensaio seria adequado para qualquer tipo de célula dependente de fixação. <ol><li> Contar o número de células em microscópio invertido usando um hemocitômetro. Carga de 10 ul de suspensão de células em cada porta de hemacitómetro e a média da contagem de células a partir de, pelo menos, 8 quadrantes. Para obter oconcentração celular final, multiplicar o número de células por 10 4. NOTA: Os melhores resultados de contagem de células são obtidos quando o número de células em cada quadrante hemacitï¿½etro é 20-50. </li></ol></li><li> Cultura das células para o ensaio de rigidez PA em um incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO 2. Mudança de mídia a cada 2-3 dias. Recolher as células, quando necessário por exposição a 5% de tripsina / EDTA a 37 ° C durante 5 min. Use ~ 80 mL de tripsina / EDTA por cm2 de garrafa de cultura de tecidos. Durante todas as etapas de manipulação celular, ter um cuidado especial para não perturbar a superfície do hidrogel: aspirado ou médio pipeta ligeiramente derrubando a placa com vários poços de lado e tocar a ponta da pipeta na parede lateral de cada bem, ao contrário de tocar o hidrogel. NOTA: Com excepção para tomar especial cuidado para não danificar a superfície do hidrogel durante a manipulação padrão de cultura de tecidos, as células semearam-se sobre o ensaio de rigidez podem ser manipulados da mesma maneira como se eles foram semeadas sobrepara uma placa com múltiplas cavidades regulares. </li></ol> 5. imagens de células semeadas em PA Rigidez Assay <ol><li> Células de imagem diretamente sobre o ensaio de rigidez PA. NOTA: Qualquer microscópio - invertido, fluorescente, ou confocal, pode ser usado para imagens de células. NOTA: O suporte de plástico flexível utilizado para construir o ensaio de rigidez é totalmente transparente e não autofluoresce ou interferir com imagens de células. No entanto, apesar de o próprio suporte de plástico flexível é transparente, capacidades de imagem será limitada pela distância de trabalho do objectivo. O suporte de plástico flexível tem uma espessura de 0,23 mm e uma distância de trabalho típico de uma objectiva 10X é ~ a 4 mm, para diminuir acentuadamente maiores ampliações. <ol><li> Para imagens de células vivas, a posição de ensaio de rigidez PA no suporte da placa de microscópio e imagem. Mantenha as sessões de imagem com menos de 2 horas, ou usar um microscópio equipado com uma câmara ambiental para tempos mais longos de imagem. </li><li> Quando estou de células vivasenvelhecimento não é o objetivo, corrigir as células em solução de formaldeído 4% suplementado com 0,1% de detergente. Soak células em fixador à temperatura ambiente durante um mínimo de 2 horas. Enxágüe com PBS duas vezes. Descarte de resíduos fixador em um recipiente de resíduos designada. NOTA: As células podem ser visualizados de imediato ou armazenados submersa em PBS a 4 ° C durante até 2 semanas. CUIDADO: O formaldeído é tóxico por inalação e contato. Manusear com luvas em uma coifa química. NOTA: protocolo de fixação celular tem que ser escolhido com base nos coloração celular e manipulação de protocolos posteriores, porque certos fixadores danificar algumas proteínas celulares. </li><li> No caso da imagiologia fluorescente, mancha células com coloração de células desejada directamente na placa com múltiplas cavidades fixo. Imagem imediatamente. </li></ol></li></ol>

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<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+substrate+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review.+E%2C+Statistical%2C+nonlinear%2C+and+soft+matter+physics%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of substrate thickness.</a> Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918(2010).</li>
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<li>Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+force+microscopy+on+elastic+layers+of+finite+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness.</a> Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Geles de poliacrilamida, originalmente desenvolvidos para electroforese, 28 são rotineiramente utilizados como substratos de cultura celular para estudar os efeitos de rigidez do substrato sobre a morfologia celular, motilidade, 3,24,29 e comunicação entre outras características celulares. Poliacrilamida permite a manipulação de rigidez do substrato para abranger a rigidez de todos os tecidos moles do corpo (0,3-300 kPa) 1 com uma simples mudança na concentração de precursor de polímero ...

A maioria dos tecidos do corpo são materiais viscoelásticos moles com um módulo de Young na gama de 0,1 kPa para o cérebro a 100 kPa durante cartilagem mole, ainda, a maior parte da investigação de células in vitro é realizada em culturas de tecidos de poliestireno (TCP), que tem um módulo de ~ 1 GPa . 1 Esse descompasso rigidez afeta significativamente a forma como as células respondem ao seu meio ambiente. Um crescente corpo de pesquisa é, assim, dedicado a elucidar o efeito de rigidez do substrato sobre o destino de vários tipos de células, incluindo células estaminais 2,3 4 Como resultado., Vários hidrogéis têm sido desenvolvidos para auxiliar no entendimento de células dependente de rigidez biologia incluindo poliacrilamida (PA), 5-7 polietileno glicol (PEG), 8,9 polidimetilsiloxano (PDMS), 10 e 11 de alginato. Embora a evidência de que a rigidez substrato tem um impacto substancial sobre o destino celular está crescendo, a maioria dos estudos são realizados em uma pequena escala com um pequeno número de samples. Multidimensionais, estudos sistemáticos sobre o efeito da rigidez substrato para uma variedade de tipos de células ou condições ambientais são raros. 12 Várias tecnologias de hidrogel de alto rendimento promissoras foram desenvolvidas, incluindo microarranjos baseados em PEG, 13 dispositivos microfluídicos para a produção de microesferas de agarose de hidrogel, 14 ou micro e nano-hastes onde rigidez é modulada pelo diâmetro e altura das microrods. 15 No entanto , as tecnologias para preparar tais substratos são sofisticados e disponível para um número limitado de laboratórios. Muita pesquisa envolvendo rigidez modulado respostas das células utiliza poliacrilamida (PA) géis que não só são baratos e simples de implementar, mas também exibem uma gama fisiologicamente relevante de módulo de Young, a saber, 0,3 -. 300 kPa 16-22 No entanto, os métodos existentes para fabricar PA géis para cultura de células são intensivos de trabalho e, consequentemente, prepared em pequenos lotes. Algumas das dificuldades associadas com a preparação de géis PA como substratos de células-tronco a partir da exigência de que os géis tem que estar preparado: 1) na ausência de oxigênio para permitir a polimerização completa, 2) com uma superfície plana e lisa para permitir a célula uniforme ligação e de espalhamento, e 3) fixada permanentemente na parte inferior da placa de cultura de células para prevenir flutuação. Diversos grupos tentaram produzir géis PA para cultura de células em grandes lotes. Semler et al., Folhas de espessura preparados de géis de PA, que foram depois &quot;cortado&quot; com um furador e colocadas em placas de 96 poços. 23 No entanto, este método está limitado a géis mais duras, ou seja,&gt; 1 kPa no módulo de Young, porque mais suave géis são &quot;pegajoso&quot;, difícil de cortar, e facilmente danificada. Mih et ai. Desenvolveram uma técnica mais sofisticado que permite que os géis a ser polimerizado directamente em uma placa com múltiplas cavidades com fundo de vidro. <sup&gt; 6 Isto foi conseguido através de derramamento as soluções de gel em placas com fundo de vidro funcionalizados e formando géis por &quot;imprensando-los&quot; com uma matriz lamela personalizado. 6 embora muito promissores, efeitos ligeira vantagem ainda foram observados com esta técnica. Além disso, a técnica requer uma matriz de design personalizado não imediatamente acessível para muitos laboratórios, bem como placas com múltiplas cavidades com fundo de vidro caros. Este artigo descreve uma maneira simples e barata para montar géis PA em um prato com vários poços que poderiam ser facilmente adotado por qualquer laboratório. Aqui, um suporte de plástico flexível é utilizado, que tem dois lados - um um hidrofóbico, que é repelente para géis de PA, e um uma hidrofílica, que liga covalentemente o gel PA sobre deposição. Uma vez que as folhas de gel de PA são depositados e permanentemente fixo ao suporte de plástico flexível, que permite manipular géis de qualquer espessura ou rigidez e cortando-os em qualquer forma desejada. Este aproxoach não só produz personalizados lamelas &#39;&#39; plásticas em tamanhos não anteriormente disponíveis no mercado, mas também elimina a necessidade de superfícies de vidro-tratamento pré, quer lamelas de vidro ou os poços de placas de múltiplos poços com fundo de vidro caros, com uma solução de ligação PA, que é uma tediosa e um passo consumidor de tempo. Finalmente, as folhas de geles uniformes PA pode ser preparado em grandes lotes e armazenados de-hidratado durante vários meses. Em resumo, o ensaio aqui apresentado constitui uma melhoria em relação aos métodos existentes em vários aspectos. Em primeiro lugar, o processo de montagem de placa de poços múltiplos é eficaz, e o custo global dos materiais necessários é baixo. Em segundo lugar, os hidrogéis são produzidas em grandes lotes de um único filme em gel homogénea. Finalmente, apenas os materiais que se encontram comercialmente disponíveis são necessários. A utilidade do ensaio é ilustrada a explorar o efeito da rigidez do substrato na morfologia celular e a área de difusão.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>40% Acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis-acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-07000</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo 1, de cauda de rato, 3,68 mg/ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Solução hidrofóbica &#8212; Repel Silane</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Polidimesilsiloxano (PDMS) [Kit de Elastômero Slygard 182]</td><td>Adesivos Elsworth</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tyrpsin/EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44174</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Médio (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Detergente: Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído a 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Kit de bloqueio de adesão celular baseado em BSA &#8212; Kit de Matriz de Adesão de Células ECM</td><td>Chemicon International</td><td>ECM540</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento de laboratório descartável</td></tr><tr><td>suporte de plástico flexível &#8212; Filme GelBond PAG para Géis de Poliacrilamida</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>309819</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Vidro</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>3181345107</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 ml</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 ml: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços (fundo plano)</td><td>Pipetas</td><td>Descartáveis 12565501</td><td></td>Fisher</tr><tr><td>Scientific (1&nbsp; ml, 2&nbsp; ml, 5&nbsp; ml, 10&nbsp; ml, 25&nbsp; ml, 50&nbsp; ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 ml: 13-678-11B, 2&nbsp; ml: 05214038, 5&nbsp; ml (FALCÃO): 357529, 10&nbsp; ml: 13-678-11E, 25&nbsp; ML: 13-678-11, 50&nbsp; ml: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Transferência de Vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta (1-200&nbsp; &#956; l, 101-1000&nbsp; &#956; l)</td> <td>Pipetas</td><td></td> de Transferência Descartáveis Padrão de Plástico 2707509 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>Parafilm</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PARAFILM PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Luvas de exame sem pó</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Espaçadores de silicone &#8212; Folha de silicone, 0,5 mm de espessura/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0,5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento de laboratório grande/não descartável</td></tr><tr><td>Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Forno UV</td><td>UVITRON</td><td>UV1080</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de vácuo/desgaseificador</td><td>BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo para desgaseificador</td><td>KNF Lab</td><td>5097482</td><td></td></tr><tr><td>Capa de cultura de tecidos</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Capela-exaustão química</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Auxiliar de pipeta</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetro</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr></tbody></table>

simples multiwell rigidez ensaio para o estudo das respostas das células rigidez dependentes base de poliacrilamida

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Atualmente, a maior parte da pesquisa celular in vitro é realizada em poliestireno rígido de cultura de tecidos (~ 1 GPa), enquanto a maioria das células do corpo está ligada a uma matriz elástica e muito mais macia (0,1 - 100 kPa). Uma vez que essa incompatibilidade de rigidez afeta muito as respostas celulares, há um forte interesse no desenvolvimento de materiais de hidrogel que abranjam uma ampla gama de rigidez para servir como substratos celulares. Os géis de poliacrilamida, que são baratos e cobrem a faixa de rigidez de todos os tecidos moles do corpo, são o hidrogel preferido de muitos grupos de pesquisa. No entanto, a preparação do gel de poliacrilamida é demorada, tediosa e adequada apenas para pequenos lotes. Aqui, descrevemos um ensaio que, utilizando um filme plástico flexível permanente como suporte estrutural para os géis, permite a preparação de géis de poliacrilamida em um formato de placa multipoços. A técnica é mais rápida, mais eficiente e menos dispendiosa do que os métodos atuais e permite a preparação de géis de tamanhos personalizados não disponíveis de outra forma. Como não requer nenhum equipamento especializado, o método poderia ser facilmente adotado por qualquer laboratório de pesquisa e seria particularmente útil em pesquisas focadas na compreensão das respostas celulares dependentes da rigidez.

Poliacrilamida (PA) hidrogéis são amplamente usadas para testar as respostas celulares dependentes de rigidez. 17,24 por mistura de várias concentrações de acrilamida (A) e bis-acrilamida (B) pode-se fazer géis PA que abrangem a gama de rigidez da maioria dos tecidos moles em o corpo - 0,3 -.. 300 módulo de kPa Jovem 1 No entanto, a preparação de géis de poliacrilamida é tedioso e demorado, muitas vezes limitando a sua utilidade em aplicações &quot;high-throughput&quot;, como para a seleção exemplo...

Aqui, é descrito um método que permite a preparação rápida, eficiente e barata de géis de poliacrilamida em um formato de placa multipoços. O método não requer nenhum equipamento especializado e pode ser facilmente adotado por qualquer laboratório de pesquisa. Seria particularmente útil em pesquisas focadas na compreensão das respostas celulares dependentes da rigidez.

Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

O objetivo geral deste procedimento é permitir um preparo rápido, eficiente e econômico de géis de poliacrilamida em formato de placa de múltiplos poços. Isso é realizado primeiramente colocando a solução precursora do gel entre uma placa de vidro revestida com camada hidrofóbica e um suporte plástico flexível adesivo à acrilamida. O segundo passo consiste em destacar o gel da placa de vidro, que após a polimerização fica covalentemente ligado ao suporte plástico flexível, e deixá-lo secar.Em seguida, o gel seco e o suporte plástico flexível subjacente são cortados nas formas desejadas e colados com o lado plástico voltado para baixo nos fundos de poços de uma placa de múltiplos poços ou qualquer outro recipiente para cultivo celular. O passo final é revestir os géis de poliacrilamida montados na placa de múltiplos poços com um revestimento adesivo para células, como uma monocamada de colágeno tipo I. Por fim, a microscopia, bem como outras técnicas de caracterização celular, são utilizadas para observar o efeito do substrato de poliacrilamida subjacente.Em particular, sua rigidez sobre os comportamentos celulares. A principal vantagem deste método em relação aos métodos existentes é que ele permite o manuseio de qualquer rigidez e espessura de géis poliméricos, bem como sua montagem em formato de placa de múltiplos poços, de maneira econômica e eficiente em termos de tempo, o que não é oferecido por outros métodos. A demonstração do procedimento será realizada por um aluno em meu laboratório.Primeiro, prepare a solução precursora de poliacrilamida misturando acrilamida, o agente reticulante bis-acrilamida e água desionizada. Dissolva Sul OPA em dimetilsulfóxido a 50 miligramas por mililitro. Aliquote 20 microlitros da solução estoque em 10 tubos de microcentrífuga. Em seguida, congele rapidamente as soluções em nitrogênio líquido e armazene a menos 80 graus Celsius.Em seguida, dissolva o peroximonio de amônio em água deionizada para obter uma concentração final de peroximonio de amônio de 10% peso por volume. Aliquote 25 microlitros da solução de peroximonio de amônio em 10 tubos de microcentrífuga e armazene a -20 graus Celsius. Prepare uma solução de colágeno a 0,2 miligramas por mililitro diluindo a solução estoque de colágeno tipo I em 1x PBS a pH 7,4.Todas as soluções são mantidas em gelo até o uso. Neste ponto, coloque algumas gotas de uma solução hidrofóbica sobre uma placa de vidro e use papel-toalha para espalhar pela superfície. Após deixar a placa secar ao ar, passe novamente papel-toalha para uniformizar o revestimento hidrofóbico.Corte um suporte de plástico flexível para que corresponda ao tamanho da placa de vidro com revestimento hidrofóbico. Em seguida, marque o lado hidrofóbico do suporte de plástico flexível fazendo um leve arranhão na superfície com uma ferramenta pontiaguda, como um bisturi. Para o preparo do gel, adicione 4972,5 µL de solução precursora de poliacrilamida na concentração final desejada em um tubo cônico de 50 mililitros.Coloque o tubo em uma câmara de desgaseificação por 30 minutos com a tampa aberta. Em seguida, adicione 25 microlitros da solução previamente preparada de persulfato de amônio à solução de gel de DGAs para obter uma concentração final de persulfato de amônio de 0,05%. Então, adicione 2,5 microlitros de TM me para atingir uma concentração final de TM ME de 0,5%. Misture a solução suavemente pipetando para cima e para baixo de três a cinco vezes. Em seguida, coloque espaçadores de silicone da espessura desejada no lado hidrofílico do suporte plástico flexível.Em seguida, pipete a solução do gel sobre o suporte plástico flexível entre os espaçadores e monte um sanduíche com uma lâmina de vidro revestida hidrofóbica voltada para cima. Após deixar o gel polimerizar por 45 minutos, retire cuidadosamente o suporte plástico flexível com o gel de poliacrilamida covalentemente ligado na superfície e posicione-o com a face do gel voltada para cima para secar ao ar. Após a secagem, corte o gel de poliacrilamida nas formas desejadas.Prepare aproximadamente 500 microlitros de polimetil soano por placa de 96 poços, conforme as instruções do fabricante, para colar os géis ao fundo de uma placa de múltiplos poços. Coloque uma pequena gota de polimetil soano no centro de cada poço utilizando pinças. Coloque um gel de poliacrilamida em cada suporte plástico flexível com o lado voltado para baixo.Após curar o poli(dimetilsiloxano), coloque uma pequena quantidade da celulose sampa previamente preparada em cada poço com uma pipeta de transferência e agite de um lado para o outro para revestir uniformemente a superfície do gel. Coloque a placa de poços sob uma lâmpada UV de alta intensidade por cinco minutos. Ao finalizar, enxágue os géis com PBS para remover o excesso de celulose.Em seguida, pipete cerca de 50 microlitros da solução previamente preparada de colágeno tipo I para cada poço. Deixe a placa coberta em temperatura ambiente por pelo menos duas horas após a lavagem com PBS para remover o excesso de solução de colágeno. Esterilize os géis sob luz UV em uma cabine de cultura de tecidos por duas horas.Por fim, deixe os géis de molho em meio completo durante a noite para hidratar e equilibrar. Utilize os géis para semeadura celular imediatamente ou armazene-os na geladeira por até dois dias. O módulo de Young em função de várias concentrações de acrilamida e bis-acrilamida, designadas como A e B respectivamente, é mostrado aqui conforme esperado.O módulo de armazenamento G linha e o módulo de perda G duas linhas são independentes da frequência. Também foi confirmado que a secagem e posterior reidratação dos géis não afetou seu módulo de Young. Ao utilizar o reticulante Sulo sampa, pode-se obter um revestimento uniforme de colágeno em hidrogéis de qualquer rigidez.Observou-se que, quando semeadas em géis de poliacrilamida por 24 horas, as células de câncer de mama M-D-A-M-B 2 31 permaneceram arredondadas nos géis macios de 0,5 e um quilo pascal, mas foram capazes de se espalhar e alongar no gel rígido de 100 quilo pascal. Além disso, os hidrogéis confeccionados sobre o suporte plástico flexível são transparentes e permitem fácil visualização e microscopia. Além disso, o suporte plástico flexível não apresenta autofluorescência e, portanto, não interfere na obtenção de imagens de células marcadas com fluorescência.A morfologia celular foi ainda quantificada em termos de área total de espalhamento celular e circularidade celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar de forma eficiente e econômica géis de poliamida em formato de placa de múltiplas poças. Para o estudo da biologia celular dependente de rigidez.

simple-polyacrylamide-based-multiwell-stiffness-assay-for-study

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Um ensaio para estudar o impacto da rigidez da matriz extracelular na infecção bacteriana

Este vídeo mostra a microscopia quantitativa de lapso de tempo para avaliar a disseminação de Listeria monocytogenes dependente da rigidez da matriz extracelular através de células endoteliais. Um hidrogel mais macio facilita a disseminação bacteriana mais rápida através das células endoteliais em comparação com contrapartes mais rígidas, destacando a influência da rigidez da matriz na disseminação bacteriana.

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Rigidez mecânica no microambiente tumoral desempenha um papel crucial na condução de comportamento maligno, aumentando a atividade invadopodia e actomiosina contratilidade. Usando géis de poliacrilamida (PaaS), invadopodia e força de tração ensaios podem ser utilizados para estudar as propriedades invasivas e contrátil das células cancerosas em resposta a matriz rigidez.

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Um ensaio de poliacrilamida-baseado formato multi bem para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular sobre a infecção bacteriana das células aderentes

Substratos com rigidez na faixa de superfície são úteis para estudar a resposta das células à rigidez de microambiente fisiologicamente relevante. Usando apenas um microscópio de fluorescência widefield, o módulo de Young de gel de silicone suave pode ser determinado usando um recuo com uma esfera apropriada.

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Aprenda a preparar géis de poliacrilamida em formato de placa multipocas para estudar respostas celulares dependentes de rigidez. Este método rápido e econômico facilita pesquisas em biologia celular sem equipamentos especializados.

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