Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

O objetivo geral deste procedimento é rastrear rapidamente diferentes genótipos, mutações ou transgenes em peixes-zebra. Isso é feito primeiro extraindo DNA de clipes finos e, em seguida, amplificando o DNA por PCR. O próximo passo é desnaturar os Amplicons de PCR enquanto registra as curvas de fusão, que são analisadas por software.

Em última análise, os resultados mostram curvas de fusão distinguíveis para diferentes genótipos. A principal vantagem desta técnica sobre o método existente, como PCR de volume de eletroforese em gel, é que é sensível a alterações de nucleotídeo único, pequena inserção, todas as deleções, e esta técnica é rápida e confiável. Embora essa técnica possa ser usada para genotipar o peixe-zebra de forma rápida e eficaz, ela também pode ser aplicada a outros sistemas e organismos modelo, incluindo linhagens celulares, camundongos e outros animais.

No dia da preparação do DNA, adicione proteinase K fresca ao tampão de lise a uma concentração de um miligrama por mililitro. O tecido pode ser coletado de um peixe adulto usando um clipe fino ou de um peixe embrionário. Primeiro anestesiar o peixe em solução de Trica.

Espere até que os movimentos branquiais diminuam. Em seguida, coloque o peixe em uma pilha de lenços de papel e, com uma lâmina de barbear estéril, corte um pequeno pedaço da barbatana caudal com cerca de dois a três milímetros de comprimento. Coloque rapidamente o peixe em um tanque rotulado com água doce para recuperação.

Pegue o clipe de aleta com uma ponta de pipeta estéril e transfira-o para um tubo cheio de 100 microlitros de tampão de lise de DNA. Certifique-se de rotular o tanque do animal e o tubo, incubar todos os tecidos coletados por pelo menos quatro horas e até durante a noite a 55 graus Celsius após a incubação. Inative a proteína ECA K aquecendo os tubos a 95 graus Celsius por 15 minutos.

Essas amostras devem ser usadas para PCR imediatamente, mas também podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius por até três meses. Realize a PCR em uma placa de 96 ou 384 poços para cada reação. Combine não mais do que um microlitro do DNA adulto com quatro microlitros de scanner de luz.

Master mix contendo a sonda fluorescente e os primers a uma concentração final de cinco pico molar cada. Se o DNA for de um embrião, use até três microlitros. Cubra as reações com 30 microlitros de óleo mineral e tampe-as.

Em seguida, cubra a placa PCR carregada com um selo adesivo opticamente transparente. Agora otimize as condições de ciclo de PCR. Um conjunto de condições típico começa com cinco minutos de tempo de fusão.

Isso é seguido por 30 ciclos de PCR com dez segundos de fusão, 25 segundos de tempo de ajoelhar e 30 segundos de alongamento. A reação deve terminar com um 32º derretimento adicionado e depois esfriar a 15 graus Celsius. Analise a placa PCR colocando-a em um sistema de análise de fusão no software.

Configure a temperatura e crie um novo arquivo de armazenamento de dados. Configure um subconjunto. Selecione os poços com amostras no lado inferior esquerdo da tela.

Selecione a guia normalizada para eliminar variantes fluorescentes. Posicione manualmente a linha dupla paralela nas regiões pré-fusão, fusão e pós-fusão e normalize os sinais fluorescentes pré-fusão e pós-fusão de todas as amostras para um e zero, respectivamente. Em seguida, distinga os genótipos com base em sua temperatura de fusão, selecionando primeiro o agrupamento.

Em seguida, selecione grupo automático na lista de seleção padrão. Na seção de agrupamento, selecione normal ou alto para perfis de fusão com transições únicas ou transições múltiplas, respectivamente. Eles estão na lista de seleção de sensibilidade na seção de agrupamento.

Agora selecione grupos de computação na seção de agrupamento e, em seguida, vá para o menu de arquivo e clique em salvar para salvar os resultados. O protocolo pode ser realizado durante um único dia ou separado em etapas ao longo de vários dias. Ao realizar a PCR, as temperaturas para o derretimento do amplicon dependem do tamanho e do conteúdo de GC, mas geralmente as temperaturas inicial e final de 60 graus Celsius e 95 graus Celsius são apropriadas quando o derretimento é realizado.

A análise das curvas de fusão fluorescente normalmente requer a normalização da variação das diferentes curvas de amostra usando regiões pré e pós-fusão como padrões. Isso melhora a comparação dos resultados de diferentes amostras nas quais a variação da fluorescência está relacionada a pequenas variações experimentais. Cada par de linhas de temperatura para normalização deve ser colocado a aproximadamente um grau Celsius de distância.

Os dados podem ser representados de duas maneiras por um gráfico que mostra os arquivos de perfis da curva de fusão ou por um gráfico que mostra um gráfico de diferença subtrativa em comparação com uma amostra de referência após mutações de análise de HRMA ou transgenes podem ser detectados. Duas mutações diferentes no gene EIF dois B cinco são observadas pelas curvas vermelha e azul. Essas amostras mutantes são identificadas por sua diferença significativa em sua curva de fusão, formas ou mudança na fluorescência quando comparadas às curvas padrão do tipo selvagem.

Este exemplo de quatro genótipos diferentes em uma única coleção de embriões ilustra o poder e a sensibilidade do método. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de oito horas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar HRMA para triagem eficiente em larga escala de genótipos de peixe-zebra.