Name: Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprenda genotipagem rápida de zebrafish usando PCR com análise de alta resolução de fusão. Este método detecta mutações e transgenes com sensibilidade a alterações de nucleotídeo único.

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Agradecemos a membros das Blaschke, Grunwald, e Wittwer laboratórios para aconselhamento e assistência técnica. Este trabalho é apoiado pela Fundação PCMC, NIH R01 MH092256 e DP2 MH100008, ea Marcha de Dimes Foundation bolsa de investigação # 1-FY13-425, a JLB.

1. Preparação de DNA <ol><li> Preparar tampão de lise de ADN: 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Adicionar fresco proteinase K para uma concentração final de 1 mg / mL, no dia da utilização 12. </li><li> Coleção de tecidos: <ol><li> Para o adulto clipe fin fish: <ol><li> Anestesiar peixe: Coloque o peixe em 0,004% solução (tricaina) MS-222. Espere até que o movimento de emalhar diminui. </li><li> Coloque os peixes em uma pilha de 5-10 Kimwipes e cortar um pequeno pedaço da barbatana caudal, cerca de 2-3 mm, com uma lâmina de barbear estéril. </li><li> Colocar rapidamente o peixe em um tanque rotulado com água fresca para a recuperação; rotular cuidadosamente tanto o tanque e correspondente tubo que contém o clipe de fin. Troque a água e alimentar os peixes todos os dias. </li><li> Pegue o clipe fin com uma ponta de pipeta estéril e transferi-lo para um tubo preenchido com 100 mL tampão de lise de DNA. </li><li> Descarte a ponta da pipeta, e descartar a lâmina de barbear em um recipiente apropriado. </li></ol></li><li> Por cauda embrião clipe: <ol><li> Coloque embriões em 0,004% solução (tricaina) MS-222. Espere 2 min. </li><li> Corte um pedaço da cauda com uma pinça sob um microscópio de dissecação. </li><li> Coloque a cauda para um tubo rotulado cheio com 30 uL de tampão de lise de ADN. </li><li> Rapidamente colocar o embrião para um tubo contendo 100 jil de 4% de paraformaldeído. </li><li> Tubos etiqueta com embriões e seus tubos de cauda correspondentes. </li><li> Armazenar os tubos com embriões a 4 ° C durante a noite para a fixação. </li><li> Limpar os fórceps usando água Milli-Q e Kimwipes entre cada embrião para minimizar a contaminação. </li></ol></li><li> Para embriões inteiros: <ol><li> Coloque embriões em 0,004% solução (tricaina) MS-222. Espere 2 min. </li><li> Colocar 1-5 embriões num tubo cheio com 100 ul de tampão de lise de ADN. Dechorionation não é necessário. </li></ol></li></ol></li><li> Digestão do DNA Incubar os tubos com o tecido (ou nadadeira da cauda clips ou embriões) a 55 ° Cpara 4 horas até durante a noite 12. </li><li> Desativar o Proteinase K Tubos de calor a 95 ° C durante 15 minutos 12. DNA deve ser utilizado para a PCR imediatamente ou armazenada a -20 ° C durante até 3 meses. </li></ol> 2. PCR <ol><li> Projeto Primers manualmente ou por software de desenho de primer (por exemplo Lightscanner Primer Projeto Software-Biofire). Os produtos de PCR para HRMA são geralmente de 50-200 pb, os produtos de PCR para a detecção de SNP pode ser menor, tipicamente 50-80 pb. </li><li> PCR <ol><li> Realizar a reacção de PCR em um de 96 poços ou de 384 poços da placa. </li><li> Utilizar 10 mL volume total: 4 ul de mistura principal LightScanner (0,1 L quente iniciar a Taq-polimerase AB, tampão, dNTP 0,2 mM, cloreto de magnésio 2 mM, 1x e corante de ligação a ADN de cadeia dupla fluorescente), 5 pmol de cada iniciador, e 1 uL de ADN genómico extraído de modelo de barbatana adulto ou 3 ul de DNA genómico a partir de cauda embrionária 13. </li><li> Amostras de cobertura com 30 mL de óleo mineral. </li&gt; <li> Cobrir a placa com um selo adesivo opticamente transparentes. </li><li> Optimizar PCR condições de ciclismo típicos, são condições de 95 ° C durante 5 min, e 30 ciclos de 10 seg a 95 ° C, 25 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, terminando com 95 ° C durante 30 seg e arrefecida a 15 ° C. </li><li> Armazene PCR placas a 4 ° C ou continuar diretamente para HRMA. </li><li> Confirmar nosso produto de PCR por análise do seu tamanho utilizando electroforese em gel de agarose durante a optimização inicial de PCR e, se indicado, por sequenciação do produto de PCR. </li></ol></li></ol> 3. HRMA <ol><li> Placas de calor <ol><li> Coloque a placa em um sistema de análise de fusão. </li><li> Abra o software (Software LightScanner Chame-IT 2.0). </li><li> Placas de calor 60-95 ° C. </li><li> Crie um novo arquivo de armazenamento de dados. </li></ol></li><li> Analisar dados HRMA (Figura 2). Várias etapas de análise são possíveis. Mostramos o conjunto mais comumente usado de dados manipulations. <ol><li> Definição de subconjunto Clique na aba subconjunto. Selecione os poços com amostras. </li><li> Normalização <ol><li> Selecione a guia Normalize no painel à esquerda. Para eliminar variação de fluorescência, posicionar manualmente a dupla linha paralela na pré-(inicial) e pós regiões (final) derreter como ilustrado (Figura 2C, pontas de seta) e normalizar os sinais de fluorescência premelt e pós-fusão de todas as amostras a 1 e 0 , respectivamente 14. </li><li> Ajustar o posicionamento das linhas de modo que a região de fusão é, na região entre as linhas de pré-e pós-melt, mas não seleccionado. Em geral, quanto menor Min e Baixa Max (e Superior Min e Max superior) linhas de temperatura deve ser colocado cerca de 1 ° C à parte. </li><li> Escolha posições de temperatura para a normalização de tal forma que todas as amostras têm (100%) de fluorescência máxima ou total para a região premelt e mínima ou nenhuma (0%) de fluorescência para a região pós-fusão (da melhor forma posvel). A normalização deve resultar em uma linha quase horizontal na parte de fluorescência máxima de 1 que se estende até ao ponto de fusão e, em seguida, uma linha quase horizontal a partir do ponto de fusão na fluorescência mínima de 0, não deve haver níveis de fluorescência acima ou abaixo de 1 0 . Por exemplo, na figura 2C, normalizar as curvas premelting usando gamas de temperatura de 79-80 ° C. </li></ol></li><li> Agrupamento / Clustering Distinguir os genótipos com base na sua temperatura de fusão (Figura 2C, caixa verde). Selecione Agrupamento. <ol><li> Selecione autogroup na lista de seleção Padrões na seção Agrupamento. </li><li> Selecione Normal ou Alta para a fusão de perfis com transições individuais ou várias transições, respectivamente, na lista de seleção de sensibilidade na seção Agrupamento. </li><li> Selecione ComputeGrupos na seção Agrupamento. </li><li> Vá para o menu Arquivo e clique em Salvar para salvar os resultados. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li>
<li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li>
<li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+melting+analysis+%28HRMA%29%3A+more+than+just+sequence+variant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutation%22%5BJournal%5D)">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li>
<li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li>
<li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%3A+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li>
<li>Carrillo, J., Martínez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cell.+Mol.+Dis.%22%5BJournal%5D)">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li>
<li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melt+analysis+%28HRMA%29%3B+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li>
<li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li>
<li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li>
<li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li>
<li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li>
<li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+%28MS-HRMA%29+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li>
<li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles%3A+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

PCR combinada com HRMA é uma tecnologia poderosa para a genotipagem do peixe-zebra. As vantagens desta abordagem são a sua velocidade, robustez, e a sensibilidade para detectar mesmo mutações pontuais. O protocolo de todo, a partir de aleta-grampo análise para derreter-curva, pode ser realizada em menos de oito horas, por um único indivíduo. Além disso, a técnica é tratável através de rastreio de alto rendimento; não requer a utilização de brometo de etídio, e é selada por todas as etapas de PCR e de análise, que ajuda ...

Peixe-zebra (Danio rerio) é um sistema de modelo animal vertebrado amplamente utilizado para estudos de desenvolvimento e modelagem de doenças. Recentemente, várias tecnologias transgênicas e mutação foram desenvolvidos para zebrafish. Técnicas de transgenia rápidos, geralmente com base em um sistema de transposon Tol2 1, foram combinados com melhores opções de clonagem para uma montagem múltipla fragmento de DNA 2. Nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e de transcrição nucleases efectoras activadores do tipo (TALENS) têm sido utilizadas para direccionar loci em ambas as células somáticas e germinais em peixes-zebra 3,4. Estas técnicas podem gerar de forma eficiente animais geneticamente modificados, com alta freqüência de criação e transmissão de mutação germinal 3,4. Apesar destes avanços, técnicas de genotipagem tradicionais em zebrafish limitar o poder das ferramentas de mutagênese e transgenia. PCR, seguida por electroforese em gel, por vezes combinados com DISSEMINAÇdigestão enzimática n, é amplamente utilizado para detectar a modificação do genoma, mas é demorada e menos sensível à identificação de pequenas inserções ou deleções. Ensaios de sonda TaqMan têm altos custos iniciais e requerem otimização cuidadosa. A sequenciação de produtos de PCR pode levar vários dias e não é prática para a triagem em grande escala. Análise do polimorfismo de fragmentos de restrição (RFLP) só pode discriminar SNPs que afetam um número limitado de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição. A análise de alta resolução de fusão (HRMA), um tubo fechado, o método de análise pós-PCR, é um método recentemente desenvolvido que é rápido, sensível, pouco dispendioso, e passíveis de rastreio de grandes números de amostras. HRMA pode ser utilizado para detectar SNPs, mutações e transgenes 5-7. HRMA é baseada em desnaturação térmica de ADN de cadeia dupla, e cada fragmento amplificado de PCR tem um único dissociação (derreter) característica 5. As amostras podem ser discriminados devido to a sua composição de nucleótidos diferente, teor de GC, ou comprimento, tipicamente em combinação com um corante fluorescente que se liga somente o ADN de cadeia dupla 8. Assim, HRMA pode distinguir diferentes genótipos com base nas diferentes características de fusão-curva. Porque HRMA utiliza reagentes de baixo custo e é um processo de pós-PCR de etapa única, que pode ser usado para as estratégias de alto rendimento. HRMA é não destrutiva, de modo que após a análise dos produtos de amplificação de PCR podem ser usados ​​para outras aplicações. HRMA foi aplicado em muitos organismos e sistemas, incluindo linhas celulares, ratos e seres humanos 9-11. Seu uso foi recentemente descrito no peixe-zebra para detectar mutações induzidas por nucleases dedo de zinco (ZFNs) e Talens 6,12,13. Neste artigo, descrevemos como executar HRMA baseado em PCR em zebrafish embrionárias e adultas (Figura 1). Este protocolo é adequado para a detecção de SNPs, os transgenes e mutações, incluindo simudanças ngle de pares de bases, inserções ou exclusões.

<table><tbody><tr><td>100 Reaction LightScanner Master Mix</td><td>BioFire</td><td>HRLS-ASY-0002</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Hard-Shell PCR 96 poços BLK/WHT Plates</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9665</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Microseal 'B' Adhesive Seals</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>MSB1001</td><td>www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>96-well LightScanner Instrument</td><td>BioFire</td><td>LSCN-ASY-0040</td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Software LightScanner com Call-IT 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Análise de fusão de alta resolução 2.0</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>LightScanner Software de design de primer</td><td>BioFire</td><td></td><td>www.biofiredx.com</td></tr><tr><td>Vector NTI Software</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>www.invitrogen.com</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rápida e eficiente zebrafish genotipagem usando pcr com alta resolução análise melt

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish é um poderoso sistema modelo para o estudo de vertebrados desenvolvimento, modelagem de doenças, e realizar a triagem de drogas. Recentemente, uma variedade de ferramentas genéticas foram introduzidas, incluindo várias estratégias para induzir mutações e gerar linhagens transgênicas. No entanto, o rastreio em larga escala é limitada pelos métodos de genotipagem tradicionais, que são consumidoras de tempo e de trabalho intensivo. Aqui nós descrevemos uma técnica para analisar genótipos zebrafish por PCR combinada com análise de alta resolução de fusão (HRMA). Esta abordagem é rápida, sensível e de baixo custo, com menor risco de artefatos de contaminação. A genotipagem por PCR com HRMA pode ser usado para embriões e peixes adultos, incluindo protocolos de triagem de alto rendimento.

O protocolo pode ser realizada durante um único dia ou separada em passos ao longo de vários dias (diagrama de fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1). Extracção de ADN é seguida pela análise de fusão e de produtos de amplificação de PCR. As temperaturas para a fusão do fragmento amplificado dependerá do tamanho e conteúdo GC, mas geralmente iniciar e as temperaturas finais de 50 ˚ C e 95 ˚ C são adequados (Figuras 2A e 2B). Uma vez que a fusão é realizada, a análise ...

PCR combinada com a análise de fusão de alta resolução (HRMA) é demonstrado como um método rápido e eficiente para a genotipagem de peixe-zebra.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma triagem rápida de diferentes genótipos, mutações ou transgenes em peixe-zebra. Isso é conseguido primeiramente com a extração de DNA a partir de pequenas amostras de tecido, seguida pela amplificação do DNA por PCR. O próximo passo consiste em desnaturar os amplicons de PCR enquanto se registram as curvas de dissociação, que são analisadas por meio de software.Por fim, os resultados demonstram curvas de dissociação distinguíveis para diferentes genótipos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a eletroforese em gel seguida de PCR em volume, é sua sensibilidade a alterações de nucleotídeo único, pequenas inserções e todas as deleções, além de ser um método rápido e confiável. Embora esta técnica possa ser usada para genotipar rapidamente e de forma eficaz o peixe-zebra, ela também pode ser aplicada a outros sistemas e organismos modelo, incluindo linhagens celulares, camundongos e outros animais.No dia da preparação do DNA, adicione proteinase K fresca ao tampão de lise na concentração de um miligrama por mililitro. O tecido pode ser coletado de um peixe adulto usando uma pinça fina ou de um peixe embrionário. Primeiro, anestesie o peixe em solução Trica.Aguarde até que os movimentos das brânquias diminuam. Em seguida, coloque o peixe sobre uma pilha de tecidos e, com uma lâmina de barbear estéril, corte um pequeno pedaço da nadadeira caudal com cerca de dois a três milímetros de comprimento. Coloque rapidamente o peixe em um tanque rotulado com água fresca para recuperação.Retire o fragmento da nadadeira com uma ponteira estéril e transfira-o para um tubo contendo 100 microlitros de tampão de lise de DNA. Certifique-se de rotular tanto o aquário do animal quanto o tubo, incube todos os tecidos coletados por pelo menos quatro horas e até durante a noite a 55 graus Celsius após a incubação. Inative a proteína ACE K aquecendo os tubos a 95 graus Celsius por 15 minutos.Essas amostras devem ser usadas imediatamente para PCR, mas também podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius por até três meses. Realize a PCR em uma placa de 96 ou 384 poços para cada reação. Combine no máximo um microlitro do DNA de adulto com quatro microlitros de light scanner.Mistura mestra contendo a sonda fluorescente e os iniciadores em concentração final de cinco pico molar cada. Se o DNA for de um embrião, utilize até três microlitros. Cubra as reações com 30 microlitros de óleo mineral e, em seguida, feche-as com tampa.Em seguida, cubra a placa de PCR carregada com um selo adesivo opticamente transparente. Agora, otimize as condições de ciclagem de PCR. Um conjunto típico de condições inicia com cinco minutos de tempo de desnaturação.Em seguida, realiza-se 30 ciclos de PCR com fusão de dez segundos, tempo de anelamento de 25 segundos e alongamento de 30 segundos. A reação deve terminar com uma fusão adicional de 32º ciclo e, então, resfriar a 15 graus Celsius. Analise a placa de PCR colocando-a em um sistema de análise de fusão no software.Configure a temperatura e crie um novo arquivo de armazenamento de dados. Configure um subconjunto. Selecione os poços com amostras no lado inferior esquerdo da tela.Selecione a aba normalizada para eliminar as variantes fluorescentes. Posicione manualmente a linha dupla paralela nas regiões pré-melt, melt e pós-melt e normalize os sinais fluorescentes pré-melt e pós-melt de todas as amostras para um e zero, respectivamente. Em seguida, distinga os genótipos com base em suas temperaturas de dissociação, selecionando primeiro o agrupamento.Em seguida, selecione agrupamento automático na lista de seleção padrão. Na seção de agrupamento, selecione normal ou alto para perfis de fusão com transições únicas ou múltiplas, respectivamente. Essas opções estão na lista de seleção de sensibilidade localizada na seção de agrupamento.Agora, selecione grupos de cálculo na seção de agrupamento e, em seguida, vá ao menu arquivo e clique em salvar para armazenar os resultados. O protocolo pode ser realizado em um único dia ou dividido em etapas ao longo de vários dias. Ao realizar a PCR, as temperaturas para a dissociação do amplicon dependem do tamanho e do teor de GC, mas geralmente as temperaturas iniciais e finais de 60 graus Celsius e 95 graus Celsius são adequadas quando a curva de dissociação é realizada.A análise dos gráficos de fusão fluorescentes geralmente exige a normalização da variação dos diferentes gráficos das amostras, utilizando regiões pré e pós-fusão como padrões. Isso melhora a comparação dos resultados de diferentes amostras, em que a variação da fluorescência está relacionada a pequenas variações experimentais. Cada par de linhas de temperatura para normalização deve ser posicionado aproximadamente um grau Celsius distante uma da outra.Os dados podem ser representados de duas maneiras: por um gráfico que mostra os arquivos de perfis das curvas de dissociação, ou por um gráfico que mostra um gráfico de diferença subtrativa em comparação com uma amostra de referência após análise HRMA, na qual mutações ou transgenes podem ser detectados. Duas mutações diferentes no gene EIF two B five são indicadas pelas curvas vermelha e azul. Essas amostras mutantes são identificadas por sua diferença significativa nas curvas de dissociação, nas formas ou na alteração da fluorescência quando comparadas às curvas padrão do tipo selvagem.Este exemplo de quatro genótipos diferentes em uma única coleta de embriões ilustra o poder e a sensibilidade do método. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de oito horas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a HRMA para triagem em larga escala de genótipos de peixe-zebra.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve a extração de DNA do clipe da cauda do peixe-zebra. O protocolo demonstra um método rápido e eficiente para analisar genótipos de peixe-zebra.

Extração de DNA do clipe da cauda: um método usado na genotipagem do peixe-zebra

Neste vídeo, descrevemos uma técnica de PCR de fusão de alta resolução para determinar o polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA de comprimentos de sequência variados, com base na análise da temperatura de fusão.

PCR de fusão de alta resolução para determinar variações de sequência em sequências de DNA mutante

Enquanto a análise de alta resolução de fusão oferece a capacidade de diferenciar entre polimorfismos de nucleotídeo único em uma população heterogênea, viés amplificação alelo mutante pode aumentar a sua capacidade para detectar alelos presentes em percentagens relativamente baixas dentro de uma amostra. Este protocolo descreve melhorias que melhoram a sensibilidade da análise de fusão de alta resolução.

Métodos para aumentar a sensibilidade de alta resolução de derretimento Single Nucleotide Polymorphism Genotipagem em Malária

A técnica de genotipagem descrito aqui, que acopla reacção em cadeia da polimerase fluorescente (PCR) para electroforese em gel capilar, permite a genotipagem de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. É contorna as limitações enfrentadas por outras técnicas de genotipagem e é mais rentável do que os métodos de sequenciação.

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

Genoma alvo edição no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem sido facilitada pela emergência de abordagens baseadas em CRISPR. Aqui, descrevemos um protocolo simplificado, robusto para a geração e a identificação de alelos CRISPR-derivado absurdo que incorpora o ensaio de mobilidade doheteroduplex e identificação de mutações usando sequenciamento de próxima geração.

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

As tecnologias de edição de genes permitiram que os pesquisadores gerassem mutantes de zebrafish para investigar a função genética com relativa facilidade. Aqui, fornecemos um guia para realizar genotipagem e quantificação de embriões paralelos em sinais de hibridização in situ em zebrafish. Essa abordagem imparcial proporciona maior precisão em análises fenotípicas baseadas na hibridização do situ.

Genotipagem e Quantificação da Coloração de Hibridização in Situ em Zebrafish

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

As tecnologias CRISPR-Cas revolucionaram o campo da edição do genoma. No entanto, encontrar e isolar a edição de linha germinal desejada continua sendo um grande gargalo. Portanto, este protocolo descreve um método robusto para rastrear rapidamente espermatozoides de peixe-zebra injetados com CRISPR F0 para edições germinativas usando técnicas padrão de PCR, digesto de restrição e eletroforese em gel.

Triagem de espermatozoides para o isolamento rápido de edições germinativas em peixes-zebra

Aqui, apresentamos um protocolo para marcar proteínas com uma etiqueta de proteína de fluorescência em larvas de peixe-zebra, um sistema in vivo recém-desenvolvido e modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baixa abundância em peixe-zebra.

Marcação de fluorescência para visualizar proteínas de baixa expressão em peixe-zebra

Aprenda genotipagem rápida de zebrafish usando PCR com análise de alta resolução de fusão. Este método detecta mutações e transgenes com sensibilidade a alterações de nucleotídeo único.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

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