Métodos para aumentar a sensibilidade de alta resolução de derretimento Single Nucleotide Polymorphism Genotipagem em Malária

O objetivo geral do seguinte experimento de fusão de alta resolução é aumentar a sensibilidade de detecção de alelos mutantes presentes em baixas concentrações com amostras individuais. Isso é feito primeiro preparando o DNA extraído, diluindo o molde para os volumes e concentrações necessários. O segundo passo é preparar os ensaios com proporções assimétricas do primer direto e reverso para aumentar o produto da sonda modelo.

Depois de preparar as reações, a temperatura de recozimento é definida entre as temperaturas de fusão da sonda quando ligada ao tipo selvagem ou ao modelo mutante. A etapa final é analisar os produtos amplificados na plataforma de GRH apropriada. Em última análise, o viés de amplificação do alelo mutante e a PCR assimétrica baseada em sonda permitem uma detecção mais sensível da mutação SNP desafiadora em baixas concentrações presentes nas amostras.

Essa sensibilidade aumentada é útil para a vigilância de mutações em populações. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como fusão padrão de alta resolução ou genotipagem tac man, é que ela permite maior sensibilidade para alelos presentes em baixas concentrações e também permite a genotipagem de SNPs localizados próximos uns aos outros no genoma. Embora este método possa fornecer informações sobre a disseminação da resistência aos medicamentos no parasita da malária.

Também pode ser aplicado a outros sistemas, como vigilância de outros tipos de doenças infecciosas, como o HIV, ou detecção de variantes raras do câncer em uma população de células. Demonstrando o procedimento estará Caitlin Durphy. Um técnico do nosso laboratório.

Modelos para fusão de alta resolução ou HRM são preparados a partir de amostras de plasmodium falciparum obtidas diretamente do sangue de pacientes que participam de estudos de campo. As amostras podem ser armazenadas em papel de filtro, em testes de detecção rápida ou como amostras de glóbulos vermelhos peletizados também podem ser adaptadas para cultivo in vitro. Algumas cepas laboratoriais padrão para análise podem ser solicitadas no centro de recursos de reagentes de referência e pesquisa da malária As amostras podem ser extraídas de sangue total, glóbulos vermelhos ou papel de filtro, ou usadas diretamente de glóbulos vermelhos peletizados ou cultura para amplificação direta de glóbulos vermelhos peletizados.

Primeiro, determine o parágrafo dos glóbulos vermelhos usando microscopia fina seguindo o procedimento dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. Os glóbulos vermelhos com paras acima de 0,5% são então diluídos de um a 400. Em TE serão utilizados três microlitros de hemácias diluídas para cada reação de cinco a 10 microlitros, devido a entre uma variabilidade, controles positivos e negativos devem sempre ser incluídos nas análises de HRM.

Prepare 10 picogramas a 10 nanogramas por diluições de um microlitro de plasmídeo ou padrões com genótipos de recorte verificados por sequência como trolls positivos. Use água de grau PCR como um controle negativo sem modelo para as reações de amplificação. Comece este procedimento preparando 10 x estoques de trabalho dos primers e sondas.

O mesmo protocolo é aplicável a ensaios usando placas de 96 poços, placas de 384 poços, oito tiras de tubos ou capilares de vidro. Mas para o propósito desta demonstração, apenas 96 placas de poços e capilares de vidro serão usados. Esta tabela mostra as concentrações recomendadas de 10 x estoque de trabalho, bem como as concentrações finais para genotipagem de HRM baseada em sonda bloqueada.

Prepare misturas de reação para cada um. Bem, adicione um microlitro de cada um dos 10 x primers e sondas para frente e para trás. Quatro a cinco microlitros do master HRM misturam um microlitro de água modelo e PCR para um volume total de reação de 10 microlitros.

Faça o mesmo para cada capilar de vidro. Cubra as placas e os capilares de vidro. Use vedações de placa óptica para amplificação baseada em placa e tampas plásticas para sistemas baseados em capilares.

Certifique-se de que a cobertura esteja completa e que as placas e tampas estejam completamente seladas e presas para evitar a evaporação. Durante a amplificação. Gire as amostras para remover as bolhas de ar.

Gire as placas em uma centrífuga de mesa por três minutos a 1.800 vezes G.Gire os capilares de vidro em uma pico fuge por 10 a 15 segundos. Coloque a placa de reação e os capilares de vidro em uma sonda bloqueada padrão de termociclador ou protocolos de amplificação MAAB. Após a amplificação por PCR, prossiga para a análise de fusão a partir da interface do software do sistema.

Derreta a placa de 40 graus Celsius a 80 graus Celsius para produzir picos de fusão da sonda e do amplicon. A primeira etapa da análise de fusão no ciclador de luz quatro 80 é a normalização da derivada negativa da fluorescência normalizada em relação à visão de temperatura. Mova as barras de normalização para circundar a região de fusão da sonda.

A região de fusão da sonda é a temperatura mais baixa das duas regiões de fusão. As barras de normalização devem estar na base dos picos de fusão. Após a normalização, selecione calcular grupos para atribuir automaticamente amostras a grupos, se necessário, reatribuir manualmente amostras a grupos específicos.

Selecione amostras que não amplificaram ou que têm picos de fusão irregulares. Em seguida, vá para nova chamada e selecione negativo. Depois de selecionar as amostras restantes classificadas incorretamente, vá para uma nova chamada, selecione o agrupamento apropriado e clique em aplicar alterar Atribuir genótipos para cada grupo com base nos padrões.

Depois de confirmar que os grupos calculados estão corretos, selecione editar nomes de grupos na guia de agrupamento. Insira os genótipos dos padrões na caixa colorida correspondente. Por exemplo, se o padrão 3D sete tiver um genótipo C conhecido e estiver no grupo um, todas as amostras no grupo um terão resultados de prensa do genótipo C e os genótipos serão exibidos ao lado das amostras.

Por fim, exporte os resultados como um arquivo TXT para análise adicional da população da amostra. Após o término da execução no ciclador de luz 2.0, registre os nomes e posições das amostras nos dados da amostra Antes de iniciar a análise, rotule os controles negativos e os genótipos dos padrões de fusão. Comece a análise de fusão selecionando análise, escolhendo genotipagem sob análise de curva de fusão e prensagem. Okey.

Para aumentar a sensibilidade do agrupamento automático, selecione todas as amostras para que a exibição nas curvas de fusão seja plotada. Deslize a barra de normalização para o limite superior dos picos de fusão da sonda. Confirme se as amostras foram agrupadas corretamente selecionando individualmente cada grupo abaixo do nome do grupo.

Exporte os genótipos para cada amostra selecionando todas as amostras, copiando os dados e colando em uma planilha. O gráfico da derivada negativa da fluorescência normalizada em relação à temperatura é normalmente a maneira mais direta de visualizar picos de fusão e determinar genótipos. Definir a janela de análise para apenas uma região de sonda resulta em uma diferenciação clara de picos correspondentes a SNPs específicos.

Combinações perfeitas resultam em picos de fusão mais altos indicados em vermelho. Enquanto as incompatibilidades de SNP têm temperaturas de fusão mais baixas indicadas em cinza quando ambos os alelos estão presentes em uma amostra. A análise HRM baseada em prob representa ambos os alelos como duas curvas de pico mostradas em laranja com picos que correspondem a amostras de alelo único mostradas em vermelho e cinza, reduzindo progressivamente a temperatura de ealing durante a amplificação resulta em um viés em direção ao alelo mutante representado pelo pico do lado esquerdo em uma amostra poligenômica ou polialélica.

Esse viés de amplificação de alelos mutantes resulta em sensibilidade HRM para detectar alelos menores presentes em menos de 1% em amostras poligenômicas ou polialélicas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade da amostra é fundamental. Pequenas diferenças nas concentrações de tampão podem mudar as curvas de HRM.

O uso de controles é uma maneira útil de padronizar os resultados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar PCR assimétrico baseado em prob e viés de amplificação de alelos mutantes para genotipar com precisão e sensibilidade SNPs de malária de uma variedade de tipos de amostra.