Name: Expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda a purificar partículas semelhantes a vírus expressas por sistemas de células de mamíferos ou insetos usando ultracentrifugação. Este método simplificado facilita a identificação segura de antígenos virais para vacinas.

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Gostaríamos de agradecer os membros anteriores do laboratório Ross, que têm ajudado a otimizar o protocolo para a máxima eficiência e produtividade.

1. Sistema de expressão de mamífero para a geração de gripe H3N2 VLP <ol><li> Subclone viral estrutural glicoproteínas hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), e vírus da imunodeficiência humana (HIV) Gag p55 em vectores de expressão eucarióticos, tais como pTR600 descrito anteriormente 7. </li><li> Amplificar o ADN em Escherichia coli quimicamente competentes (por exemplo, DH5a) e isolar o plasmídeo de transfecção de grau utilizando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Quantidade de DNA é dependente de rendimento e as necessidades do usuário. </li><li> Manter a linha celular de mamífero, 293T, em meio de crescimento contendo 10% de soro fetal de-bovino (FBS) a 37 ° C com 5% de CO2 num incubador humidificado. </li><li> Cultivar células de tal modo que um frasco de cultura de tecidos T-150 contém 45-75 x 10 6 culas por frasco de modo a que balão obtém adesão célula completa e uma confluência celular de 85-95% no dia seguinte. Inspecionar as células ao microscópio para conflu desejadorência. Nota: de elevada densidade celular é normalmente recomendado para se obter a expressão da proteína óptima, com a citotoxicidade mínima quando utilizando os reagentes de transfecção comerciais no entanto o excesso de confluência pode resultar na acumulação de resíduos celulares subprodutos e reduzir a viabilidade celular. </li><li> No dia da transfecção, preparar lipossomas e mistura de ADN de acordo com as recomendações do fabricante e transfectar células de ADN com uma composição de ADN de 1: 1: 2 de HA: NA: Gag com uma quantidade total de ADN de 40 ug por T-150 frasco. Dilui-se soluções de ADN e de lipossomas em meio de transfecção isento de soro sem antibióticos de modo a que cada frasco contenha um volume total de 20-30 ml. Nota: Rácio de construções de genes pode requerer optimização do usuário. Embora não demonstrado aqui, um procedimento semelhante transfecção foi realizada com o vírus sincicial respiratório (RSV) F e Gag de HIV a uma razão de 1: 1. Para DENV e CHIKV plasmídeos de expressão única, um total de 20 ug de DNA por 150 T-balão são utilizados para a óptima expression. ADN: transfecção proporções de reagentes são otimizados usuário. Uso recomendado meio de transfecção baseados no método de transfecção, ou seja, lípidos transfecções policatiónicos recomendam a redução ou ausência de soro fetal bovino, assim, meios pode ser suplementado com hormonas de crescimento e oligoelementos para suportar o crescimento na ausência de soro. </li><li> Retorno frascos a 37 ° C com 5% de CO2. Para um volume de 200 ml, 9 utilizar balões T-150. As células são mantidas em meio de cultura de transfecção até ao dia da colheita de VLP. </li><li> Colheita do sobrenadante da cultura a partir de células após 72-96 h pós-transfecção, dependendo do antigénio, ou quando a viabilidade celular diminuiu para 70-80%, tal como estimada por inspecção microscópica. Transferir o sobrenadante para tubos de 50 mL cónicos e girar para baixo as células a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para sedimentar os detritos celulares. Nota: A substituição de três dias com o sobrenadante pré-aquecido, meios de transfecção isento de soro fresco para as células aderentes vai yielda segunda série de VLP com rendimento semelhante ou ligeiramente reduzida e deve ser otimizado pelo usuário. </li><li> sobrenadante piscina e filtro através de uma membrana de 0,22 mM poros antes de sedimentação através de ultracentrifugação. </li><li> Testar a atividade hemaglutinante das VLP expressando HA por ensaio de hemaglutinação padrão 14 usando 0,8% peru ou células vermelhas do sangue de mamíferos ou de prosseguir com ELISA específico de antigénio. Veja a Figura 2 para resultados representativos. </li></ol> 2. Expressão de VLP CHIK Usando baculovírus / insectos do sistema celular <ol><li> Gerar baculovírus recombinantes expressando capsídeo do vírus chikungunya e proteínas do envelope (C-E3-E2-6K-E1) a partir de S-27 estirpe utilizando um sistema de expressão de baculovírus comercial. </li><li> Cultura de células Sf9 Spodoptera frugiperda Sf9 em meio de crescimento isento de soro com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina a 28 ° C. Use 3-5 x 10 5 C / ml para iniciar culturas balão rotativo para suspenso crescimento de células de iões. Passagem rotineiramente quando atingirem densidades de células de 2-4 x 10 6 / mL (a cada 3-4 dias). </li><li> Cultura de células Sf9 em suspensão em frascos rotativos, com agitação a 130 rpm num agitador de placa sistema multiponto. Para permitir o arejamento adequado, manter volumes de cultura em não mais do que metade do volume do frasco com agitação. </li><li> Para a expressão de VLPs CHIK, infectar células Sf9, a uma densidade de 2 X 10 6 células / ml, com baculovírus recombinante a uma multiplicidade de infecção de 1 e regresso a 28 ° C incubadora. Tipicamente, infectar um ou dois frascos rotativos de 250 ml, contendo células Sf9. Nota: Apesar de não utilizar este método, as células Sf9 podem ser cultivadas em frascos de agitação a 28 ° C, utilizando uma plataforma shaker. </li><li> culturas colheita após 72-96 h pós-infecção, ou quando a viabilidade celular diminuiu para 70-80%, tal como determinado por exclusão com Azul de Tripano de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: As células continuam a proliferar, enquanto infectado e não háa ~ 80% de viabilidade em culturas de Sf9 infectadas com baculovírus recombinantes CHIK VLP aos 3 dias pós-infecção (dpi). células infectadas por baculovírus são maiores na aparência. Morfologia também pode mudar de volta a oblongo. No final dos estágios de infecções de baculovirus, as células começaram a lisar. </li><li> culturas de transferência directamente a partir de cultura em suspensão em 50 ml tubos cónicos e girar as células para baixo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Recolha sobrenadantes e filtrar através de uma membrana de 0,22 mM poros antes de sedimentação através de ultracentrifugação. </li></ol> 3. Sedimentação / Purificação de VLP / SVPS <ol><li> Esterilizar 25 mm x 89 mm open-top tubos de ultracentrífuga com 70% de etanol na capa de biossegurança. Verifique se o etanol tenha secado antes de usar. </li><li> Coloque até 32 ml de sobrenadante para um tubo limpo. Um volume mínimo de 25 ml é recomendado para evitar o colapso e danos dos tubos de ultracentrífuga insuficientemente cheios. </li><li> subjacente cuidadosamente sobrenadantes with glicerol estéril de 3 ml de 20% em PBS (v / v). Certifique-se de tubos são equilibradas. </li><li> Centrifugação a 135.000 xg durante 4 h a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante, assegurando o sedimento não desalojar do tubo. </li><li> Ressuspender sedimentado VLP na parte inferior dos tubos com PBS estéril por vigorosamente pipetando para cima e para baixo. A quantidade de PBS necessário para voltar a suspender VLP depende rendimento de proteína total VLP e aplicações a jusante. Tipicamente, ressuspender cada pellet de VLP em, pelo menos, 100 uL. </li><li> Armazenar as amostras a 4 ° C para armazenagem de curta duração de armazenamento e -80 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol> 4. determinação dos rendimentos de proteínas e Rendimentos antígeno específico <ol><li> Determinar o teor de proteína total utilizando um método de quantificação de proteínas comercial, tais como ensaio BCA de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Para avaliar o conteúdo de antigénio específico, efectuar ensaio imunossorvente ligado a enzimas directo (ELISA) revestindo diluições em série do antigénio padrão e 2-51; g de amostra de proteína total para uma placa de 96 poços de fundo plano de ELISA. <ol><li> Siga com anticorpos específicos para o antigénio para sondar a presença dos antigénios sobre a placa e utilizar substratos de desenvolvimento de ELISA convencionais para produzir absorvância detectável para leitor de microplacas. Veja a Figura 2 para obter resultados representativos do ensaio de HA e ELISA para uma amostra de HA-expressando VLP; muitas combinações de HA e NA são, possivelmente, mas os rendimentos podem diferir sobre a compatibilidade HA-NA 15. Nota: Os anticorpos específicos para antigénio têm afinidades variáveis ​​e recomenda-se que a titulação ponto final de diluição de anticorpos ser determinados antes de realizar a quantificação de VLP. anticorpos comerciais terá de concentração ou de diluição intervalos sugeridos para utilização em ELISA, bem como os protocolos sugeridos. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Autores não têm nada a revelar.

Usámos as técnicas descritas acima para expressar e purificar com êxito SVPS e as VLP compostas por várias proteínas estruturais para vários patogénios. De um modo geral, que utilizam sistemas de expressão de mamífero para gerar nossos VLP. No entanto, em nossas mãos, de células derivadas de mamíferos CHIK rendimentos VLP foram baixos. CHIK rendimento VLP foi mais robusta quando se utiliza um sistema de células de baculovírus de insectos recombinante. Em geral, baculovírus de insecto sistemas de células de produzir quan...

partículas semelhantes a vírus (VLPs) são uma tecnologia aprovado para vacinação humana. Na verdade, algumas das vacinas mais contemporaneamente licenciados, incluindo os vírus do papiloma humano (HPV) e Β hepatite (HepΒ) vacinas empregam esta abordagem. As VLPs são formadas a partir de proteínas estruturais capazes de auto-montagem. As partículas montados imitar morfologias virais, mas não pode infectar ou replicar porque lhes falta genomas virais. VLP pode ser expressa e purificada a partir de um número de sistemas procariotas e eucariotas. Uma revisão da literatura revelou que os diferentes sistemas de expressão são empregadas com as seguintes taxas: bactérias - 28%, a levedura - 20%, planta - 9%, inseto - 28%, e de mamíferos - 15% 1. Digno de nota, as vacinas de HPV com base em proteína da cápside L1 são produzidos em levedura (a vacina) ou num sistema de células de insecto (CERVARIX) 2. Vacinas HepΒ, Recombivax e Engerix-Β, também são produzidos em levedura, e são compostos de antigénio de superfície 3 HepΒ, 4. Usamos os sistemas de expressão de células de mamífero e de insecto para produzir VLPs que requerem a co-expressão de várias proteínas estruturais para montagem. O nosso trabalho centra-se na concepção, produção e vacinas baseadas em VLP depurar contra patógenos humanos: vírus influenza, vírus sincicial respiratório (RSV), vírus da dengue (DENV), e do vírus chikungunya (CHIKV). Os nossos métodos são flexíveis o suficiente para permitir a co-expressão das proteínas estruturais múltiplos a partir de vários plasmídeos de expressão, ou de um único plasmídeo de expressão (Figura 1). Anteriormente, produzida e purificada H5N1 VLP montado a partir da co-expressão de plasmídeos que codificam a hemaglutinina de influenza (HA), neuraminidase (NA), e da matriz (M1) em células 293T de rim embrionário humano 5,6. Os genes foram codões optimizados para a expressão em células de mamífero e clonado em pTR600, um vector de expressão eucariota que contém os citomegalovírus precoce imediato de promotor mais intrão A para iniciar transcription de inserções eucarióticas e o sinal de poliadenilação da hormona de crescimento bovino para a terminação da transcrição 7. Uma abordagem semelhante utilizando a co-expressão de três plasmídeo de HA, NA (Figura 1A) e uma proteína de matriz viral alternativa, o HIV Gag p55, foi usada para a geração de humano gripe sazonal subtipo H3N2 VLP neste estudo e foi mostrado para gerar VLP de tamanho similar como partículas de influenza 8. Embora as vacinas da gripe predominantemente eliciar anticorpos anti-HA, a adição da neuraminidase da gripe medeia a actividade de sialidase para permitir brotamento VLP a partir de células transfectadas e 9 também são alvos imunogénicos adicionais. Para produzir VLPs de RSV, que também seleccionado o núcleo não relacionados de HIV Gag para conceber vacinas prototípicos que apresentam glicoproteínas de superfície exclusivamente RSV para demonstrar ainda mais a flexibilidade de formação de VLP utilizando HIV Gag, como previamente descrito e caracterizado por microscopia electrónica de 6,10. Outrastêm mostrado previamente que as VLPs apresentando glicoproteínas de RSV pode ser montado utilizando vários componentes virais do vírus da Doença de Newcastle (NDV) 11, e a matriz de influenza 12. sequências de glicoproteína de superfície de comprimento completo foram utilizados neste estudo para reter conformações nativas, que possam ser necessárias para a ligação do receptor funcional e ensaio de reconhecimento do anticorpo por meio de ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Os nossos exemplos para a utilização de sistemas de expressão de plasmídeo isolados para gerar partículas são DENV e CHIKV. No caso de DENV, que podem produzir partículas sub-virais (SVPS) sem cápside em células 293T a partir de um único plasmídeo que contém uma cassete de expressão de prM / PT 13 gene estrutural. O termo SVP é utilizada para designar a ausência de uma proteína da cápside do núcleo ou na montagem de proteínas estruturais virais. CHIK VLP também pode ser produzida utilizando um único plasmídeo que contém uma proteína de cassete de genes estruturais, da cápside e de codificação do envelope CHIKV, ou em insect células, infectando com um baculovírus recombinante que codifica a mesma cassete de gene estrutural optimizados para a expressão de células de insecto (Figura 1B - C). O resultado final da expressão abordagens acima discutidas é a libertação de VLP em meio de cultura celular que pode então ser purificado através de ultracentrifugação através de uma almofada de glicerol 20%. Neste relatório, apresentamos métodos para expressar e purificar estas VLP a partir de sistemas de células de mamíferos e insetos.

<table><tbody><tr><td>Kit Maxi de Plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Life Technologies</td><td>L3000075</td><td>Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Expressão de Baculovírus Bac-to-Bac</td> Life <td>Technologies</td><td>10359-016</td><td></td></tr><tr><td>Placa agitadora multiponto Cimarec I 6</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga Polyclear</td><td>Seton</td><td>7025</td><td>Confirme os tubos apropriados para ultracentrífuga e tamanho de balde</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína Micro BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Tampão citrato de fosfato</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>o-fenilenodiamina dicloridrato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m topo do filtro de vácuo (500 ml)</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma</td><td>339741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10902-096</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

partículas semelhantes a vírus (VLPs) e partículas sub-virais (SVPS) são uma abordagem alternativa para concepção de uma vacina viral que oferece as vantagens de aumento da bio-segurança e estabilidade ao longo do uso de agentes patogênicos vivos. Não infeccioso e a auto-montagem, as VLP são utilizados para apresentar a proteínas estruturais como imunogénios, evitando a necessidade de agentes patogénicos vivos ou vectores virais recombinantes para a entrega de antigénio. Neste artigo, demonstramos as diferentes fases de concepção VLP e desenvolvimento para futuras aplicações em testes em animais pré-clínicos. O procedimento inclui as seguintes fases: selecção do antigénio, a expressão do antigénio na linha de células de escolha, purificação de VLP / SVPS, quantificação e para a dosagem de antigénio. Nós demonstramos a utilização de ambas as linhas celulares de mamífero e de insecto para a expressão de antigénios e os nossos demonstrar como metodologias diferem no rendimento. A metodologia apresentada podem ser aplicadas a uma variedade de agentes patogénicos e pode ser conseguido por substituição dos antigénios imunogénicos com Strproteínas uctural de microorganismo do usuário de interesse. VLP e SVPS auxiliar na caracterização de antigénios e selecção dos melhores candidatos a vacinas.

rendimentos VLP foram variáveis ​​por design construção de antigénio viral. Neste protocolo, demonstramos a utilização de células de insecto e de mamífero para a produção de SVP ou VLP em sobrenadante e purificação por ultracentrifugação. Quatro subtipos de gene estrutural cassetes de expressão DENV prM / E foram usadas para construir as versões do DENV SVPS demarcadas (1-4) como na Tabela 1 e demonstram uma gama entre 1,1-2,6 mg de proteína total em volumes de 0,6 ml. P...

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de partículas semelhantes a vírus, seja através de baculovírus ou sistemas de expressão de mamíferos e purificação ultracentrifugação. Esta abordagem altamente personalizada é utilizado para identificar antigénios virais como alvos de vacinas de maneira segura e flexível.

Expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

O objetivo geral deste procedimento é purificar partículas semelhantes a vírus, ou VLPs, expressas e secretadas por sistemas de expressão em células de mamíferos ou de insetos. Este método pode responder perguntas fundamentais na área da vacinologia, como a forma de expressar e purificar antígenos virais conformacionalmente relevantes de maneira segura e flexível. A principal vantagem desta técnica é que ela não requer precipitação proteica utilizando polietilenoglicol nem a preparação de múltiplas camadas de densidade para concentrar as VLPs.Embora este método possa fornecer subsídios para a identificação de antígenos virais como alvos de vacinas, partículas semelhantes a vírus (VLPs) também podem ser utilizadas como ferramentas para diagnóstico de doenças e sorologia. A demonstração visual deste método é essencial, pois a etapa de ressuspendência com sobrecamada de glicerol é difícil de aprender, já que iniciantes podem não adotar a técnica adequada. No dia da transfecção, prepare as soluções de lipossomos e de DNA conforme as recomendações do fabricante.Transfete as células com uma composição de DNA na proporção de um para um para dois de HA para NA para Gag e uma quantidade total de DNA de 40 microgramas por frasco T150. Repita este passo para criar nove frascos T150, obtendo um volume total de 200 mililitros. Em seguida, dilua as soluções de DNA e lipossomos em meio de transfeção sem soro e sem antibióticos, de modo que cada frasco contenha um volume total de 24 mililitros.Retorne os frascos ao incubador e mantenha as células e o meio de cultura de transvecção até o dia da colheita de partículas semelhantes a vírus, ou VLPs. Transfira o sobrenadante para tubos cónicos de 50 mililitros para colher a cultura das células após 72 a 96 horas pós-transvecção. Centrifugue as células para formar um pellet dos detritos celulares.Colete os sobrenadantes e filtre-os através de uma membrana de 0,22 mícron. Cultive células de Spodoptera frugiperda, ou células Sf9, previamente preparadas, em suspensão em frascos agitados, sob agitação contínua a 130 rpm em um sistema de placa agitadora multiponto. Mantenha os volumes de cultura em no máximo metade do volume do frasco agitado para uma boa aeração.Em seguida, expresse VLPs do CHIK infectando 250 mililitros de células Sf9 em um frasco agitado com densidade de dois vezes dez à sexta potência de células por mililitro com baculovírus recombinante previamente preparado e retorne as células para uma estufa a 28 graus Celsius. Utilize a exclusão com azul de tripano para determinar se a viabilidade celular diminuiu para 70 a 80%. Após a confirmação, transfira as culturas diretamente da suspensão para tubos cónicos de 50 mililitros e centrifugue as células. Colete os sobrenadantes e filtre-os através de uma membrana de 0,22 mícron antes da sedimentação.Esterilize seis tubos de ultracentrífuga de topo aberto, de 25 milímetros por 89 milímetros, com etanol 70%. Em seguida, certifique-se de que o etanol tenha secado completamente. Adicione 32 mililitros de sobrenadantes nos tubos limpos.Em seguida, sobrepõe cuidadosamente os sobrenadantes com três mililitros de glicerol estéril a 20% em PBS. Adicione o glicerol lentamente para evitar a perturbação da fina camada de densidade entre o glicerol e a solução de VLP. Dispensar o glicerol muito rapidamente causará a mistura entre as soluções de glicerol e de VLP, reduzindo a sedimentação dos VLP.Certifique-se de que os tubos estão balanceados, então inicie a centrifugação. Após quatro horas, remova os tubos da centrífuga. Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não deslocar o pellet do tubo.Resuspenda os VLPs sedimentados em pelo menos 100 microlitros na parte inferior dos tubos com PBS estéril, pipetando suave e lentamente para cima e para baixo. A ressuspensão do pellet de VLPs deve ser realizada com aspirações e expulsões lentas e suaves repetidas de PBS utilizando uma pipeta. Evite a formação de bolhas para limitar a perda de VLPs.Por fim, armazene os VLPs em suspensão. Os volumes de VLPs e o rendimento total de proteína obtidos a partir de um ensaio BCA convencional foram obtidos a partir de uma variedade de construtos SVP e VLP. Os rendimentos de SVP de CHIK a partir de células Sf9 variam entre 0,008 e 0,016 miligramas de proteína total por mililitro de volume do sobrenadante.Embora a produção por meio de células 293 T de mamífero resulte em uma redução dez vezes menor da proteína. Esta imagem de micrografia eletrônica mostra que as VLPs de influenza com núcleo HA Gag são expressas, montadas e purificadas com sucesso como VLPs. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de transfectar e infectar apenas culturas celulares saudáveis e viáveis, pois isso afetará os níveis gerais de expressão proteica.Após este procedimento, outros métodos como BCA, ELIZA e ensaios de HA podem ser realizados para medir o teor total de proteína, o teor de antígeno específico e a expressão da HA funcional. Não se esqueça de que trabalhar com uma ultracentrífuga pode ser perigoso e precauções, como balancear os tubos, usar apenas rotores e velocidades recomendados e supervisionar adequadamente o pessoal novo do laboratório, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

Este vídeo demonstra a geração de partículas semelhantes ao vírus da gripe (VLPs) em um sistema de mamíferos. Ao expressar três vetores de expressão eucariótica - codificando diferentes proteínas estruturais virais - em células hospedeiras de mamíferos adequadas, as proteínas virais expressas se auto-montam em VLPs na membrana plasmática do hospedeiro e são liberadas por brotamento da superfície celular.

Uma técnica para a geração de partículas semelhantes ao vírus da gripe por meio de um sistema de mamíferos

Este vídeo mostra como partículas semelhantes a vírus, VLPs são geradas infectando células de insetos com um baculovírus recombinante carregando o do gene do vírus chikungunya. O vírus recombinante infecta as células, levando à formação, montagem e liberação de VLP no meio de cultura para uso potencial na produção de vacinas.

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vírus vaccinia (VV) tem sido amplamente utilizada na investigação biomédica e da melhoria da saúde humana. Este artigo descreve um método simples, altamente eficiente para editar o genoma VV utilizando um sistema CRISPR-Cas9.

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Aqui, apresentamos um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos (VLPs). A imunoprecipitação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) derivada de VLPs é realizada usando anticorpos monoclonais específicos de glicoproteínas de envelope acoplados a contas magnéticas conjugadas por G. Os VLPs capturados são posteriormente submetidos à análise de SDS-PAGE e western blot empregando anticorpos específicos da proteína do núcleo viral.

Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em antígenos exibidos em vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLP) usando um ensaio de captura

O presente protocolo descreve a bioengenharia de vesículas de membrana externa como uma plataforma de vacina "Plug-and-Display", incluindo produção, purificação, bioconjugação e caracterização.

Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2

Aprenda a purificar partículas semelhantes a vírus expressas por sistemas de células de mamíferos ou insetos usando ultracentrifugação. Este método simplificado facilita a identificação segura de antígenos virais para vacinas.

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