Expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de partículas semelhantes a vírus, seja através de baculovírus ou sistemas de expressão de mamíferos e purificação ultracentrifugação. Esta abordagem altamente personalizada é utilizado para identificar antigénios virais como alvos de vacinas de maneira segura e flexível.

O objetivo geral deste procedimento é purificar partículas semelhantes a vírus, ou VLPs, expressas e secretadas por sistemas de expressão de células de mamíferos ou insetos. Este método pode responder a questões-chave no campo de uma vacina, como expressar e purificar antígenos virais conformacionalmente relevantes de maneira segura e flexível. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer precipitação de proteínas usando polietilenoglicol ou preparação de múltiplas camadas de densidade para concentrar VLPs.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a identificação de antígenos virais como alvos de vacinas, as VLPs também podem ser usadas como ferramentas para diagnóstico de doenças e sorologia. A demonstração visual desse método é crítica, pois uma base de glicerol nas etapas de ressuspensão da PVB é difícil de aprender porque os iniciantes podem não exercer a técnica adequada. No dia da transvecção, prepare soluções de lipossomas e DNA de acordo com as recomendações do fabricante.

Transvecção das células de ADN com uma composição de ADN de um a um a dois de HA para NA para Gag e uma quantidade total de ADN de 40 microgramas por balão T150. Repetir este passo para criar nove balões T150, para um volume total de 200 ml. Em seguida, diluir as soluções de ADN e lipossomas em meios de transvecção sem soro, sem antibióticos, de modo a que cada balão contenha um volume total de 24 ml.

Retorne os frascos à incubadora e mantenha as células e o meio de cultura de transvecção até o dia da colheita de uma partícula semelhante a um vírus, ou VLP. Transferir o sobrenadante para tubos cónicos de 50 mililitros para colher a cultura das células após 72 a 96 horas após a transvecção. Gire as células para baixo para pellet os detritos celulares.

Colete os sobrenadantes e filtre-os através de uma membrana de vazamento de 0,22 mícron. Cultivar células de Spodoptera frugiperda, ou Sf9, previamente preparadas, em suspensão em frascos giratórios, agitando continuamente a 130 rpm em um sistema de placa misturadora multiponto. Manter os volumes de cultura não superiores a metade do volume do balão giratório para uma correcta arejamento.

Em seguida, expresse as VLPs CHIK infectando 250 mililitros de células Sf9 em um frasco giratório a uma densidade de duas vezes dez elevado a seis células por mililitro com baculovírus recombinante previamente preparado e retorne as células a uma incubadora de 28 graus Celsius. Use a exclusão de azul de tripano para determinar se a viabilidade celular diminuiu para 70 a 80% Após a confirmação, transfira as culturas diretamente da suspensão para tubos cônicos de 50 mililitros e gire as células para baixo. Colete os sobrenadantes e filtre-os através de uma membrana de vazamento de 0,22 mícron antes da sedimentação.

Esterilize seis tubos de ultracentrífuga de topo aberto de 25 milímetros por 89 milímetros com etanol a 70%. Em seguida, certifique-se de que o etanol secou completamente. Carregue 32 mililitros de sobrenadantes nos tubos limpos.

Em seguida, subponha cuidadosamente os sobrenadantes com três mililitros de glicerol estéril a 20% e PBS. Aplique o glicerol lentamente para evitar a ruptura da fina camada de densidade entre o glicerol e a solução de VLP. Dispensar o glicerol muito rapidamente fará com que o glicerol e as soluções de VLP se misturem, reduzindo a sedimentação do VLP.

Certifique-se de que os tubos estejam equilibrados e comece a centrifugar. Após quatro horas, remova os tubos da centrífuga. Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não desalojar o pellet do tubo.

Ressuspenda as VLPs sedimentadas em pelo menos 100 microlitros no fundo dos tubos com PBS estéril, pipetando suave e lentamente para cima e para baixo. A ressuspensão do pellet VLP deve ser realizada com aspiração e expulsão repetidas suaves e lentas de PBS usando uma pipeta. Evite a criação de bolhas para limitar a perda de VLP.

Finalmente, armazene os VLPs ressuspensos. Os volumes de VLP e o rendimento total de proteína de um ensaio convencional de BCA foram obtidos de uma variedade de construções SVP e VLP. Os rendimentos do CHIK SVP das células Sf9 variam entre 0,008 a 0,016 miligramas de proteína total por mililitro de volume sobrenadante.

Enquanto a produção através de células T 293 de mamíferos produz uma redução de dez vezes na proteína. Esta imagem de micrografia eletrônica mostra que as VLPs de influenza com núcleo HA Gag são expressas, montadas e purificadas com sucesso como VLPs. Bem, ao tentar este procedimento, é importante lembrar de transvectar e infectar apenas culturas de células saudáveis e viáveis, pois isso afetará os níveis gerais de expressão de proteínas.

Após esse procedimento, outros métodos como BCA, ELIZA e AH podem ser realizados para medir o conteúdo de proteína total, o conteúdo de antígeno específico e a expressão do AH funcional. Não se esqueça de que trabalhar com uma ultracentrífuga pode ser perigoso e precauções como equilibrar os tubos, usar apenas rotores e velocidades recomendados e supervisão adequada do novo pessoal do laboratório devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.