Modelagem da Fagocitose Mediada por Complemento Usando Glóbulos Vermelhos Opsonizados In Vitro

Pegue glóbulos vermelhos de ovelha (SRBCs) com IgM-opsonizado com anticorpos IgM ligados aos antígenos da superfície celular.

Adicione soro contendo proteínas complementares, exceto C5.

O complexo C1 se liga aos anticorpos e se torna ativo.

O C1 ativado cliva C4 e C2, formando a convertase C3, que então cliva C3 e deposita C3b nas SRBCs.

Sem C5, C3b se degrada para C3bi.

Adicione os SRBCs a uma cultura de macrófagos.

O C3bi se liga ao receptor do macrófago, desencadeando a fagocitose do SRBC.

Adicione uma solução hipotônica para lisar e remova os SRBCs não internalizados.

Adicione um tampão de lise para lisar as células e libere hemoglobina SRBC.

Introduza um reagente de detecção.

Na presença de ureia, a hemoglobina catalisa a oxidação do diaminofluoreno pelo peróxido de hidrogênio, produzindo um produto colorido.

Meça a absorvância do produto colorido, que é proporcional aos SRBCs fagocitados.

Este ensaio modela a fagocitose de bactérias marcadas por anticorpos usando SRBCs opsonizados para imitar alvos bacterianos.

Para um ensaio de opsonização, incube 2 vezes 10 até o oitavo glóbulos vermelhos de ovelha ou SRBCs com 50 microlitros de imunoglobulina anti-SRBC de coelho M ou IgM por 30 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, incube os SRBCs opsonizados com 50 microlitros de soro humano deficiente em C5 por 30 minutos a 37 graus Celsius para fixar os fragmentos do complemento do inibidor de C3b e C3b nos SRBCs revestidos com IgM.

Em seguida, aspire o meio e adicione 100 microlitros de 1 vezes 10 aos sete SRBCs opsonizados por mililitro de meio a cada poço de uma placa de 96 poços contendo 1 vezes 10 até o quarto macrófagos murinos cultivados durante a noite por poço.

Incube a cocultura de macrófagos de camundongos SRBC por 1 hora a 37 graus Celsius e depois remova os SRBCs não ligados lavando com 100 microlitros de tampão de lise cloreto de amônio e potássio por 1 minuto.

Após a remoção dos SRBCs não ligados, enxágue com 100 microlitros de meio. Lisar as células restantes com dodecil sulfato de sódio 0,1% e tratar os lisados com 50 microlitros de 2,7-diaminofluoreno suplementados com peróxido de hidrogênio a 3% e ureia 6 molar.

Em seguida, meça a absorvância da formação de azul de flúor catalisada pela hemoglobina em um espectrofotômetro a 620 nanômetros.

Use uma curva padrão com valores de absorção de 620 nanômetros com número conhecido de SRBCs para determinar o número de SRBCs opsonizados que são fagocitizados.