Uso de um monócito monocamada Ensaio para Avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcy

O objetivo geral deste ensaio funcional in vitro é avaliar vários aspectos da fagocitose mediada por FC. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunohematologia e da medicina de transfusão de sangue, como qual é o significado clínico dos autoanticorpos e aloanticorpos para os glóbulos vermelhos. Esta técnica fornece um ensaio biológico funcional que pode ser realizado in vitro para prever o resultado da transfusão naqueles pacientes com anticorpos pré-formados contra glóbulos vermelhos.

Demonstrando o procedimento estará Cindy Tong, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Agora, não se esqueça de que trabalhar com sangue humano pode ser perigoso e que precauções como o uso de aventais e luvas de proteção devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento. Depois de obter uma a duas amostras de sangue total de 10 mililitros de um doador saudável em tubos vacutainer contendo citrato ácido dextrose por punção venosa, os tubos são colocados em uma cabine de biossegurança classe II e o sangue diluído na proporção de um para um em meio completo quente.

Em seguida, pipete lentamente as células sanguíneas pelas laterais de um tubo de centrífuga para o gradiente de densidade da temperatura ambiente, tomando cuidado para não misturar as camadas. Separe as células por centrifugação. Em seguida, descarte a camada superior de plasma e use uma pipeta de vidro Pasteur para transferir o PBMC contendo buffy coat para um novo tubo de 15 mililitros.

Lave os PBMCs isolados três vezes em PBS, ressuspendendo as células em três a sete mililitros de meio após a terceira centrifugação. Após a contagem, dilua as células para 1,75 vezes 10 elevado à sexta concentração de células por mililitro em meio completo e semeie 400 microlitros de células em cada poço de uma lâmina de oito câmaras para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 com umidade total. Para opsonizar os glóbulos vermelhos R2R2, primeiro lave os glóbulos vermelhos três vezes em PBS.

Diluir o pellet R2R2 após a terceira centrifugação na proporção de um para um com anticorpos anti-D policlonais de soro humano para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius com mistura intermitente. No final da opsonização, remova as células da incubadora e lave-as mais três vezes em PBS, conforme demonstrado. Ressuspenda o pellet a um volume de 1,25% para volume em meio RPMI completo.

Em seguida, substitua o sobrenadante de cada poço da lâmina de oito câmaras por 400 microlitros das células R2R2 opsonizadas por duas horas a 37 graus Celsius. No final da incubação, use os adaptadores de lâminas para remover as câmaras, enxugando o excesso de R2R2 com uma toalha de papel. Agora, encha um béquer de 100 mililitros com PBS e mergulhe lentamente cada lâmina 30 a 40 vezes na solução salina para remover a maior parte do R2R2 não fagocito.

Após a secagem, fixe as lâminas em 100% de metanol por 45 segundos e deixe as células secarem antes de montar as amostras com lamínulas. No dia seguinte, carregue cada lâmina em um microscópio de contraste de fase com uma lente objetiva de 40X e conte manualmente pelo menos 200 monócitos e o número de R2R2 fagocitados dentro de cada monócito usando um contador em cada mão para quantificar simultaneamente o número de monócitos e o número de células R2R2 fagocitadas por amostra. A imunoglobulina intravenosa se liga e bloqueia os receptores FC, inibindo a fagocitose de maneira dose-dependente, com uma inibição de quase 100% observada a partir de concentrações de 200 microgramas da imunoglobulina intravenosa por mililitro e com quase nenhuma inibição observada em concentrações abaixo de 0,5 microgramas do inibidor.

Quando os índices fagocíticos são normalizados para o controle positivo R2R2 como 0% de inibição, uma curva de inibição com um IC 50 de três microgramas por mililitro pode ser determinada. Com a experiência, a microscopia de contraste de fase pode ser usada para distinguir monócitos de glóbulos vermelhos contaminantes e vacúolos de glóbulos vermelhos fagocitados. Aglomerados de células densas e detritos devem ser evitados durante a quantificação, bem como a opsonização excessiva dos glóbulos vermelhos R2R2, que podem levar a uma fagocitose aumentada que superlota o interior do monócito e interfere em uma análise fagocítica precisa.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em seis a oito horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos como imunocitoquímica ou imunofluorescência usando microscopia confocal podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a expressão de proteínas fagocíticas, interações de glóbulos vermelhos e compartimentalização. Com seu desenvolvimento inicial e otimização adicional, essa técnica informará a maneira como os pesquisadores nas áreas de medicina transfusional e biologia celular exploram os sistemas de opsonização.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de monocamada de monócitos para avaliar os tipos de interação de anticorpos que provocam fagocitose.