Name: Uso de um monócito monocamada Ensaio para Avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcy (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprenda o ensaio de monocamada de monócitos para avaliar fagocitose mediada por receptor Fcγ usando monócitos primários isolados. Este método funcional auxilia na previsão de resultados de transfusão em pacientes com anticorpos pré-formados.

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Os autores agradecem aos Serviços de Sangue Canadenses por um Prêmio do Programa de Bolsas de Pós-Graduação para TNT Esta pesquisa recebeu apoio financeiro do Centro de Inovação dos Serviços de Sangue Canadenses, financiado pelo governo federal (Health Canada) e pelos ministérios provinciais e territoriais da saúde. As opiniões aqui contidas não refletem as opiniões dos governos federal, provincial ou territorial no Canadá.

Obter a aprovação para o uso de amostras humanas pela diretoria / conselho de revisão institucional de ética em pesquisa, e obter o consentimento assinado por todos os doadores humanos. O MMA também pode ser realizada utilizando PBMCs de ratinho de uma forma semelhante como o ensaio de humano, após a aprovação uso de animais ética. A MMA utiliza técnicas de cultura de tecidos de assepsia. NOTA: Veja a figura 1. NOTA: Embora nós recomendamos o uso de um gabinete de isolamento biológico nível 2 durante o ensaio para manter uma técnica asséptica, como o método é apenas um &quot;curto prazo&quot; método de cultura, não há tempo realmente o suficiente para que as bactérias contaminam o ensaio. Portanto, se um armário biocontenção nível 2 não existe, em vez de apenas comprar um para este ensaio, o ensaio pode ser efectuado fora de um armário de isolamento biológico, num banco aberto. O uso de uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2, no entanto, não é uma opção e deve ser utilizado paraos melhores resultados. 1. Sangue Periférico isolamento de células mononucleares <ol><li> Uma amostra de sangue total humano de um dador saudável ou de um paciente através de venipunctura usando VACUTAINERS contendo ácido-citrato-dextrose (ACD) anticoagulante (tubos amarelo-top). NOTA: O sangue total podem ser armazenados em ACD à temperatura ambiente (18-22 ° C) durante até 36 h antes de prosseguir para o próximo passo 11. Normalmente, 1-2 10 mL tubos vacutainer de sangue total são suficientes para o ensaio. </li><li> Dilui-se todo o sangue 1: 1 v / v em meio completo de RPMI morno (meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, HEPES 20 mM, e 0,01 mg / ml de gentamicina). </li><li> Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir do sangue total diluído utilizando densidade de centrifugação em gradiente, como recomendado pelo fabricante (Veja Lista de Materiais). Camada de sangue diluída muito lentamente ao longo do gradiente de densidade (aquecida até à temperatura ambiente, 18-22 ° C). NOTA: Minimizar a quantidade de mixing ao interface para a separação óptima do sangue por camadas cuidadosamente a mistura do sangue de uma maneira gota a gota, ou usando uma pipeta. <ol><li> Permitir que a mistura de sangue para a camada lentamente ao longo do topo do gradiente de densidade colocando a ponta da pipeta perto do gradiente de densidade e ao permitir que a mistura de sangue a correr para o lado do tubo muito lentamente. </li><li> Dependendo da escala da experiência, a camada de 10 mL de mistura sangue em cima de 3 mL de gradiente de densidade (em um tubo de 15 ml) ou uma camada de 35 mL de mistura sangue no topo de 15 ml de gradiente de densidade (em uma de 50 mL tubo). Tipicamente, 10 ml de sangue total produz 10 milhões de PBMC, com alguma variação doador para doador. NOTA: É muito importante que não há mistura da mistura com o sangue por gradiente de densidade. A mistura de sangue deve camada sobre o gradiente de densidade e subir lentamente até que todo o sangue está no topo do gradiente de densidade. </li><li> Centrifugar a mistura em camadas a 700 g durante 30 min, sem freios. o centrmistura ifuged deve separar em 5 camadas (de cima para baixo): plasma, creme leucocitário (contendo PBMC), material de gradiente de densidade, granulócitos, e hemácias. </li><li> Remover e descartar a maior parte do plasma e recuperar o conteúdo cuidadosamente buffy coat (PBMC) para um novo tubo de 15 ml, utilizando uma pipeta de Pasteur e uma bomba de sucção. NOTA: A remoção da camada buffy coat é efectivamente feito através da aplicação de sucção na pipeta de Pasteur durante a execução de um movimento circular em torno do exterior da camada, com a ponta da pipeta contra o tubo. </li></ol></li><li> Lavam-se as PBMCs isoladas três vezes em solução salina tamponada a pH 7,3 com fosfato (PBS) por centrifugação a 350 xg durante 10 min (com freios completas) entre lavagens. Reconstituir o sedimento de PBMC em meio RPMI completo. Dependendo do tamanho do grânulo, 3-7 mL de meio é suficiente. </li><li> Contar o PBMC usando azul de tripano e um hemocitómetro. Contam apenas as células que não estão manchados pelo azul de tripano. Reconstitute as PBMC a 1.750.000 células / ml em meio RPMI completo. </li><li> Semente 400 ul (700000 células) em cada poço de uma corrediça 8 câmaras. Incubar a lâmina em uma temperatura de 37 ° C, totalmente humidificado incubador de cultura de tecido (suplementado com 5% de CO 2) durante 1 h para permitir que os monócitos / macrófagos a aderir. </li></ol> 2. Pré-tratamento da aderidos monócitos NOTA: Este passo só é necessário se à procura de formas de inibir ou aumentar a fagocitose. <ol><li> Pré-tratamento com monócitos aderidos qualquer droga (s) ou composto (s) de interesse. Reconstituir o fármaco (s) ou outro material de teste para a concentração desejada com meio RPMI completo. NOTA: Por exemplo, 200 ug / mL de IVIG é normalmente usado para produzir uma inibição de 95-100% de fagocitose quando utilizando monócitos humanos. </li><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante contendo as células não aderentes a partir da corrediça de 8 câmaras após a incubação de 1 h (a seguir ao passo 1.6). Substitua-o por 400uL de uma droga ou outro tipo de tratamento e incubar durante 1 h a 37 ° C. <ol><li> Quando aspiração e substituindo soluções no slide 8-câmara, certifique-se de controlar o fluxo dos fluidos de modo que as células fracamente aderentes não decolar. Além disso, trabalhar com apenas 2-3 poços vazios de cada vez e evitar a secagem dos poços. NOTA: Tipicamente, cada tratamento é realizado em triplicado técnicas. </li></ol></li></ol> 3. Opsonização de R 2 R 2 Glóbulos vermelhos NOTA: O R 2 R 2 utilizadas aqui são obtidas a partir da Colecção Blood Center (Canadian Blood Services), mas que também estão comercialmente disponíveis. Opsonizado R 2 R 2 GVs são utilizados como um controlo positivo para a fagocitose mediada por FcyR. Naïve R 2 R 2 deve ser armazenado em solução de Alsever (para prolongar a vida de prateleira) a 4 ° C durante até 1 mês. A solução da Alsever é feito em casa e composta por 0,8% W / v de citrato de trissódio (di-hidratado), 1,9% w / v de dextrose, 0,42% w / v de cloreto de sódio, e 0,05% w / v de ácido cítrico (mono-hidrato). Se R 2 R 2 células não estão disponíveis, outras células Rh-fenotipados, tais como R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 R, ou R2 R, pode ser utilizado. <ol><li> Lavar R2 R2 (CDE / CDE), células vermelhas do sangue em PBS um total de três vezes utilizando centrifugação a 350 xg durante 5 min cada. NOTA: A quantidade de glóbulos vermelhos necessários depende do tamanho experimental e pode ser re-calculado. Sempre lavar uma quantidade em excesso de glóbulos vermelhos, uma vez que os glóbulos vermelhos são perdidas durante cada lavagem devido à lise ou durante a remoção do sobrenadante. Por exemplo, numa experiência com 5 tratamentos e 2 os controlos, todos realizados em triplicado técnicos, há um total de 21 poços. 21 poços com 400 ul / cavidade de 1,25% indica que RBC mistura 105 ul de pré-embaladas, opsonizado RBC são necessários. 200 uL de RBC deve ser inicialmente lavado e 150 &amp; #181; L deve ser opsonizados para assegurar que existe uma quantidade adequada de glóbulos vermelhos para o passo de fagocitose. </li><li> Opsonizar o lavado R 2 R 2 pelete com 1: 1 de anticorpos v / v de anti-D policlonais a partir de soro humano e incubar durante 1 h a 37 ° C, com agitação intermitente. NOTA: Se os anticorpos anti-D policlonais não estão disponíveis, é possível a utilização de anticorpos monoclonais anti-D, os quais estão comercialmente disponíveis, ou anti-D, que é normalmente utilizado para Rh profilaxia imunitária, que pode ser obtido a partir de bancos de sangue ou transfusão Serviços. testes de otimização deve ser realizada no início, durante a configuração do ensaio, e sempre que mudar um monte de anticorpos policlonais titulados-un ou a mudança para um anticorpo monoclonal. Este é o de identificar a melhor concentração ou o volume de anti-D necessário para um teste de antiglobulina (IAT) resultado de entre 3+ e 4+ e um resultado de fagocitose entre 70-90 GVs fagocitados por 100 monócitos contados. </li><li> Lava-se a opsonizard R 2 um total de três vezes em PBS utilizando centrifugação a 350 xg durante 5 min cada R 2. NOTA: opsonização bem sucedida de R 2 R 2 pode ser confirmada através da realização de uma IAT indirecta. Resumidamente, anticorpos policlonais anti-humanos secundários são adicionados para se ligar anticorpos opsonizantes primários em superfícies de RBC, e o sinal amplificado pode ser observada sob a forma de hemaglutinação. Um protocolo fabricante detalhada pode ser encontrada no arquivo de materiais suplementares. </li><li> Reconstituir o lavado R 2 R 2 pelete a 1,25% v / v, utilizando meio RPMI completo. NOTA: O excesso de R opsonizado 2 R 2 podem ser armazenados em solução de Alsever a 4 ° C durante até uma semana. </li></ol> 4. A fagocitose mediada pelo receptor Fc <ol><li> Aspirar o sobrenadante do meio de droga ou a partir do slide 8-câmara e adicionar 400 uL de a 1,25% v / v de R 2 R 2 mistura. Incubar a 37 ° C durante 2 h. </li><li> à réer 2 h de incubação, remove as câmaras que utilizam adaptadores do fabricante. Dab o excesso de R 2 R 2 sobre uma toalha de papel. Certifique-se de que o slide não seque. </li><li> Encher um copo de 100 mL com PBS. Submerge e lavar a lâmina lentamente movendo a lâmina e para trás (cerca de 30-40 pancadas) para remover a maioria do fagocitados-un R 2 R 2. </li><li> Remova a lâmina do PBS. Dab o excesso de PBS utilizando uma toalha de papel ou tecido e deixe secar o slide. </li><li> Fixar a lâmina seca ao ar em 100% de metanol durante 45 s. Em seguida, deixe secar a lâmina fixa. NOTA: As lâminas podem ser corrigidos usando um outro método que é mais compatível para a coloração jusante, como a mancha Grünwald-Giemsa 21 ou a mancha Wright-Giemsa 22. </li><li> Monte a lâmina utilizando um in-house-made de montagem ELVANOL médio (ou outro meio de montagem disponível no mercado) e adicionar lamelas. NOTA: Elvanol meio de montagem é composto por 15% w / v poresina de álcool lyvinyl e 30% v / v de glicerina em PBS. A mistura é aquecida até que toda a resina tenha dissolvido e a glicerina é misturado de forma homogénea. Isto pode ser substituído por outro meio de montagem disponível comercialmente. </li><li> Permitir ao monte a secar durante a noite antes da quantificação. </li></ol> 5. A quantificação da fagocitose <ol><li> Usando um microscópio de contraste de fase e uma lente de objectiva de 40x, quantificar manualmente a quantidade de eventos fagocíticas contando pelo menos 200 monócitos e o número de fagocitados R 2 R 2 dentro desses monócitos. Possui um contador em cada mão para quantificar simultaneamente o número de monócitos e o número de fagocitados R 2 R 2. </li><li> Obter o índice fagocítica média dividindo-se o número de fagocitados R 2 R 2 pelo número de monócitos e multiplicando por 100. expressar os dados como a média (média) de índice fagocítica ± o erro padrão da média (SEM). </li&gt; </ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O MMA é uma técnica trabalhosa que requer experiência tanto em cultura de tecidos e microscopia. Há vários passos críticos para garantir o sucesso: 1) geração da monocamada de monócitos; 2) opsonização dos glóbulos vermelhos, e 3) quantificação manual. A monocamada de monócitos não adere muito fortemente ao slide câmara, de modo que o pH fisiológico deve ser mantida durante todo o ensaio de 11 e um número adequado de PBMC deve ser semeadas. pipetagem vigorosa, a qual poderia perturbar as células aderidas, devem ser evitados. Uma abordagem é sempre remover e adicionar soluções a partir do mesmo canto da câmara, e para assegurar que o movimento é lento e constante. Do mesmo modo, durante o último passo de lavagem para remover o excesso de glóbulos vermelhos, o movimento deve ser lento e constante. Isto garante um mínimo de perturbações para a monocamada enquanto ainda remover a maioria dos GVs fagocitados-un. lavagem inadequada irá conduzir a uma elevada interferência de fundo dos GVs contaminantes, o que torna o manual quantification difícil. Em segundo lugar, os R 2 R 2 hemácias deve ser suficientemente opsonizado para se obter um índice médio de 80-120 fagocítica para o controlo fagocitose. Esta gama fagocítica desejado estabelece um equilíbrio entre a facilidade de contagem (por exemplo, monócitos com mais de 5 fagocitados GVs são difíceis de quantificar com precisão) e manutenção de uma quantidade adequada de fagocitose para análise estatística. O grau de opsonização pode ser confirmada por um IAT, e é necessária uma leitura entre 3+ a 4+. O R 2 R 2 hemácias deve ser descartado quando não há excesso de lise durante a lavagem, em que o sobrenadante passa a vermelho escuro, ou quando ocorre uma diminuição significativa na fagocitose é observado em experiências devido ao envelhecimento das células em armazenamento. Por último, a quantificação manual usando o microscópio pode ser complicado, especialmente quando se compara contagens entre o pessoal de laboratório e entre experimentos. Ao examinar o mesmo campo em cada poço, ou simplesmente pela contagem mais células, Uma contagem mais consistente pode ser obtido. formação lado-a-lado com um técnico experiente e a utilização de um conjunto de lâminas de formação designada é recomendado. Uma grande crítica do MMA é a subjetividade da etapa de quantificação manual. No entanto, com formação adequada, a consistência pode ser obtido através de diferentes contadores. Outra limitação é a diferenças intrínsecas doador-a-doador em monócitos capacidades fagocíticas e em R 2 R níveis de expressão do antigénio de superfície 2, que é uma fonte de variação dos dados quando se lida com amostras humanas. Outras técnicas alternativas estão disponíveis para examinar a fagocitose FcyR mediada. A maioria dos kits comerciais utilizam saída fluorescente para monitorizar a fagocitose (por exemplo, biopartículas, a proteína de fluorescência sensível ao pH, ou IgG-esferas de látex marcadas fluorescentes). O uso de saída fluorescente não oferecem quantificação mais objetiva, mas também é preciso conconsiderar as disponibilidade, custo, e de formação associada com o uso de um microscópio de fluorescência ou um citómetro de fluxo, bem como a dependência que se seguiu após kits disponíveis comercialmente. Finalmente, este ensaio pode ser modificado, dependendo da questão de pesquisa. Por exemplo, no ensaio de inibição de droga de fagocitose, monócitos pode ser pré-tratado ou co-incubadas com ambos os fármacos e RBCs opsonizadas (ou seja, um ensaio de competição). A sinalização a jusante de anticorpos de diferentes subtipos, anticorpos quiméricos, ou construções recombinantes pode também ser testada. Com os recentes avanços no desenvolvimento de um sangue antígeno-nulo universal 24, o MMA poderia ser utilizada em telas iniciais desses hemácias antígeno-nulo com vários anticorpos para avaliar se há de fato uma eficácia reduzida no desencadeamento de fagocitose.

O ensaio de monocamada de monócitos (MMA) é um ensaio in vitro originalmente desenvolvido para melhor prever os resultados de transfusão de sangue em pacientes com auto ou aloanticorpos para hemácias (hemácias)1-5. Ao avaliar o efeito dos anticorpos anti-RBC na mediação da fagocitose mediada pelo receptor Fcγ (FcγR) usando este ensaio in vitro, é possível prever o resultado clínico in vivo. De fato, o MMA tem sido usado com sucesso para evitar a destruição imunológica de hemácias ligadas a anticorpos, apesar da transfusão de sangue sorologicamente incompatível5. O procedimento pré-transfusional típico para testes de compatibilidade, também denominado crossmatching, envolve métodos sorológicos que incluem a tipagem do sangue do paciente para antígenos ABO e Rh e a triagem da presença de anticorpos anti-RBC no paciente6. O sangue compatível para ABO/Rh é selecionado e, se houver anticorpos, é feita uma tentativa de identificá-los para que o sangue para transfusão possa ser selecionado para evitar esses antígenos. Um resultado ideal de prova cruzada ocorre quando todo o sangue do doador é sorologicamente compatível com o sangue do paciente, o que reduz o risco de hemólise pós-transfusional7. No entanto, esse sistema é insuficiente para o pequeno grupo de pacientes que se tornaram aloimunizados após transfusões repetidas ou gravidez. Esses pacientes produzem aloanticorpos contra antígenos eritrocitários específicos. Alguns produzem anticorpos para antígenos de frequência muito alta na população em geral e, portanto, tornam-se progressivamente mais difíceis de cruzar8,9. Somando-se à complexidade, nem todos os aloanticorpos são clinicamente significativos; em outras palavras, a ligação de um aloanticorpo às hemácias detectadas por um teste sorológico não resulta necessariamente em hemólise quando sangue incompatível e antigeno positivo é transfundido. O MMA foi originalmente desenvolvido para avaliar o potencial significado clínico do sangue sorologicamente incompatível em um ambientetransfusional 1-5.
Uma vez que a hemólise extravascular de hemácias ligadas a anticorpos é conhecida por ser mediada pelo sistema de fagócitos mononucleares, monócitos/macrófagos primários são utilizados no desenvolvimento de ensaios diagnósticos. O primeiro ensaio para estudar a interação de monócitos, hemácias e anticorpos foi publicado em 1975, mas as condições subótimas utilizadas levaram apenas à formação de rosetas (a ligação das hemácias à periferia do monócito), e nenhuma fagocitose foi observada10. Modificações significativas no ensaio foram feitas por vários grupos, levando a um ensaio para o qual o nível de fagocitose de hemácias ligadas a aloanticorpos poderia ser correlacionado com o resultado clínico da hemólise1-5. Recentemente, as condições ideais de armazenamento de amostras clínicas e a otimização adicional das condições de ensaio foram examinadas para aumentar a utilidade de uma prova cruzada de MMA clínica usando amostras autólogas de pacientes11.
Três outras técnicas diagnósticas foram empregadas além do MMA na previsão de resultados transfusionais: o teste de liberação de 51Cr, o teste de roseta e o teste de quimioluminescência (CLT). No teste de liberação de 51Cr, o paciente é injetado com 51hemácias de doadores marcadas com Cr, e a meia-vida das hemácias marcadas é monitorada e é preditiva de sobrevida ou depuração pós-transfusional12,13. Como esse método usa materiais radioativos, raramente é mais realizado. O teste da roseta envolve a mistura e incubação de monócitos com hemácias e a quantificação do nível de formação da roseta (sem fagocitose)14. O significado clínico dos anticorpos in vivo envolve fagocitose ativa por macrófagos encontrados no baço e/ou no fígado; portanto, este método não fornece uma leitura relevante da fagocitose. O CLT usa luminol para monitorar a explosão oxidativa durante a fagocitose de monócitos de hemácias, uma vez que o luminol fluoresce em azul quando oxidado no fagossomo15. Este método é bom, mas a contaminação por neutrófilos pode confundir a leitura. Comparações paralelas foram feitas para avaliar a sensibilidade, praticidade e reprodutibilidade dos quatro métodos disponíveis, e tanto o CLT quanto o MMA foram classificados como superiores16. No entanto, o CLT tem sido utilizado principalmente na avaliação da doença hemolítica do feto e do recém-nascido (HDFN), e o pH ideal do ensaio de 8,0 pode comprometer o nível de fagocitose11.
Além de sua utilidade diagnóstica e clínica, o MMA foi modificado para outros fins de pesquisa. De fato, o MMA pode não apenas servir como um ensaio funcional para abordar discrepâncias entre sorologia e biologia, mas também tem sido usado para investigar retrospectivamente a causa da hemólise após terapia com imunoglobulina intravenosa (IVIG)17. Também tem sido usado para examinar a estrutura-função de inibidores químicos da fagocitose mediada por FcγR18-20 e para estudar a sinalização a jusante da fagocitose mediada por FcγR21. Em nosso laboratório, além de usar um MMA humano, estamos desenvolvendo um MMA murino usando células mononucleares primárias do sangue periférico de camundongo (PBMCs) e hemácias autólogas. A justificativa é rastrear anticorpos que podem induzir a fagocitose mediada por FcγR como um intermediário para o desenvolvimento de um modelo de camundongo com anemia hemolítica autoimune in vivo (AIHA) (dados não publicados). As várias modificações se concentram em diferentes aspectos do anticorpo IgG e da interação FcγR que induzem a fagocitose.

<table><tbody><tr><td>Vacutainers de citrato ácido dextrose (ACD)</td><td>BD</td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Multicell&nbsp;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>https://www.gelifesciences.com/</td></tr> <tr><td>Fosfato tamponado solução salina</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>8 câmaras slides</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R2R2 (cDE/cDE) glóbulos vermelhos</td><td>Canadian Blood Services</td><td></td><td>Comercialmente disponível (e.g., http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>Anti-D policlonal a partir de soro humano</td><td>Gamma Biologics</td><td>DIN 02247724</td><td>Pode ser substituído por anti-D monoclonal comercialmente disponível ou por imunoglobulina Rh</td></tr><tr><td>100% metanol</td><td>Caledon</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>Resina</td> <td>de álcool polivinílicoSigma</td><td>P8136</td><td>Pode ser substituído por uma montagem disponível no mercado</td></tr><tr><td>Glicerina UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>Opcional para IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

uso de um monócito monocamada ensaio para avaliar a fagocitose mediada pelo receptor fcy

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Embora originalmente desenvolvido para prever resultados transfusionais de sangue sorologicamente incompatível, o ensaio de monocamada de monócitos (MMA) é um ensaio in vitro altamente versátil que pode ser modificado para examinar diferentes aspectos da fagocitose mediada por anticorpos e receptores Fcγ (FcγR) em ambientes clínicos e de pesquisa. O ensaio utiliza monócitos aderentes de células mononucleares do sangue periférico isoladas de sangue total de mamíferos. O MMA foi descrito para uso em investigações humanas e murinas. Esses monócitos expressam FcγRs (por exemplo, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB e FcγRIIIA) que estão envolvidos nas respostas imunes. O MMA explora o mecanismo de interações mediadas por FcγR, fagocitose em particular, onde os glóbulos vermelhos (hemácias) sensibilizados por anticorpos aderem e/ou ativam FcγRs e são subsequentemente fagocitados pelos monócitos. In vivo, principalmente macrófagos teciduais encontrados no baço e no fígado realizam fagocitose mediada por FcγR de hemácias opsonizadas por anticorpos, causando hemólise extravascular. Ao avaliar o nível de fagocitose usando o MMA, diferentes aspectos do processo mediado por FcγR in vivo podem ser investigados. Algumas aplicações do MMA incluem prever a relevância clínica de aloanticorpos ou autoanticorpos em um ambiente de transfusão, avaliar medicamentos candidatos que promovem ou inibem a fagocitose e combinar o ensaio com microscopia fluorescente ou immunoblotting ocidental tradicional para investigar os efeitos de sinalização a jusante de medicamentos ou anticorpos que envolvem FcγR. Algumas limitações incluem a laboriosidade dessa técnica, que leva um dia inteiro do início ao fim, e a exigência de aprovação ética em pesquisa para trabalhar com sangue de mamíferos. No entanto, com diligência e treinamento adequado, os resultados do MMA podem ser obtidos em um tempo de rotatividade de 24 horas.

Seguindo os passos cruciais na Figura 1 e o procedimento acima descrito, o MMA pode ser realizada de forma reprodutível. IVIG foi usado como um exemplo para a inibição da fagocitose na Figura 2. IVIG é conhecido por se ligar e bloquear os receptores Fc, inibindo, assim, o resultado a jusante de fagocitose. Por titulação da quantidade de IVIG utilizado, uma inibição dependente da dose é observada, em que as concentrações acima de 200 ng / mL resultou em perto de 100% de inibição e as concentrações inferiores a 0,5 ug / ml não inibiu a todos (Figura 2A). Quando os índices fagocíticas são transformadas e normalizada para o controlo positivo R 2 R 2 como 0% de inibição, uma curva de inibição, com uma IC50 de 3 ng / mL pode ser determinada (Figura 2B). Além de realizar o ensaio de forma consistente, quantificação do ensaio, por vezes, pode ser difícil. A Figura 3 é um conjunto de imagens de microscopia de contraste de fase de vários diapositivos de MMA. Com microscopia experiência, pode-se distinguir um monócitos a partir de um contaminante de RBC (Figura 3D), ou de um vacúolo de um RBC fagocitado (Figura 3B). Conjuntos densos de células e / ou detritos deve ser evitada durante a quantificação (Figuras 3E e F). Além disso, deve-se evitar o excesso de opsonizantes o R 2 R 2 RBC, o que levaria a fagocitose aumentada que superlota o interior de monócitos e interfere com a quantificação exacta (Figura 3C). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama esquemático do MMA. Uma descrição passo a passo dos passos cruciais no MMA: isolamento de PBMC a partir de sangue total, que alimenta o monocyt aderidaES opsonizado com R 2 R 2, e lavagem das lâminas de câmara. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> Figura 2. IgG intravenosa (IVIG) inibe a fagocitose in vitro, utilizando o MMA. IVIG é que inibem a fagocitose e é usado como um controlo de inibição no MMA humano. (A) A titulação de IVIG resultou numa inibição dependente da dose da fagocitose quando em comparação com o não tratado R 2 R 2 controle. Os resultados mostram a média ± o erro padrão da média (SEM) de n = 3 experiências. A análise estatística foi realizada utilizando Student t -test: ** p≤0.01 e *** p≤0.001. (B) curva de inibição de IVIG com uma IC 50 OF 3? g / mL (linha pontilhada). Os resultados mostram dados normalizados para não tratado R 2 R 2 (0% de inibição); média ± SEM de n = 3 experiências. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> Figura 3. As imagens de microscopia de contraste de fase de lâminas de amostra em 40X. (A) O slide perfeito em que os monócitos fagocitado 1-2 R 2 R 2, em média (setas pretas com um brilho de halo distintivo), com muito poucos contaminantes, un-fagocitado R 2 R 2 no fundo (setas brancas). Vacúolos (B) Como mostrado neste slide, monócitos, por vezes, têm aumentado (setas brancas), que podem ser confundidos com fagocitado R 2 R 2. (C &lt;/ forte&gt;) Quando R 2 R 2 foram sobre-opsonizado, mais do que 4-5 fagocitados R 2 R 2 por monócitos (setas pretas) rende exacta contando difícil, uma vez que a R 2 R 2 são aglomeradas no monócitos e células distintas limites não podem ser distinguidos. (D) lavagem inadequada do slide leva a abundante R2 R2 contaminação (setas brancas), que poderia ser confundido com hemácias aderiram. (E) Às vezes, monócitos e glóbulos vermelhos contaminantes podem formar clusters. Clusters também indicar a contaminação bacteriana, o que deve ser evitado. (F) Os monócitos podem formar agregados maiores, que devem ser evitados durante a quantificação. Usando seleção aleatória dos campos para ver, painel A é o que é geralmente observado se o MMA tem sido realizada corretamente. barra de escala é de 20 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui</a>para ver uma versão maior desta figura.

O ensaio de monocamada de monócitos (MMA) é um ensaio in vitro que utiliza monócitos primários isolados obtidos de sangue total periférico de mamíferos para avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcγ (FcγR).

Uso de um monócito monocamada Ensaio para Avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcy

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

O objetivo geral deste ensaio funcional in vitro é avaliar vários aspectos da fagocitose mediada por FC. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunohematologia e da medicina de transfusão de sangue, como qual é o significado clínico dos autoanticorpos e aloanticorpos para os glóbulos vermelhos. Esta técnica fornece um ensaio biológico funcional que pode ser realizado in vitro para prever o resultado da transfusão naqueles pacientes com anticorpos pré-formados contra glóbulos vermelhos.Demonstrando o procedimento estará Cindy Tong, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Agora, não se esqueça de que trabalhar com sangue humano pode ser perigoso e que precauções como o uso de aventais e luvas de proteção devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento. Depois de obter uma a duas amostras de sangue total de 10 mililitros de um doador saudável em tubos vacutainer contendo citrato ácido dextrose por punção venosa, os tubos são colocados em uma cabine de biossegurança classe II e o sangue diluído na proporção de um para um em meio completo quente.Em seguida, pipete lentamente as células sanguíneas pelas laterais de um tubo de centrífuga para o gradiente de densidade da temperatura ambiente, tomando cuidado para não misturar as camadas. Separe as células por centrifugação. Em seguida, descarte a camada superior de plasma e use uma pipeta de vidro Pasteur para transferir o PBMC contendo buffy coat para um novo tubo de 15 mililitros.Lave os PBMCs isolados três vezes em PBS, ressuspendendo as células em três a sete mililitros de meio após a terceira centrifugação. Após a contagem, dilua as células para 1,75 vezes 10 elevado à sexta concentração de células por mililitro em meio completo e semeie 400 microlitros de células em cada poço de uma lâmina de oito câmaras para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 com umidade total. Para opsonizar os glóbulos vermelhos R2R2, primeiro lave os glóbulos vermelhos três vezes em PBS.Diluir o pellet R2R2 após a terceira centrifugação na proporção de um para um com anticorpos anti-D policlonais de soro humano para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius com mistura intermitente. No final da opsonização, remova as células da incubadora e lave-as mais três vezes em PBS, conforme demonstrado. Ressuspenda o pellet a um volume de 1,25% para volume em meio RPMI completo.Em seguida, substitua o sobrenadante de cada poço da lâmina de oito câmaras por 400 microlitros das células R2R2 opsonizadas por duas horas a 37 graus Celsius. No final da incubação, use os adaptadores de lâminas para remover as câmaras, enxugando o excesso de R2R2 com uma toalha de papel. Agora, encha um béquer de 100 mililitros com PBS e mergulhe lentamente cada lâmina 30 a 40 vezes na solução salina para remover a maior parte do R2R2 não fagocito.Após a secagem, fixe as lâminas em 100% de metanol por 45 segundos e deixe as células secarem antes de montar as amostras com lamínulas. No dia seguinte, carregue cada lâmina em um microscópio de contraste de fase com uma lente objetiva de 40X e conte manualmente pelo menos 200 monócitos e o número de R2R2 fagocitados dentro de cada monócito usando um contador em cada mão para quantificar simultaneamente o número de monócitos e o número de células R2R2 fagocitadas por amostra. A imunoglobulina intravenosa se liga e bloqueia os receptores FC, inibindo a fagocitose de maneira dose-dependente, com uma inibição de quase 100% observada a partir de concentrações de 200 microgramas da imunoglobulina intravenosa por mililitro e com quase nenhuma inibição observada em concentrações abaixo de 0,5 microgramas do inibidor.Quando os índices fagocíticos são normalizados para o controle positivo R2R2 como 0% de inibição, uma curva de inibição com um IC 50 de três microgramas por mililitro pode ser determinada. Com a experiência, a microscopia de contraste de fase pode ser usada para distinguir monócitos de glóbulos vermelhos contaminantes e vacúolos de glóbulos vermelhos fagocitados. Aglomerados de células densas e detritos devem ser evitados durante a quantificação, bem como a opsonização excessiva dos glóbulos vermelhos R2R2, que podem levar a uma fagocitose aumentada que superlota o interior do monócito e interfere em uma análise fagocítica precisa.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em seis a oito horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos como imunocitoquímica ou imunofluorescência usando microscopia confocal podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a expressão de proteínas fagocíticas, interações de glóbulos vermelhos e compartimentalização. Com seu desenvolvimento inicial e otimização adicional, essa técnica informará a maneira como os pesquisadores nas áreas de medicina transfusional e biologia celular exploram os sistemas de opsonização.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de monocamada de monócitos para avaliar os tipos de interação de anticorpos que provocam fagocitose.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós apresentamos um ensaio de fluxo de alto rendimento por citometria de determinar a atividade fagocítica de antígenos-anticorpos específicos a partir de amostras clínicas, utilizando antígenos fluorescentes revestido contas e uma linha celular monocítica expressar múltiplos receptores Fc-proporcionando o uso do receptor e determinações atividade fagocitária em um padronizados e forma reproduzível para qualquer antígeno de interesse.

Determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos Clínica

Fonte: Nagre, N., et al. Macrófago alveolar, fagocitose e eliminação bacteriana em camundongos. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra a avaliação da fagocitose mediada pelo receptor do complemento usando glóbulos vermelhos de ovelha opsonizados com IgM e complemento, seguida de sua absorção por macrófagos de camundongos. A extensão da fagocitose é quantificada medindo um produto cromogênico azul formado por oxidação catalisada por hemoglobina do diaminofluoreno.

Modelagem da Fagocitose Mediada por Complemento Usando Glóbulos Vermelhos Opsonizados In Vitro

Este vídeo demonstra um ensaio de fagocitose baseado em citometria de fluxo envolvendo eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum marcados e opsonizados por monócitos. A citometria de fluxo identifica fluorescência em monócitos, confirmando a identificação bem-sucedida de eritrócitos opsonizados por meio de fagocitose.

Um ensaio para quantificar a fagocitose mediada por anticorpos de eritrócitos infectados por parasitas

Este vídeo mostra um ensaio de monocamada de monócitos utilizando monócitos primários do sangue periférico para avaliar a fagocitose mediada por receptor Fcγ com glóbulos vermelhos R2R2 opsonizados por anticorpos poli D.

Um ensaio para estudar a fagocitose induzida pelo receptor Fcγ em monocamadas de monócitos

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para explorar a influência imunomoduladora das células-tronco mesenquimais (MSCs) na proliferação de células T efetoras. O ensaio inclui a co-cultura de MSCs com PBMCs para induzir a população de monócitos a adquirir um fenótipo imunomodulador, levando à secreção de interleucina-10 (IL-10). Após a incubação com células T CD4+ ativadas, os monócitos induzidos suprimem efetivamente a proliferação de células T.

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Um ensaio in vitro para medir a fagocitose celular dependente de anticorpos por fagócitos

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

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Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

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Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.

Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

Desenvolvemos aprimoramentos e atualizamos métodos para o ensaio monocito-monocamada (MMA) existente, no qual os macrófagos são usados para ajudar a prever melhor a relevância clínica dos aloanticorpos de glóbulos vermelhos na medicina transfusional e imunologia. Este ensaio é denominado ensaio de monócitos-macrófagos (M-MA).

Previsão da significância do anticorpo eritrocitário usando o ensaio de monócitos-macrófagos

Aprenda o ensaio de monocamada de monócitos para avaliar fagocitose mediada por receptor Fcγ usando monócitos primários isolados. Este método funcional auxilia na previsão de resultados de transfusão em pacientes com anticorpos pré-formados.

Uso de um monócito monocamada Ensaio para Avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcy

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