Um ensaio bactericida sérico para a atividade bactericida mediada por complemento de anticorpos

Pegue uma amostra de soro diluída em série contendo anticorpos monoclonais contra lipopolissacarídeos, ou LPS - um componente da membrana externa de bactérias gram-negativas.

Introduza bactérias gram-negativas. Os anticorpos séricos se ligam ao LPS bacteriano.

Adicione proteínas do complemento. O complexo C1 liga-se a anticorpos ligados ao LPS, formando um C1 enzimaticamente ativo.

C1 ativado cliva C4 e C2 para formar C3 convertase, que cliva C3 para formar C5 convertase. A convertase cliva C5 para produzir C5b, que recruta C6 e C7. O complexo resultante se insere na membrana externa e se associa a C8 e C9 múltiplo, formando um poro.

O dano à membrana externa desestabiliza a membrana interna, causando lise celular.

Coloque a mistura em um prato de ágar e espalhe. Incubar para crescimento bacteriano. Cubra a placa com ágar contendo cloreto de trifenil tetrazólio, ou TTC, que é reduzido por desidrogenases microbianas, conferindo uma cor vermelha às colônias bacterianas.

O número de colônias aumenta com a diluição da amostra, indicando atividade bactericida reduzida com menor concentração de anticorpos.

Para começar, incube as amostras em banho-maria morno a 56 graus Celsius por 30 minutos para inativar as amostras de teste. Obtenha uma placa de ensaio e 20 microlitros de tampão de ensaio nas colunas 1 a 12 das linhas A a G. Adicione 20 microlitros de tampão de ensaio nas colunas 1 e 2 da linha H. Carregue 30 microlitros de cada amostra de teste em duplicata na linha H da placa de ensaio.

Para começar a realizar diluições seriais triplas das amostras de teste, use uma pipeta multicanal para remover 10 microlitros dos poços 3H a 12H. Transfira as amostras para os poços correspondentes na linha G e pipete para cima e para baixo 8 a 10 vezes para misturar bem a amostra. Em seguida, remova 10 microlitros desses poços, transfira para os poços correspondentes na linha F e pipete para cima e para baixo de 8 a 10 vezes para misturar. Continuar este processo de diluição em série através da linha A. Depois de misturar os poços na linha A, remova e descarte 10 microlitros dos poços 3A a 12A para que o volume final em todos os poços seja de 20 microlitros.

Recupere um frasco de estoque bacteriano-alvo congelado e descongele-o à temperatura ambiente. Em seguida, diluir as bactérias em 20 ml de tampão de ensaio de acordo com o factor de diluição óptimo predeterminado. Usando uma pipeta multicanal, adicione 10 microlitros de bactérias diluídas a cada poço da placa de ensaio.

Recupere um frasco para injetáveis de complemento de coelho bebé congelado e um frasco para injetáveis de BRC congelado inativado pelo calor. Use água corrente fria para descongelar os frascos até a temperatura ambiente. Em seguida, misture 100 microlitros de calor e BRC inativado por calor com 400 microlitros de tampão de ensaio. Adicione 50 microlitros desta solução de BRC inativada por calor a 20% a todos os poços na coluna 1. Misture 1 mililitro de BRC nativo com 4 mililitros de tampão de ensaio. Adicione 50 microlitros desta mistura de 20% a todos os poços nas colunas 2 a 12. Coloque a placa em um agitador de placas por 10 a 15 segundos para misturar suavemente a placa de ensaio.

Incubar a placa de ensaio em uma incubadora microbiológica por duas horas. Enquanto isso, remova as tampas de duas placas de ágar LB e coloque as placas voltadas para cima em um armário de segurança biológica por 40 a 60 minutos para secar. Quando a incubação estiver completa, transfira a placa de ensaio para gelo úmido e incube por 10 a 20 minutos para interromper a reação. Usando uma pipeta de 12 canais, misture os poços na linha H e coloque 10 microlitros da mistura de reação no fundo de uma placa LBA. Incline imediatamente a placa e deixe as manchas correrem por cerca de 1,5 a 2 centímetros.

Repita este procedimento para as linhas G, F e E, identificando-as acima da linha anterior. Incube as placas de LBA à temperatura ambiente até que a solução seja absorvida pelas placas de LBA. Em seguida, coloque as tampas nas placas e transfira-as de cabeça para baixo em uma incubadora microbiológica para incubar durante a noite.

No dia seguinte, adicione 25ml de ágar de cobertura a 55 graus Celsius contendo 100 microgramas por mililitro de TTC e 0,1% de azida de sódio em cada placa de LBA. Incube a 37 graus Celsius por duas horas para permitir que as bactérias sobreviventes desenvolvam uma cor vermelha. Em seguida, use uma câmera digital para fotografar as placas. Transfira as imagens para um computador e use o software integrado de enumeração de colônias do NIST para analisar as imagens conforme descrito no protocolo de texto.