Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a atividade proteolítica da neurotoxina botulínica em matrizes complexas, como amostras farmacêuticas, ambientais e alimentícias. Isso é realizado pelo primeiro teste de processamento e amostras de curva padrão, se necessário, para estabelecer condições adequadas de pH e viscosidade. Em seguida, a neurotoxina botulínica é imunoprecipitada das amostras usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos.

Em seguida, os grânulos magnéticos são cuidadosamente lavados para remover quaisquer compostos interferentes e ressuspensos em um tampão de reação otimizado. Finalmente, as contas lavadas são incubadas com um repórter de proteína e medem espectroscopicamente a clivagem do repórter ao longo do tempo. Em última análise, a comparação da clivagem do repórter nas amostras de teste versus as amostras de curva padrão é usada para quantificar a atividade da toxina botulínica nas amostras de teste com sensibilidade de bioensaio de camundongo a camundongo próximo.

As principais vantagens desta técnica sobre outros métodos, como camundongos, bioensaios, imunológicos e outros métodos fluorescentes, são que este ensaio não requer o uso de animais e foi demonstrado para uso em matrizes altamente complexas encontradas em amostras alimentícias, ambientais e farmacêuticas. Geralmente, os indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque é necessário um processamento e diluição cuidadosos da amostra. Demonstrando este procedimento estará o Dr. Mark Dunning, cientista da Bio Sentinel.

Prepare tampões de acordo com o protocolo de texto para gerar uma curva padrão para quantificar amostras de teste, pesar 10 mais ou menos 0,01 gramas de amostra de alimento sólido em um tubo cônico de 50 mililitros e reserve esta amostra será usada como diluente em um segundo tubo, pese dois mais ou menos 0,01 gramas de amostra de alimento sólido. Adicione neurotoxina botulínica ou comprada na superfície da amostra de alimento de dois gramas até uma concentração final de 30.000 MLD 50 por grama de alimento. Incube o diluente e as amostras enriquecidas em temperatura ambiente ou quatro graus Celsius por duas horas para dar ao bot tempo para interagir com a matriz alimentar.

Imitando uma contaminação natural, consulte o protocolo de texto para tipos de amostra adicionais. Em seguida, adicione um mililitro de GPB por grama de alimento às amostras enriquecidas e não enriquecidas e use um pilão para homogeneizar até ficar bem misturado. Extrapole o volume total da amostra enriquecida de dois gramas a partir do volume total aproximado da amostra diluente de 10 gramas.

Em seguida, adicione um 10º volume de 10 x tampão de neutralização à amostra de diluente de 10 gramas e dois gramas compraram uma amostra enriquecida com base em seus volumes totais. Amostras misturadas bem por inversão, esclarecem parcialmente ambas as amostras centrifugando por 10 minutos a 6.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius. Em seguida, remova imediatamente os sobrenadantes e transfira para novos tubos usando o bot uma amostra enriquecida como D uma e a amostra não enriquecida como diluente para gerar as amostras de curva padrão restantes em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Para preparar amostras de alimentos sólidos, comece pesando dois mais ou menos 0,01 gramas de amostra sólida desconhecida em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione dois mililitros de GPB e use um pilão para homogeneizar a amostra. Em seguida, adicione um décimo do volume de 10 x tampão de neutralização à amostra e misture bem por inversão após clarificar parcialmente a amostra por centrifugação por 10 minutos a 6.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius transfira imediatamente pelo menos 750 microlitros de sobrenadante para um tubo de microcentrífuga.

Esta é uma diluição desconhecida. Adicione 675 microlitros do diluente a dois tubos rotulados como diluição desconhecida dois e três. O diluente será o mesmo material processado usado para geração de curva padrão.

Use a diluição um para fazer a diluição em série, transferindo 75 microlitros de diluição um para o tubo de diluição dois e misturando. Em seguida, transfira 75 microlitros de diluição dois para o tubo de diluição três e misture. Para clarificar as amostras, centrifugá-las durante cinco minutos pelo menos 14 000 vezes. Gravidade.

Remova imediatamente os sobrenadantes e transfira para novos tubos para configurar uma placa para amostras, adicione 20 microlitros de 10 x tampão de ligação a cada poço cada amostra desconhecida e as amostras curvas padrão D um a D oito requerem três poços e a amostra D nove requer seis poços. Adicione 200 microlitros de cada amostra aos respectivos poços e use um misturador de microplacas para misturar a placa por 10 segundos. Vortex os grânulos IPA por 10 segundos na velocidade mais alta ou até que seja totalmente ressuspenso.

Em seguida, pipete 20 microlitros de grânulos em cada poço de amostra e misture a placa por 30 segundos. Incube a placa em uma incubadora de placas rotativas por duas horas a 750 RPM e 25 graus Celsius ou temperatura ambiente para lavar a placa usando uma lavadora de placas automatizada. Depois de executar o programa principal, coloque a placa na placa de separação de esferas magnéticas de 96 poços na arruela de placas.

Em seguida, execute o programa de lavagem mestre. Quando o programa estiver concluído, remova a placa da arruela. Adicione 50 microlitros de um tampão de reação x a cada poço de amostra e misture por 30 segundos.

Para iniciar o ensaio de matriz de teste bot, adicione 50 microlitros de repórter AE 0,5 micromolar. Para cada poço de amostra para evitar efeitos de borda, adicione 100 microlitros de água a cada não utilizado. Bem, use fita de teto para selar a placa, proteja-a da luz e incube-a a 750 RPM e 25 graus Celsius ou temperatura ambiente.

A cada tempo de leitura, remova a placa da incubadora. Remova a fita do teto e coloque imediatamente a placa Na placa de separação de contas magnéticas de 96 poços, deixe as contas se separarem por dois minutos. Coloque a placa no leitor de microplacas e meça as emissões em cerca de 470 e cerca de 526 nanômetros sob excitação em cerca de 434 nanômetros.

Se desejar tempos de leitura adicionais, após suspender novamente os grânulos por 30 segundos no misturador de microplacas, feche novamente a placa e devolva-a à incubadora. Aqui são mostrados os resultados do ensaio Usando bot a holo toin cravado em PBS e testado após incubações de duas, quatro e 24 horas com o repórter AE. A clivagem do repórter por bot é medida como uma redução na taxa de emissão medida por nosso leitor de placas como aproximadamente 2,7 para o repórter intacto a cerca de 0,7 para o repórter totalmente clivado.

Os valores específicos serão diferentes entre os leitores de placas, conforme visto pelo deslocamento para a esquerda na curva, o tempo de incubação prolongado com o repórter resulta em aumento da clivagem do repórter. Os pontos de dados testados em triplicata exibem baixo desvio padrão da média e seguem a tendência esperada de aumento da taxa de emissão com diminuição da carga de toxinas. A falha do ensaio em seguir esta tendência esperada pode indicar um erro durante a geração da diluição ou os dados que traçam as taxas de emissão dos controles que não contêm bot A também permanecem estáveis durante a incubação, indicando a falta de atividade de protease não específica.

Esta figura demonstra a metodologia geral usada para detectar ou quantificar qualquer amostra desconhecida em relação a uma curva padrão e quantifica as amostras farmacêuticas de bot a. Uma curva padrão foi gerada em PBS com bot purificado, um holo toin e processada em paralelo com diluições de medicamento gerado a partir de um único frasco de 100 unidades de Botox liofilizado reidratado em solução salina a 0,9% neste ensaio, a porção linear da curva padrão fica entre uma taxa de emissão de 2,11 e 1,05, e é indicada pela caixa tracejada na figura. As concentrações das três incógnitas que se enquadram nessa faixa linear foram então interpoladas a partir da curva padrão.

Neste experimento, tomates frescos e 2% de leite foram usados como matrizes alimentares sólidas e líquidas e enriquecidos com um complexo composto pelas proteínas associadas ao núcleo hollo, toin e neurotoxina. Essa combinação foi selecionada porque se assemelha à toxina produzida durante uma contaminação natural por clostrídio, conforme mostrado aqui. A recuperação do bot A é observada com ambas as matrizes.

Além disso, o aumento do tempo de incubação com o repórter aumenta a sensibilidade do ensaio, mas não resulta em taxas de emissão diminuídas para os controles sem toxina, indicando os resultados de clivagem observados do bot A e não da protease não específica transportada do alimento no ensaio. O bot A-L-O-D-L-O-Q e EC 50 para ambos os alimentos em cada ponto de tempo mostrado estão resumidos nesta tabela. O LOD e o LOQ são definidos como a amostra de concentração mais baixa com uma taxa de emissão inferior a três e 10 desvios-padrão abaixo do fundo, respectivamente.

Espera-se alguma variabilidade de matriz para matriz em LOD e LAQ, pois os efeitos da matriz podem influenciar a ligação da toxina aos grânulos e a recuperação dos grânulos durante a lavagem. Embora pareça que houve mais recuperação de toxinas de 2% de leite do que de tomates a partir dos dados, grande parte dessa diferença resulta da diluição adicional necessária para homogeneizar amostras de tomate em GPB. Além de ser uma matriz alimentar sólida, o tomate é um tipo de amostra notável em que o ajuste do pH e da força iônica é fundamental para o sucesso do ensaio.

Esta figura ilustra as respostas do ensaio ao testar tomates com ou sem inclusão do tampão de neutralização 10 x. A falha em adicionar o tampão resulta em má recuperação do bot A das amostras e é demonstrada por uma taxa de emissão constante em todas as concentrações de bot A testadas, a adição do tampão de neutralização de 10 x, no entanto, resulta na detecção de toxinas sensíveis, proteases inespecíficas podem ser endógenas à amostra de alimento ou introduzidas ao usar preparações de bot não purificadas, como cultura de Clostridium, sobrenadantes e podem clivar o relator de EA, levando a resultados falsos positivos. Este exemplo demonstra a atividade de protease inespecífica encontrada em sobrenadantes de cultura de Clostridium bot a usando um repórter modificado que não é mais clivado pelo bot A. Os altos níveis de clivagem do repórter indicam a cultura.

O sobrenadante contém atividade protease significativa, que é efetivamente negada pela adição de inibidores de protease. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada entre quatro e 26 horas de tempo total de ensaio, dependendo do tipo de amostra e da carga de toxina. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e quantificar a neurotoxina botulínica de amostras complexas usando imunoprecipitação em um sistema repórter de proteína baseado em fluorescência.

Não se esqueça de que trabalhar com neurotoxinas botulínicas pode ser extremamente perigoso e precauções como luvas, códigos de laboratório e cabines de segurança química e biológica devem ser usadas durante a realização deste procedimento.