Name: Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-03T22:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprenda a isolar e quantificar a neurotoxina botulínica em matrizes complexas usando imunoprecipitação com micropartículas magnéticas e ensaio fluorimétrico. Este método oferece sensibilidade comparável ao bioensaio em camundongos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores gostariam de agradecer a H. Olivares e D. Ruge para discussões e conselhos valiosos. Esta pesquisa foi apoiada em parte por um prêmio NSF SBIR (IIP-1127245 para BioSentinel Inc.) e um contrato do Departamento de Defesa (W81XWH-07-2-0045 para BioSentinel Inc.).

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin e WC Tucker são funcionários ou proprietários de BioSentinel Inc. BioSentinel atualmente fabrica e comercializou alguns dos reagentes apresentados neste relatório.

Este protocolo descreve procedimentos para a quantificação de BoNT / A complexa, holotoxina, Clostridium ou de sobrenadante de cultura em matrizes complexas. O protocolo é o mesmo, no entanto, ao testar outros serotipos BoNT (por exemplo, de BoNT / B, E e F), com os seus respectivos ensaios de matriz 56,60, embora a sensibilidade do ensaio irá variar entre os serotipos e ensaios. Este protocolo não conta para cada tipo de amostra possível e algumas modificações que podem ser necessárias, dep...

Neurotoxinas botulínicas (BoNTs) são as substâncias mais letais conhecidos, com doses letais humanos intravenosos estimadas em 1-3 ng / kg 1,2. Sete serotipos estruturalmente semelhantes de BoNT, rotulados de A a G, existem, cada um constituído por um domínio de cadeia pesada responsável pela ligação à célula, a absorção e a translocação para o citosol e uma cadeia leve que codifica uma endopeptidase de zinco 3-5. A toxicidade requintado de BoNT resulta, em parte, a sua entrada obrigatória e específica para os neurônios motores na junção neuromuscular 6. Uma vez dentro do neurônio, a endopeptidase cadeia leve cliva especificamente um ou mais do-N-sensível etilmaleimida receptor solúvel da proteína fator de fixação (SNARE) proteínas necessárias para a fusão das vesículas, inibindo a liberação de neurotransmissores e levando a paralisia flácida 7-14. Vulgarmente conhecida como a doença &quot;botulismo&quot;, paralisia do diafragma e músculos intercostais por BoNT finalmente, resulta eminsuficiência respiratória e morte, a menos que o diagnóstico precoce eo tratamento são recebidos. Transmitidas por alimentos Humano botulismo é mais comumente associado com BoNT sorotipos A, B, E e F (BoNT / A, BoNT / B, etc) e, geralmente, resulta da ingestão de alimentos contaminados 15,16, embora, vários casos de botulismo de feridas foram relatados entre os usuários de drogas injetáveis ​​17,18. Nos Estados Unidos, o botulismo infantil resultante da ingestão de esporos de Clostridium por crianças com menos de um ano de idade é a forma mais comum de botulismo 19-21. No entanto, de origem alimentar surtos BoNT resultantes de conservas casa imprópria e processamento de alimentos foram relatados, tanto nos Estados Unidos e no exterior. Entre 2000-2009, pelo menos 338 casos de botulismo alimentar foram relatados em todo o mundo, incluindo seis mortes 22. A capacidade de detectar com rapidez e sensibilidade surtos de botulismo de origem alimentar é uma indicação importante que pode auxiliar no diagnóstico precoce 23,24. Além disso, os métodos de detecção que permitem que o custo-benefício e análise de alimentos de rotina vai levar à melhoria da segurança alimentar. Especificidade neuronal do BoNT e longa meia-vida biológica, também faz com que seja um agente terapêutico potente. Nos Estados Unidos, as drogas à base de BoNT são aprovados pela Food and Drug Administration para o tratamento de condições de cosméticos e perturbações relacionadas com neuromusculares incluindo linhas glabelares, distonia cervical, enxaqueca, bexiga hiperactiva, e estrabismo. Inúmeras aplicações &quot;off-label&quot; são documentados, incluindo tratamentos com altas doses para a disfunção muscular grave 25-28. Accurate quantificação de toxina é fundamental para o doseamento correcto, como subdoses podem conduzir a um tratamento ineficaz, enquanto sobredosagem coloca os doentes em risco de efeitos secundários potencialmente prejudiciais. Infelizmente, nenhum protocolo de teste de potência padronizada é compartilhada entre fabricantes, resultando em desigualdades definição unidade entre produtores de drogas baseado em BoNTcts 29-31. O teste padrão para BoNT é o bioensaio em que BoNT contendo amostras são injetadas por via intraperitoneal em camundongos e os números de óbitos registrados mais de 1-7 dias 16,32,33. O bioensaio é muito sensível com limites de detecção (LOD) de 5-10 pg BoNT / A 34, no entanto, as preocupações éticas sobre o uso de animais, o alto custo de treinamento de pessoal e manutenção de instalações de animais, longos tempos de ensaio, bem como a falta de protocolos padronizados resultou em chamadas para desenvolver padronizado, livre de animal testes BoNT e métodos de quantificação 35-39. Recentemente, vários métodos alternativos de quantificação BoNT foram desenvolvidos que oferecem mouse ou quase-rato sensibilidade bioensaio 40-49. Esses métodos geralmente usam de fluorescência, espectrometria de massa, ou métodos imunológicos e oferecer tempos de ensaio consideravelmente mais curto que o bioensaio em ratos sem uso de animais. Espectrometria de massa combinada com abordagens techniq imunológicaues foram mostrados para detectar e quantificar BoNT contida nos alimentos e outras amostras complexas, no entanto, os requisitos de formação de pessoal e equipamento especializado limite Estes ensaios 50-55. A maioria dos outros ensaios alternativos não são facilmente aplicáveis ​​a testes de amostras complexas ou não têm o rendimento necessário para o teste BoNT rotina. A natureza altamente variável de viscosidade da amostra de alimento, pH, teor de sal, e constituintes da matriz apresenta um desafio especialmente difícil quando tentando desenvolver métodos in vitro de ensaio com sensibilidade para combinar a potência extrema de BoNT. Além disso, mesmo sistemas de tampão simples e relativamente benignas, tais como os que resultam da libertação de medicamentos à base de BoNT, conter sal, albumina, e estabilizadores de açúcar (isto é, excipientes) que ter um impacto significativo na potência in vitro de BoNT 56. Purificação Toxina é necessário para testes atividade precisa de todos, mas a mais simples das amostras 56-59. OBoTest ensaios Matrix foram projetados para rápida, de alta taxa de transferência, e quantificação consistente de BoNT a partir de amostras de alta complexidade, utilizando equipamentos comumente encontrados em laboratórios de pesquisa 56,60. Estes ensaios use esferas paramagnéticas covalentemente ligadas a anticorpos anti-BoNT sorotipo-específicos para ligar e seqüestrar BoNT de uma amostra e, em seguida, remover a interferir compostos de matriz por lavagem. Após a lavagem, a atividade proteolítica limite BoNT é então quantificada em um tampão de reação otimizada usando um repórter compatível com o sorotipo BoNT sendo testado. Estes repórteres são proteínas f luorogénicos que consistem de uma proteína fluorescente ciano N-terminal (PCP) e uma porção proteína fluorescente amarela derivado do C-terminal (Vénus) radical ligado por um substrato de BoNT, os resíduos 141-206 ou os resíduos de SNAP25 sinaptobrevina 33-94 constituindo o BoTest A / E ou B / D / F repórteres / g, respectivamente 45. Repórter clivagem por BoNT é monitorado usando Förster transferência de energia por ressonância (FRET). Quando tO repórter está intacta, excitação do PCP resulta em FRET a Vênus, extinguindo PCP emissão e emissão Vênus emocionante. A clivagem do repórter por BoNT impede FRET, levando a um aumento na emissão de PCP e diminuição da emissão de Vénus. Actividade de BoNT pode então ser medida quantitativamente usando a razão das emissões PCP e Vénus. LOD inferior a 3 pg são possíveis a partir de uma vasta gama de alimentos, utilizando um formato de placa de 96 poços de alto rendimento 56. O aumento de sensibilidade pode ser obtido usando os volumes de amostra maiores uma vez que o ensaio permite a concentração de toxina na superfície do grânulo. Os ensaios Matrix BoTest para BoNTs A, B, E, e F foram desenvolvidos e testados com alimentos, produtos farmacêuticos e amostras ambientais 56,60. Aqui, nós descrevemos processos para a execução destes ensaios para a detecção de BoNT em baixa complexidade (por exemplo, produtos farmacêuticos, BoNT em tampão) e alta complexidade (por exemplo, alimentos, ambiental) amostras. Métodos de processamento específicospara vários tipos de amostras são abordadas neste protocolo e tipos de amostras não descritos aqui geralmente pode ser adaptado usando uma combinação dos métodos apresentados. O protocolo foi desenvolvido e testado com BoNT / A, mas pode ser adaptado para outros serótipos de BoNT utilizando os seus respectivos ensaios, como demonstrado em outros lugares 56,60.

<table><tbody><tr><td>Kit de detecção de neurotoxina botulínica BoTest Matrix A</td><td>BioSentinel</td><td>A1015</td><td>Kits de detecção para BoNT/B e F também estão disponíveis.</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas de fluorescência Varioskan Flash</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5250040</td><td>A maioria das unidades baseadas em monocromador ou filtro com excitação de 434 nm e capacidade de emissão de 470 nm e 526 nm podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Placa de separação de esferas magnéticas de 96 poços</td><td>V & P Scientific</td><td>VP771H</td><td>Outras placas magnéticas podem ser usadas, mas a placa deve ser projetada para separar as contas ao lado do poço.</td></tr><tr><td>Arruela de Placas Compatível com Contas Magnéticas</td><td>BioTek</td><td>ELx405 VSRM</td><td>Opcional, necessário apenas para lavagem automatizada de placas.&nbsp; Outras arruelas de placa compatíveis com contas magnéticas também podem ser usadas, mas devem ser testadas antes do uso.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td>Opcional, necessário apenas para amostras que necessitam de centrifugação.</td></tr><tr><td>Misturador de placas MixMate</td><td>Eppendorf</td><td>22674200</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td>Usado à temperatura ambiente ou a 25 &graus; C Se o controle de temperatura estiver disponível</td></tr><tr><td>, comprimidos inibidores de protease sem EDTA</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Necessário apenas para testes alimentares ou ambientais. Os inibidores da protease devem ser isentos de EDTA.</td></tr><tr><td>BoNT/A</td><td>Metabiológicos</td><td>Opcional, necessário apenas para fins de padronização e quantificação</td>Placas pretas de fundo plano de 96 poços NUNC 237105 As placas não devem ser tratadas Fita de vedação de placas de 96 poços <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os botest matrix ensaios

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Detecção e quantificação de neurotoxina botulínica (TB) em matrizes complexas exacta é necessário para produtos farmacêuticos, ambientais e de teste da amostra de alimento. É necessário o teste rápido BoNT de alimentos durante surto forense, o diagnóstico do paciente e testes de segurança de alimentos, enquanto for necessário os testes de potência exata para fabricação de produtos à base de drogas BoNT e segurança do paciente. O bioensaio amplamente utilizado para testes de BoNT é altamente sensível, mas não tem a precisão e rendimento necessário para o teste rápido e rotineiro BoNT. Além disso, o uso do bio-ensaio de animais resultou em apelos de autoridades reguladoras de produtos de drogas e defensores dos direitos dos animais em os EUA e no exterior para substituir o bioensaio em ratos para testar BoNT. Vários ensaios in vitro de substituição têm sido desenvolvidos que funcionam bem com BoNT purificada em tampões simples, mas a maior parte não tem sido mostrado para ser aplicável a ensaios em matrizes altamente complexas. Aqui, um protocolo para a detecção deBoNT em matrizes complexas utilizando os BoTest Matrix ensaios é apresentado. O ensaio consiste em três partes: A primeira parte envolve a preparação das amostras para teste, a segunda parte é um passo de imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-BoNT esferas paramagnéticas revestidas de anti-corpo para purificar BoNT a partir da matriz, e a terceira parte quantifica proteolítica da BoNT isolado atividade usando um repórter fluorogênico. O protocolo é escrito para o teste de alto rendimento em placas de 96 poços utilizando matrizes tanto de líquidos e sólidos e requer cerca de 2 hr da preparação manual com tempos totais de doseamento de 4-26 horas, dependendo do tipo de amostra, carga de toxinas, e sensibilidade desejada. Os dados são apresentados para BoNT / D teste com solução salina tamponada com fosfato, um medicamento, o sobrenadante de cultura, de 2% de leite, e os tomates frescos e inclui a discussão de parâmetros críticos para o sucesso do ensaio.

Um diagrama que resume as etapas do protocolo descrito é mostrado na Figura 2. O ensaio requer entre 4-26 horas para ser concluído, dependendo do tipo de amostra e sensibilidade do ensaio desejado, mas apenas ~ 2 horas de hands-on do tempo. O ensaio é realizado em placas de 96 poços e, dependendo do tipo de teste a ser realizado, permite o teste em triplicado de uma amostra de 20, incluindo as normas por placa. A Figura 3 mostra os resultados do ensaio usand...

A neurotoxina botulínica BoTest Matrix (BoNT) ensaios de detecção de purificar e quantificar rapidamente BoNT a partir de uma variedade de matrizes de amostra. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de BoNT a partir de matrizes sólidos e líquidos e demonstrar o ensaio com BOTOX, tomate e leite.

Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a atividade proteolítica da neurotoxina botulínica em matrizes complexas, como amostras farmacêuticas, ambientais e alimentares. Isso é realizado primeiramente processando as amostras de teste e da curva padrão, se necessário, para estabelecer condições adequadas de pH e viscosidade. Em seguida, a neurotoxina botulínica é imunoprecipitada das amostras utilizando esferas magnéticas revestidas com anticorpos.Em seguida, as microesferas magnéticas são lavadas cuidadosamente para remover quaisquer compostos interferentes e ressuspendidas em um tampão de reação otimizado. Por fim, as microesferas lavadas são incubadas com um repórter proteico e a clivagem do repórter é medida espectroscopicamente ao longo do tempo. Em última análise, a comparação da clivagem do repórter nas amostras-teste com as amostras da curva padrão é utilizada para quantificar a atividade da toxina botulínica nas amostras-teste com sensibilidade próxima à do bioensaio em camundongo.As principais vantagens desta técnica em comparação com outros métodos, como o bioensaio com camundongo, métodos imunológicos e outros métodos fluorescentes, são que este ensaio não reque

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra um imunoensaio multiplex baseado em esferas para quantificar vários alvos de citocinas em uma amostra. Uma mistura de microesferas distintas conjugadas a anticorpos específicos de citocinas é usada para ligar as citocinas presentes na amostra. Os repórteres marcados com estreptavidina são imobilizados nas citocinas ligadas usando anticorpos de detecção biotinilados. A citometria de fluxo identifica as citocinas ligadas com base nos tamanhos únicos e nas intensidades de...

Um imunoensaio multiplex baseado em grânulos para quantificar vários alvos de citocinas

A cadeia leve da neurotoxina botulínica tipo A (BoNT/A LC) é uma metaloprotease que entra nos neurônios motores, cliva seu substrato SNAP-25 e interrompe a neurotransmissão, resultando em paralisia flácida. Utilizando um ensaio baseado em FRET compatível com alto rendimento, grandes bibliotecas de pequenas moléculas podem ser rastreadas quanto ao seu impacto na atividade enzimática de BoNT/A LC.

Uma plataforma baseada em FRET compatível com alto rendimento para identificação e caracterização de moduladores de cadeia leve de neurotoxina botulínica

A neurotoxina botulínica é uma das toxinas mais potentes entre os agentes de risco biológico da Categoria A, mas uma terapêutica pós-exposição não está disponível. A abordagem de imagem de alto conteúdo é uma metodologia poderosa para identificar novos inibidores, pois permite a triagem multiparamétrica usando neurônios motores biologicamente relevantes, o principal alvo dessa toxina.

A alta Ensaio imagem Conteúdo de Identificação da neurotoxina botulínica Inibidores

Um protocolo personalizado é descrito para diferenciar células ES de camundongos em populações definidas de neurônios altamente puros exibindo sinapses funcionais e comportamento de rede emergente. A análise eletrofisiológica demonstra a perda da transmissão sináptica após a exposição aos sorotipos de neurotoxina botulínica / A- / G e neurotoxina tetânica.

Avaliação Funcional de neurotoxinas Biológica em Culturas em Rede de Células-Tronco derivadas do Sistema Nervoso Central Neurônios

Este protocolo apresenta um método validado de cromatografia líquida-mobilidade iónica e espectrometria de massa de alta resolução para determinar a presença de alcaloides da cravagem nos alimentos, em conformidade com o Regulamento (UE) 2023/915 da Comissão, recentemente publicado.

Detecção de Alcalóides Ergot Regulados em Matrizes de Alimentos por Cromatografia Líquida - Espectrometria de Mobilidade Iônica Aprisionada - Espectrometria de Massa por Tempo de Voo

Explantes a partir do sistema de dopamina mesencéfalo e corpo estriado são utilizados num ensaio de matriz de colagénio para...

Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno

Circuitos neurais são topograficamente organizados em compartimentos funcionais específicas com perfis moleculares. Aqui, apresentamos os passos práticos e técnicos para revelar topografia cérebro global usando uma abordagem de coloração imuno-histoquímica wholemount versátil. Nós demonstrar a utilidade do método utilizando o citoarquitetura bem compreendida e os circuitos de cerebelo.

Imuno-histoquímica para Topografia Wholemount cerebrais, Complexo

Este vídeo demonstra uma estratégia fácil e confiável para a preparação de culturas puras de células endoteliais do cérebro anterior embrionário dentro de 10-12 dias e será útil para a pesquisa focada em muitos aspectos da angiogênese cerebral.

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Este artigo descreve um sistema de cultura neuronal que pode ser usado para obter grandes quantidades de amostras axonais puras para análises bioquímicas e imunocitoquímicas. Esta técnica permitirá uma melhor compreensão da fisiologia axonal normal e das vias de sinalização que levam à neurodegeneração.

Produção e Isolamento de axônios de neurônios sensoriais para análise bioquímica Usando filtros porosos

culturas neuronais são um bom modelo para o estudo de técnicas emergentes de estimulação do cérebro através de seus efeitos sobre os neurônios individuais ou uma população de neurônios. Aqui apresentados são diferentes métodos para a estimulação de culturas neuronais modeladas por um campo eléctrico produzido directamente por eléctrodos de banho ou induzida por um campo magnético variável no tempo.

Excitação externa de Neurônios Usando Campos Elétricos e Magnéticos em One e culturas bidimensionais

Aprenda a isolar e quantificar a neurotoxina botulínica em matrizes complexas usando imunoprecipitação com micropartículas magnéticas e ensaio fluorimétrico. Este método oferece sensibilidade comparável ao bioensaio em camundongos.

Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios

Explorar mais vídeos