Isolamento e Quantificação da neurotoxina botulínica a partir de matrizes complexas usando os BoTest Matrix Ensaios

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a atividade proteolítica da neurotoxina botulínica em matrizes complexas, como amostras farmacêuticas, ambientais e alimentares. Isso é realizado primeiramente processando as amostras de teste e da curva padrão, se necessário, para estabelecer condições adequadas de pH e viscosidade. Em seguida, a neurotoxina botulínica é imunoprecipitada das amostras utilizando esferas magnéticas revestidas com anticorpos.

Em seguida, as microesferas magnéticas são lavadas cuidadosamente para remover quaisquer compostos interferentes e ressuspendidas em um tampão de reação otimizado. Por fim, as microesferas lavadas são incubadas com um repórter proteico e a clivagem do repórter é medida espectroscopicamente ao longo do tempo. Em última análise, a comparação da clivagem do repórter nas amostras-teste com as amostras da curva padrão é utilizada para quantificar a atividade da toxina botulínica nas amostras-teste com sensibilidade próxima à do bioensaio em camundongo.

As principais vantagens desta técnica em comparação com outros métodos, como o bioensaio com camundongo, métodos imunológicos e outros métodos fluorescentes, são que este ensaio não requer o uso de animais e já foi demonstrado para utilização em matrizes altamente complexas presentes em amostras de alimentos, ambientais e farmacêuticas. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica podem ter dificuldades, pois é necessária uma cuidadosa preparação e diluição das amostras. Demonstrará este procedimento o Dr. Mark Dunning, cientista da Bio Sentinel.

Prepare os tampões de acordo com o protocolo descrito para gerar uma curva padrão para quantificação de amostras-teste; pese 10 mais ou menos 0,01 gramas de amostra alimentícia sólida em um tubo cônico de 50 mililitros e reserve esta amostra, que será utilizada como diluente. Em um segundo tubo, pese duas mais ou menos 0,01 gramas de amostra alimentícia sólida. Adicione neurotoxina botulínica ou comprada à superfície da amostra alimentícia de dois gramas, até uma concentração final de 30.000 MLD 50 por grama de alimento. Incube as amostras diluentes e contaminadas à temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius por duas horas, para permitir que a toxina interaja com a matriz alimentar.

Imitando uma contaminação natural, consulte o protocolo em texto para tipos adicionais de amostras. Em seguida, adicione um mililitro de GPB por grama de alimento às amostras adicionadas e não adicionadas com o agente, e use uma pistila para homogeneizar até que estejam completamente misturadas. Extrapolate o volume total da amostra de dois gramas adicionada com o agente a partir do volume total aproximado da amostra de diluente de dez gramas.

Em seguida, adicione um volume igual a um décimo do tampão de neutralização 10 x à amostra de diluente de 10 gramas e à amostra enriquecida de dois gramas com base em seus volumes totais. Misture bem as amostras por inversão, clarifique parcialmente ambas as amostras por centrifugação durante 10 minutos a 6.000 ×g e 4 °C. Em seguida, remova imediatamente os sobrenadantes e transfira para tubos novos, utilizando a amostra enriquecida como D1 e a amostra não enriquecida como diluente, e prepare as amostras restantes da curva padrão em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Para preparar amostras de alimentos sólidos, comece pesando dois mais ou menos 0,01 gramas de amostra sólida desconhecida em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione dois mililitros de GPB e use um pistilo para homogeneizar a amostra. Em seguida, adicione um décimo do volume de tampão de neutralização 10x à amostra e misture bem por inversão, após clarificar parcialmente a amostra por centrifugação durante 10 minutos a 6.000 ×g e 4 °C; imediatamente transfira pelo menos 750 microlitros do sobrenadante para um tubo de microcentrífugo.

Esta é a diluição desconhecida um. Adicione 675 microlitros do diluente a dois tubos rotulados como diluição desconhecida dois e três. O diluente será o mesmo material processado utilizado para a geração da curva padrão.

Use a diluição um para fazer uma diluição em série, transferindo 75 microlitros da diluição um para o tubo da diluição dois e misturando. Em seguida, transfira 75 microlitros da diluição dois para o tubo da diluição três e misture. Para clarificar as amostras, centrifugue-as por cinco minutos a pelo menos 14.000 ×g.

Remova imediatamente os sobrenadantes e transfira para novos tubos para montar uma placa para as amostras; adicione 20 microlitros de tampão de ligação 10 x a cada poço. Cada amostra desconhecida e as amostras da curva padrão D um a D oito requerem três poços, e a amostra D nove requer seis poços. Adicione 200 microlitros de cada amostra aos poços respectivos e use um agitador para microplacas para misturar a placa durante 10 segundos. Vortexe as microesferas de IPA por 10 segundos na velocidade máxima ou até completa ressuspensão.

Em seguida, pipete 20 microlitros das esferas em cada poço da amostra e misture a placa por 30 segundos. Incube a placa em um incubador rotativo por duas horas a 750 RPM e 25 graus Celsius ou temperatura ambiente para lavar a placa usando um lavador automático de placas. Após executar o programa de escorva, coloque a placa sobre a placa de separação magnética de esferas de 96 poços no lavador de placas.

Em seguida, execute o programa de lavagem principal. Quando o programa for concluído, remova a placa do lavador. Adicione 50 microlitros de tampão de reação a 1x em cada poço da amostra e misture por 30 segundos.

Para iniciar o ensaio em matriz de bot, adicione 50 microlitros de repórter AE 0,5 micromolar. Em cada poço de amostra para evitar efeitos de borda, adicione 100 microlitros de água a cada poço não utilizado. Use fita adesiva para vedar a placa, proteja-a da luz e incube-a a 750 RPM e 25 graus Celsius ou à temperatura ambiente.

Em cada tempo de leitura, retire a placa do incubador. Remova a fita superior e, imediatamente, coloque a placa sobre a placa de separação magnética de 96 poços; deixe as microesferas separarem por dois minutos. Coloque a placa no leitor de microplacas e meça as emissões em aproximadamente 470 e aproximadamente 526 nanômetros sob excitação em cerca de 434 nanômetros.

Se forem desejados tempos adicionais de leitura, após ressuspender as esferas por 30 segundos no agitador de microplaca, resele a placa e retorne-a ao incubador. Aqui são mostrados os resultados do ensaio utilizando bot holo adicionado em tampão fosfato salino (PBS) e testado após incubações de duas, quatro e 24 horas com o repórter AE. A clivagem do repórter por bot é medida como uma redução na razão de emissão medida pelo nosso leitor de placa, de aproximadamente 2,7 para o repórter intacto a cerca de 0,7 para o repórter completamente clivado.

Valores específicos serão diferentes entre leitores de placas, conforme observado pelo deslocamento da curva para a esquerda; um tempo prolongado de incubação com o marcador resulta em aumento da clivagem do marcador. Os pontos de dados testados em triplicata exibem baixo desvio padrão da média e seguem a tendência esperada de aumento na razão de emissão com a redução da carga de toxina. A falha do ensaio em seguir essa tendência esperada pode indicar um erro durante a geração das diluições ou no traçado dos dados; as razões de emissão dos controles que não contêm bot A também permanecem estáveis durante a incubação, indicando ausência de atividade proteásica não específica.

Esta figura demonstra a metodologia geral utilizada para detectar ou quantificar qualquer amostra desconhecida em relação a uma curva padrão e quantifica amostras farmacêuticas de bot. Uma curva padrão foi gerada em PBS com bot purificada, uma holotoxina, e processada em paralelo com diluições do produto farmacêutico obtidas a partir de um único frasco-ampola de 100 unidades de Botox liofilizado, reidratado em salina 0,9%. Neste ensaio, a porção linear da curva padrão situa-se entre uma razão de emissão de 2,11 e 1,05, sendo indicada pela caixa tracejada na figura. As concentrações das três amostras desconhecidas que se encontram dentro desse intervalo linear foram então interpoladas a partir da curva padrão.

Neste experimento, tomates frescos e leite a 2% foram utilizados como matrizes alimentares sólida e líquida e contaminados com bot A, um complexo composto pela holotoxina, toxina e proteínas associadas à neurotoxina. Essa combinação foi escolhida porque assemelha-se à toxina produzida durante uma contaminação natural por Clostridium, conforme mostrado aqui. A recuperação de bot A é observada em ambas as matrizes.

Além disso, o aumento do tempo de incubação com o marcador aumenta a sensibilidade do ensaio, mas não resulta em diminuição das razões de emissão para os controles sem toxina, indicando que a clivagem observada é decorrente da bot A e não de uma protease não específica proveniente dos alimentos no ensaio. Os valores de bot A-L-O-D-L-O-Q e EC 50 para ambos os alimentos em cada ponto de tempo mostrado são resumidos nesta tabela. O LOD e o LOQ são definidos como a amostra de menor concentração com uma razão de emissão inferior a três e 10 desvios padrão abaixo do valor de fundo, respectivamente.

É esperada alguma variabilidade entre matrizes no LOD e LOQ, pois efeitos de matriz podem influenciar a ligação da toxina às microesferas e a recuperação das microesferas durante a lavagem. Embora pareça haver maior recuperação de toxina no leite a 2% do que nos tomates, com base nos dados, grande parte dessa diferença resulta da diluição adicional necessária para homogeneizar as amostras de tomate em GPB. Além de ser uma matriz alimentícia sólida, os tomates representam um tipo de amostra notável em que o ajuste de pH e força iônica é essencial para o sucesso do ensaio.

Esta figura ilustra as respostas do ensaio ao testar tomates com ou sem a inclusão do tampão de neutralização 10x. A omissão da adição do tampão resulta em baixa recuperação da toxina bot A das amostras, demonstrada por uma razão de emissão constante em todas as concentrações testadas de bot A. A adição do tampão de neutralização 10x, no entanto, permite a detecção sensível da toxina. Proteases inespecíficas podem ser endógenas à amostra alimentar ou introduzidas ao utilizar preparações não purificadas de bot, como culturas de Clostridium e seus sobrenadantes, e podem clivar o marcador AE, levando a resultados falsos positivos. Este exemplo demonstra a atividade de protease inespecífica encontrada em sobrenadantes de cultura de Clostridium bot A, utilizando um marcador modificado que não é mais clivado pela bot A. Os altos níveis de clivagem do marcador indicam a presença da cultura.

O sobrenadante contém atividade proteolítica significativa, que é efetivamente anulada pela adição de inibidores de protease. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em um tempo total de ensaio entre quatro e 26 horas, dependendo do tipo de amostra e da carga de toxina. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e quantificar a neurotoxina botulínica de amostras complexas utilizando imunoprecipitação em um sistema de proteína repórter baseado em fluorescência.

Não se esqueça de que trabalhar com neurotoxinas botulínicas pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de luvas, códigos de laboratório e capelas de segurança química e biológica, devem ser adotadas ao realizar este procedimento.