Uma plataforma baseada em FRET compatível com alto rendimento para identificação e caracterização de moduladores de cadeia leve de neurotoxina botulínica

O objetivo geral deste procedimento é rastrear pequenas moléculas para neurotoxina botulínica, uma inibição da cadeia leve. Isso é feito preparando primeiro a série de diluição do composto com alta exatidão e precisão. O segundo passo é transferir diluições compostas para uma placa preta de 96 poços.

Em seguida, a enzima de cadeia leve diluída é adicionada à placa e a enzima é incubada com o composto por cinco minutos à temperatura ambiente. A etapa final é a adição do substrato de traste de cadeia leve para iniciar a reação, que é monitorada com um leitor de placa de fluorescência. Em última análise, telas secundárias que utilizam um substrato peptídico não fluorescente devem ser empregadas para confirmar a atividade do composto e determinar constantes cinéticas mais rigorosas, como a constante de dissociação do inibidor ou ki.

A principal vantagem deste ensaio sobre os métodos existentes, como métodos baseados em HPLC ou baseados em células, é que ele é simples de executar, facilmente automatizado e pode ser usado para comparar a potência relativa de vários compostos. Os indivíduos podem ter dificuldades quando novos neste método ao preparar uma série de diluição de compostos e misturar adequadamente a placa depois que todos os componentes forem adicionados. Inicie este procedimento preparando os tampões e reagentes conforme descrito no protocolo de texto.

Configure o leitor de placas para agitar a placa em velocidade média por 10 segundos e, em seguida, monitorar a fluorescência em um comprimento de onda de excitação de 490 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 523 nanômetros a cada cinco minutos no modo cinético por uma hora e 30 minutos à temperatura ambiente. Depois de determinar a faixa de concentração do composto, rotule os tubos com o nome e a concentração apropriados do composto, Eloqua, 100% de óxido de dimetilsulf ou DMSO em todos os tubos para prepará-los para a diluição do composto de cereais. Em seguida, preparar a diluição em série dos compostos para a série padrão de uma a três diluições.

Adicione dois microlitros do composto não diluído a quatro microlitros de DMSO no primeiro tubo da série de diluição e misture bem com uma nova ponta de pipeta. Remova dois microlitros da primeira diluição e adicione a quatro microlitros de DMSO na segunda mistura de tubos. Repetir bem para as restantes diluições.

Certifique-se de misturar bem as diluições do composto para garantir que as concentrações do composto sejam precisas. Cubra os tubos compostos e reserve-os À temperatura ambiente, obtenha uma placa preta opaca de 96 poços de fundo plano. Usando a configuração de placa recomendada que pode ser encontrada no protocolo de texto.

Dispense manualmente um microlitro da respectiva diluição do composto diretamente no fundo de cada poço correspondente para os poços de um a nove, dispense um microlitro da concentração mais alta do composto a ser testado no poço.11. Para servir como o controle de fluorescência intrínseca composto. Este controle é para determinar se os próprios compostos são fluorescentes e/ou afetam a hidrólise do substrato.

Dispense manualmente um microlitro de um inibidor potente conhecido para o poço, 12 como controle positivo e um microlitro de 100% de DMSO para o poço. 10 como controle negativo com uma dispensa de pipetador automatizada. 79 microlitros de tampão de ensaio para o lado dos poços, um a 10 e 12 e 89 microlitros para o lado do poço, 11.

Certifique-se de não tocar na ponta no fundo do poço onde o composto está presente para evitar a contaminação cruzada dos poços. Vortex, a enzima de cadeia leve diluída, e use um pipetador automatizado para adicionar 10 microlitros da enzima ao lado de cada poço, exceto o poço 11. Bata suavemente na placa para garantir que o volume total da enzima adicionada vá para o fundo do poço, misture, cubra e incube suavemente a placa por cinco minutos em temperatura ambiente.

Essa incubação fornece uma etapa de pré-equilíbrio para os compostos se ligarem à cadeia leve. Antes da adição do substrato, faça um vórtice suave da neurotoxina botulínica em um substrato de cadeia leve. Em seguida, usando uma pipeta automatizada, adicione 10 microlitros de substrato na lateral de cada um.

Bem, certifique-se de adicionar o substrato ao lado do poço oposto de onde a enzima foi adicionada anteriormente. Bata suavemente na placa para misturar os reagentes imediatamente. Coloque a placa em um leitor de placa de microtitulação de fluorescência e inicie o programa configurado anteriormente.

Após o término do programa, calcule as velocidades da enzima representando graficamente a unidade de fluorescência relativa em relação ao tempo e calculando a inclinação da linha durante o período linear da reação. Prepare-se para a operação automatizada para triagem de alto rendimento, conforme descrito no protocolo de texto, Demonstrando uma parte do protocolo de triagem de alto rendimento será um pós-doutorado em meu laboratório. Ele mostrará como os compostos são transferidos para placas para triagem de alto rendimento usando equipamentos de automação laboratorial Após dispensar neurotoxina botulínica diluída, uma enzima de cadeia leve na placa de ensaio.

Atribua áreas na plataforma do manipulador de líquidos para as placas compostas, placas de ensaio e recipientes com soluções de limpeza. Programe o manipulador de líquidos para colocar as placas compostas e as placas de ensaio nas posições designadas e remova as tampas das placas antes da estampagem. Calibre o software do programa de estampagem e certifique-se de que os pinos de estampagem estejam submersos, mas não riscando o fundo da placa de ensaio.

Carimbe 50 nanolitros do composto diretamente na placa de ensaio contendo oito microlitros de neurotoxina botulínica. Uma corrente leve. Limpe os pinos após cada placa, mergulhando-os em DMSO e depois secando em papel mata-borrão e repetindo esse processo com isopropanol e metanol.

Por fim, seque os pinos sobre o leque depois que os compostos forem estampados nas placas de ensaio com enzima. Separadamente, empilhe as placas compostas de estoque e as placas de ensaio cobrem a placa de ensaio superior na pilha para evitar a evaporação e reserve. Certifique-se de incubar a cadeia leve com compostos por pelo menos cinco minutos em temperatura ambiente.

Tempos de incubação mais longos podem ser usados ao estampar um grande número de placas. Por fim, dispense o substrato nas placas de ensaio e meça a fluorescência conforme descrito no protocolo de texto. Seja realizando o ensaio de cadeia leve de neurotoxina botulínica baseada em traste de baixo ou alto rendimento, um aumento na fluorescência deve ser observado ao longo do tempo quando a neurotoxina botulínica, uma cadeia leve é incubada com o substrato.

Se diluições em série de um composto forem testadas, uma série de linhas com inclinações variadas é freqüentemente obtida. Aqui. A concentração final de um composto à base de hidroxiácido é listada em unidades micromolares. Bem, 10 no layout da placa descrito aqui serve como um controle negativo onde apenas o veículo é adicionado.

A taxa desta reação é definida como 100% de atividade enzimática e as taxas na presença do composto podem ser normalizadas para esta taxa para obter a taxa relativa ou porcentagem de inibição. Quando o ensaio é realizado com diluições seriadas de um composto, um gráfico da taxa da reação versus a concentração do inibidor pode ser usado para determinar a metade da concentração inibitória máxima ou IC 50. A faixa de diluição deve ser escolhida de modo que o gráfico pareça sigmóide para um ajuste ideal da curva.

O valor IC 50 é uma medida relativa de potência melhor descrita como um valor aparente de KI, pois depende da concentração da enzima presente no ensaio. Esse valor pode ser usado para comparar e classificar a potência de vários compostos, se testado. Paralelamente, a mistura adequada da placa após a adição de cada componente é crucial para obter um aumento linear suave da fluorescência ao longo do tempo, o que é necessário para determinar com precisão as velocidades iniciais.

Este gráfico mostra um experimento representativo onde houve mistura insuficiente e a taxa de formação do produto não é linear ao longo do tempo. Análise de dados confusos Uma vez dominada esta técnica, pode ser feito em menos de duas horas para até oito compostos. Após este experimento, outros ensaios podem ser realizados com substratos peptídicos não fluorescentes para confirmar que os compostos inibem a neurotoxina botulínica, a cadeia leve e a atividade somática.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a potência relativa dos inibidores da cadeia leve da neurotoxina botulínica. O protocolo foi realizado em três etapas. Primeiro, a preparação de uma série de diluições compostas.

Em segundo lugar, a adição de enzima de cadeia leve recombinante e, em terceiro lugar, a adição de um substrato fluorescente e subsequente medição em um leitor de placa fluorescente.