Name: Uma plataforma baseada em FRET compatível com alto rendimento para identificação e caracterização de moduladores de cadeia leve de neurotoxina botulínica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a rastrear moléculas pequenas para inibição da cadeia leve da neurotoxina botulínica tipo A usando ensaios FRET em alta vazão. Este método permite identificar inibidores potenciais e acelerar a descoberta de fármacos.

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Este trabalho foi apoiado por uma doação do National Institutes of Health (AI082190 to T.J.D.) e do California Institute for Regenerative Medicine (TB1-01186 e CL1-00502).

Triagem Manual ou Determinação IC50
Este protocolo pode ser usado para determinar a potência relativa de um composto (valor IC50) preparando uma série de diluições do composto ou para rastrear manualmente inibidores de moléculas pequenas em uma única concentração.
1. Preparação de tampões, reagentes e instrumentação necessária
<ol>
	<li>Prepare 50 ml de tampão de ensaio (HEPES 40 mM, pH 7,4 e Tween-20 0,01%) e esterilize por filtro. O tampão pode ser armazenado em temperatura ambiente (RT) por vários meses.</li>
	<li>Prepare uma diluição de trabalho de 70 nM de neurotoxina botulínica recombinante/cadeia leve A (LC/A (1-425))17 em tampão de ensaio, suba suavemente em vórtice e guarde em gelo. O teste de cada composto requer pelo menos 120 μl de diluição de trabalho LC/A.</li>
	<li>Prepare a diluição de trabalho do substrato BoNT/A LC baseado em FRET de 7 μM em tampão de ensaio contendo 10% de DMSO. Dilua inicialmente uma solução estoque de 5 mM do substrato em um volume apropriado de 100% de DMSO e, em seguida, adicione lentamente (gota) o tampão de ensaio enquanto mistura suavemente. Embrulhe em papel alumínio e guarde no gelo. O teste de cada composto requer pelo menos 130 μl da diluição de trabalho do substrato.</li>
	<li>Configure um leitor de placa de microtitulação de fluorescência para agitar a placa em velocidade média por 10 segundos e, em seguida, monitore a fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 490 nm e 523 nm, respectivamente, a cada 5 min (modo cinético) por 90 min em RT. Observe que a formação do produto (ou seja, o aumento da fluorescência) é linear durante todo esse período de tempo (Figura 1A).</li>
</ol>
2. Preparação da série de diluições compostas
<ol>
	<li>Determinar o intervalo de concentração do composto (ou seja, o número de diluições na série de diluições e o factor de diluição); o intervalo de concentração é escolhido com base no valor IC50 esperado para garantir um ajuste óptimo da curva. Para compostos com IC50 desconhecido, use o composto não diluído como a concentração mais alta do composto.</li>
	<li>Rotule os tubos com o nome e a concentração apropriados do composto.</li>
	<li>Alíquota 100% DMSO para todos os tubos para prepará-los para diluição em série composta. Recomenda-se um volume de diluição final mínimo de 2 μl, sendo utilizado 1 μl de cada concentração por alvéolo na placa de ensaio. Por exemplo, uma série de diluição padrão de 1:3 requer a mistura de 2 μl de composto com 4 μl de DMSO por tubo.</li>
	<li>Preparar diluições em série de compostos e vórtices ou misturar manualmente entre cada diluição; mudar as pontas das pipetas entre cada diluição. Para a série padrão de diluição 1:3, adicionar 2 μl do composto não diluído a 4 μl de DMSO no primeiro tubo da série de diluições e homogeneizar bem. Com uma nova ponta de pipeta, remover 2 μl da primeira diluição e adicionar 4 μl de DMSO no segundo tubo; misture bem. Repita para as diluições restantes. Certifique-se de misturar bem as diluições do composto para garantir que as concentrações do composto sejam precisas.</li>
	<li>Cobrir os tubos compostos e reservar à temperatura dos vapores.</li>
</ol>
3. Preparação e Localização da Placa (Tabela 1)
<ol>
	<li>Obtenha uma placa preta opaca de fundo plano de 96 poços. Consulte a configuração recomendada da placa na Tabela 1, onde cada série de diluição composta é formatada em fileiras de uma placa de 96 poços. Dispensar manualmente 1 μl da respectiva diluição do composto directamente no fundo de cada alvéolo correspondente (alvéolos 1-9). Dispensar 1 μl da concentração mais elevada do composto a ensaiar no poço 11 (controlo de fluorescência intrínseca do composto).</li>
	<li>Dispense manualmente 1 μl de um inibidor potente conhecido para o poço 12 (controle positivo) e 1 μl de DMSO 100% para o poço 10 (controle negativo).</li>
	<li>Com um pipetador automatizado, dispense 79 μl de tampão de ensaio para o lado dos poços 1-10 e 12 (diluições compostas e controle positivo) e 89 μl para o lado do poço 11 (controle de fluorescência intrínseca composto). Certifique-se de não tocar a ponta no fundo do poço onde o composto está presente para não contaminar os poços. </li>
	<li>Vortex a diluição de trabalho LC/A e use um pipetador automatizado para adicionar 10 μl ao lado de cada poço, exceto para o poço 11 (controle de fluorescência intrínseco composto). Bata suavemente na placa para garantir que toda a enzima adicionada vá para o fundo do poço.</li>
	<li>Misture, cubra e incube suavemente a placa por 5 min em RT. Esta incubação fornece uma etapa de pré-equilíbrio para que os compostos se liguem ao LC/A antes da adição do substrato.</li>
</ol>
4. Adição de substrato e medição de fluorescência
<ol>
	<li>Agite suavemente o substrato BoNT / A LC e, usando um pipetador automatizado, adicione 10 μl de substrato ao outro lado de cada poço. Certifique-se de adicionar o substrato ao lado do poço oposto ao local onde a enzima foi adicionada anteriormente.</li>
	<li>Bata suavemente na placa para misturar os reagentes, coloque imediatamente no leitor de placas e inicie a medição de fluorescência com as configurações especificadas anteriormente na etapa 1.4.</li>
	<li>As velocidades da enzima são calculadas a partir da inclinação da linha gerada pela representação gráfica da unidade de fluorescência relativa (RFU) em relação ao tempo durante o período linear da reação.</li>
</ol>
Tabela 1.Layout de placa de ensaio sugerido.
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Bem #</th>
			<th>Descrição do poço</th>
			<th>composto</th>
			<th>Tampão de ensaio</th>
			<th>substrato</th>
			<th>Lc</th>
			<th>Dmso</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Dose composta 1</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl </td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>algarismo</td>
			<td>Dose composta 2</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Dose composta 3</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Dose composta 4</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Dose composta 5</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Dose composta 6</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Dose composta 7</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>Dose composta 8</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Dose composta 9</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>Controle negativo 
			(100% de atividade LC)</td>
			<td>---</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Controle de fluorescência intrínseca composta</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>89 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
			<td>---</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>Controle positivo 
			(0% de atividade LC)</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>79 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>---</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Operação automatizada para triagem de alto rendimento
5. Preparação de tampões, reagentes, placas compostas, códigos de barras e instrumentação necessária
<ol>
	<li>Descongele as placas compostas seladas em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora.</li>
	<li>Prepare 500 ml (ou mais, dependendo do número de compostos a serem filtrados) do tampão de ensaio (HEPES 40 mM, pH 7,4 e 0,01% Tween-20) e esterilize por filtro. O tampão de ensaio filtrado pode ser armazenado em RT por vários meses.</li>
	<li>Prepare uma diluição de trabalho de 8,75 nM de BoNT/A LC recombinante (1-425) em tampão de ensaio, vórtice e armazene em gelo. Cada poço em uma placa de 384 poços de baixo volume requer 8 μl. Prepare um excesso de 10-15%, ou aproximadamente 3,7 ml ou cada placa de 384 poços de baixo volume.</li>
	<li>Preparar uma diluição de trabalho de substrato BoNT/A LC de 3,5 μM baseada em FRET em tampão de ensaio contendo 10% de DMSO. Dilua inicialmente a solução estoque de 5 mM do substrato diretamente no volume apropriado de 100% DMSO e, em seguida, adicione lentamente (gota) o tampão de ensaio enquanto mistura suavemente. Embrulhe em papel alumínio e guarde no gelo. Cada poço em uma placa de baixo volume de 384 poços requer 2 μl. Prepare um excesso de 10-15%, ou aproximadamente 1 ml para cada placa de 384 poços de baixo volume.</li>
	<li>Prepare códigos de barras para cada placa de microtitulação preta, de 384 poços e baixo volume [placa de ensaio] e cole a etiqueta diretamente no lado da placa onde o leitor de código de barras pode lê-la; certifique-se de que a etiqueta não se estenda sobre o lado da placa ou pode interferir no manuseio e empilhamento da placa. Empilhe os pratos em ordem numérica e reserve. Cubra a placa superior. Observe que esta etapa é opcional, mas facilita o rastreamento de resultados para compostos correspondentes quando várias placas são usadas.</li>
	<li>Centrifugue as placas compostas de estoque descongeladas e seladas a 200 x g por 30 segundos em RT. Remova cuidadosamente a vedação da placa, certifique-se de remover qualquer adesivo restante e cubra a placa com uma tampa de plástico limpa para evitar a evaporação. Observe que, se houver algum adesivo na superfície da placa, ele poderá interferir na transferência automatizada da tampa e no empilhamento da placa. Coloque a placa coberta em um hotel conectado ao manipulador de líquidos. Não mantenha as placas descobertas ou ocorrerá evaporação.</li>
	<li>Configure um leitor de placa de microtitulação de fluorescência empilhada para ler a fluorescência de cada placa de ensaio em comprimentos de onda de excitação e emissão de 490 nm e 523 nm, respectivamente, a cada 30 min (modo cinético) por 3-6 ciclos em RT.</li>
</ol>
6. Preparação da ferramenta de pino
<ol>
	<li>Inspecione visualmente a ferramenta de pino de 384 cabeças em busca de anormalidades, incluindo empenamento, lascas ou detritos grandes.</li>
	<li>Encha três bandejas separadas com aproximadamente 1 pol de metanol 100% (grau HPLC), isopropanol 100% (grau HPLC) e solução de limpeza de ferramenta de pino diluída em água ultrapura.</li>
	<li>Encha a estação de limpeza em um manipulador de líquidos com 100% de DMSO.</li>
	<li>Empilhe 2-3 pedaços de papel mata-borrão novo e limpo em uma bandeja. É importante calibrar o robô no eixo z para que os pinos entrem em contato, mas não perfurem, o papel mata-borrão.</li>
	<li>Prenda um ventilador na área de trabalho para secar os pinos após a lavagem.</li>
	<li>Conecte a ferramenta de pinos ao braço robótico do manipulador de líquidos e pré-limpe os pinos mergulhando em DMSO, secando em papel mata-borrão, mergulhando por 2 min em solução de limpeza, secando em papel mata-borrão, mergulhando em isopropanol, secando em papel mata-borrão, mergulhando em metanol, secando em papel mata-borrão e, finalmente, secando sobre o ventilador.</li>
</ol>
7. Preparação do Dispensador de Líquido de Baixo Volume
<ol>
	<li>Conecte um de baixo volume (1-10 μl) ao dispensador de líquido e conecte uma linha de resíduos a um recipiente apropriado.</li>
	<li>Inspecione visualmente os bicos dispensadores do e verifique se eles não estão deformados, rasgados ou bloqueados. É importante manter os canais e bicos limpos, pois a precipitação ou os detritos influenciarão a distribuição do líquido.</li>
	<li>Prepare os canais executando 30 ml de água ultrapura, 30 ml de etanol a 70% e, em seguida, 30 ml de água ultrapura novamente diretamente no recipiente de resíduos.</li>
	<li>Posicione uma placa de ensaio de 384 poços de baixo volume no dispensador de líquido e adicione um volume conhecido de água a cada poço. Inspecione visualmente para garantir que cada poço esteja recebendo o volume correto e que não haja derramamento ou solução dispensada entre os poços.</li>
	<li>Prepare os tubos com ar por aproximadamente 5 segundos para remover a água e secar os canais.</li>
</ol>
8. Dispensando a cadeia leve BoNT/A na placa de ensaio
<ol>
	<li>Mergulhe a linha de entrada do dispensador de líquido na solução de trabalho BoNT/A LC, prepare para remover qualquer ar e dispense 8 μl em cada poço de uma placa de ensaio de 384 poços de baixo volume. Observe que as placas podem ser posicionadas manualmente na área de trabalho do manipulador de líquidos ou posicionadas e reempilhadas automaticamente usando um hotel de placas anexado.</li>
	<li>Cubra cada placa com uma tampa de plástico limpa e empilhe em uma coluna diferente do hotel de placas presa ao manipulador de líquidos. Não mantenha as placas abertas ou ocorrerá evaporação.</li>
	<li>Limpe o dispensador de líquido colocando 30 ml de água ultrapura, 30 ml de etanol a 70%, 30 ml de água ultrapura novamente diretamente no recipiente de resíduos.</li>
	<li>Prepare os tubos com ar por aproximadamente 5 segundos para secar os canais.</li>
</ol>
9. Estampagem de compostos em placa de ensaio
<ol>
	<li>Atribua áreas na plataforma do manipulador de líquidos para as placas compostas, placas de ensaio e recipientes com soluções de limpeza.</li>
	<li>Programe o manipulador de líquidos para colocar as placas compostas e as placas de ensaio nas posições designadas e remova as tampas das placas antes da estampagem.</li>
	<li>Carimbar 50 nl do composto diretamente na placa de ensaio contendo 8 μl de BoNT/A LC. Ao calibrar o programa de estampagem, certifique-se de que os pinos estejam submersos, mas não risque o fundo da placa de ensaio. Observe que a adição de compostos em 100% de DMSO pode criar uma zona local de desnaturação enzimática à medida que se dispersa. Portanto, deve-se ter cuidado para avaliar o nível de desnaturação enzimática comparando o controle apenas com DMSO com o controle não tratado (ou seja, enzima sem adição de DMSO).</li>
	<li>Limpe os pinos após cada placa mergulhando em DMSO, secando em papel mata-borrão, mergulhando em isopropanol, secando em papel mata-borrão, mergulhando em metanol, secando em papel mata-borrão e, finalmente, secando sobre o ventilador.</li>
	<li>Depois que os compostos tiverem sido stamped na placa de ensaio com enzima, empilhe separadamente as placas compostas de estoque e as placas de ensaio. Cubra a placa de ensaio superior na pilha para evitar a evaporação e reserve. Certifique-se de incubar LC com compostos por pelo menos 5 min em RT; Tempos de incubação mais longos podem ser usados ao estampar um grande número de placas.</li>
</ol>
10. Dispensando substrato na placa de ensaio
<ol>
	<li>Mergulhe a linha de entrada do manipulador de líquidos na solução de trabalho do substrato BoNT/A LC e proteja da luz. Verifique os bicos dispensadores para garantir que estejam secos e não bloqueados. Prepare os canais para remover todas as bolhas de ar.</li>
	<li>Desempilhe as placas de ensaio e dispense 2 μl de diluição de trabalho do substrato em cada poço. Verifique se o substrato está sendo dispensado diretamente em cada poço. Empilhe as placas e coloque uma placa de ensaio vazia em cima da primeira placa e uma placa vazia sob a placa inferior na pilha para evitar a evaporação durante a leitura e reempilhamento no leitor de placas.</li>
</ol>
11. Medições de fluorescência
<ol>
	<li>Coloque imediatamente a pilha de placas de ensaio em um leitor de placas de fluorescência.</li>
	<li>Inicie a medição de fluorescência com as configurações especificadas anteriormente na etapa 5.7. A taxa de ensaio para cada composto é calculada a partir de um gráfico da unidade de fluorescência relativa (RFU) ao longo do tempo. Observe que é importante incluir um controle negativo (DMSO) para obter uma taxa desinibida; Um controle positivo com um inibidor conhecido também pode ser adicionado a cada placa. Uma saída representativa de um único ponto de tempo é mostrada na Figura 2.</li>
</ol>
12. Limpeza
<ol>
	<li>Sele cada placa de estoque composto com um selo de alumínio usando um rolo e armazene a -80 °C.</li>
	<li>Após a leitura de cada placa de ensaio, descarte as placas, quaisquer LC/A restantes ou diluições de substrato nos resíduos de risco biológico.</li>
</ol>

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<li>Eubanks, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+and+in+vivo+disconnect+uncovered+through+high-throughput+identification+of+botulinum+neurotoxin+A+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2602-2607 (2007).</li>
<li>Baldwin, M. R., Bradshaw, M., Johnson, E. A., Barbieri, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+botulinum+neurotoxin+type+A+light+chain+contributes+to+solubility%2C+catalysis%2C+and+stability.%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of botulinum neurotoxin type A light chain contributes to solubility, catalysis, and stability.</a> Protein Expr. Purif. 37, 187-195 (2004).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+discovery+of+potent+inhibitors+of+botulinum+neurotoxin+A%3A+development+of+a+robust+LC+MS+based+assay+operational+from+low+to+subnanomolar+enzyme+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations.</a> Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).</li>
<li>Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+fluorescent+proteins+as+enhanced+FRET-based+substrates+for+botulinum+neurotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity.</a> Toxicon. 53, 392-399 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O ensaio BoNT/A LC baseado em FRET descrito aqui representa um método atraente para identificar e caracterizar pequenas moléculas que modulam a atividade de BoNT/A LC. A natureza baseada em solução do ensaio torna este protocolo passível de triagem de alto rendimento descrita na seção Operação Automatizada do Texto do Protocolo. O fator Z é frequentemente usado para determinar a adequação de um ensaio para campanhas HTS18. Determinado como Z = 1 – 3 (σp + σn)/(μp - μn</sub...

A neurotoxina botulínica A (BoNT/A), a toxina mais potente atualmente conhecida (LD50 ~ 1 ng/kg)1, é uma neurotoxina potente produzida pela bactéria Clostridium botulinum. Dentro de um hospedeiro afetado, a BoNT / A interrompe a neurotransmissão na junção neuromuscular ligando-se aos neurônios motores, internalizando-se no citosol e, finalmente, clivando proteínas neuronais que são essenciais para a exocitose da acetilcolina. Uma vez dentro de um neurônio, o BoNT / A pode persistir por vários meses2. A inibição a longo prazo da liberação de acetilcolina dificulta a contração muscular normal e resulta em paralisia flácida, que, em casos graves, pode resultar em insuficiência cardíaca e/ou respiratória. Devido à sua extrema potência, facilidade de produção e efeitos de longo prazo no hospedeiro, o CDC rotulou todos os sorotipos BoNT como agentes de bioterrorismo de alto risco.
O mecanismo de ação da toxina envolve várias etapas, incluindo a ligação aos receptores de superfície neuronal, captação celular via endocitose mediada por receptor e translocação para o citosol do neurônio. BoNT / A é composto por duas cadeias, uma cadeia pesada e uma leve, e ambas as cadeias são necessárias para toxicidade. A cadeia pesada (HC) contém domínios de ligação e translocação, enquanto a cadeia leve (LC) é uma metaloprotease dependente de zinco que se transloca do endossomo para o citoplasma. Uma vez dentro do citosol, a metaloprotease LC/A localiza-se na membrana citoplasmática interna e cliva a proteína hospedeira ligada à membrana SNAP-25. O SNAP-25 é um membro da família de proteínas SNARE (Soluble N-Ethylmaleimida-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor), que desempenha um papel crucial na exocitose da acetilcolina (revisado na referência3). A clivagem LC/A do SNAP-25 prejudica a função do complexo SNARE, que inibe a liberação do neurotransmissor acetilcolina e prejudica a contração muscular.
Atualmente, o tratamento para o botulismo é limitado e geralmente inclui a administração de um anticorpo neutralizante equino4; no entanto, como a toxina é rapidamente internalizada nos neurônios, o anticorpo tem uma janela de tempo estreita de administração. Assim, muitos pesquisadores acreditam que o BoNT/A LC pode ser um alvo terapêutico melhor. Como o LC é uma metaloproto dependente de zinco, uma abordagem para inibir a atividade de LC / A tem sido desenvolver compostos que quelam o íon zinco do sítio ativo. Por exemplo, os compostos de hidroxamato quelam o zinco do sítio ativo e têm excelente potência in vitro (Ki do melhor inibidor de moléculas pequenas BoNT / A LC até o momento é de 77 nM) 5. No entanto, muitas moléculas pequenas não avançam como terapêuticas devido a vários problemas ex vivo ou in vivo, incluindo baixa solubilidade aquosa, metabolismo rápido e/ou alta citotoxicidade. Portanto, novos compostos com propriedades farmacológicas e farmacocinéticas aprimoradas são necessários. A identificação de compostos de moléculas pequenas geralmente envolve triagem de alto rendimento (HTS) para identificar novos andaimes. Os métodos iniciais para triagem da atividade de BoNT / A LC foram baseados na detecção por HPLC de clivagem de substrato de peptídeo curto, que é demorada e não passível de aplicações HTS6-8. Posteriormente, Schmidt e colegas9 desenvolveram um ensaio de atividade de BoNT / A LC de alto rendimento que utiliza um substrato peptídico marcado com fluoresceína covalentemente ligado a uma placa de microtitulação. O BoNT/A LC cliva o substrato e libera fluoresceína, que pode ser quantificada com um fluorômetro. O formato de placa deste ensaio permite que vários compostos sejam peneirados simultaneamente; no entanto, o ensaio requer a marcação de peptídeos sintéticos com fluoresceína e o revestimento das placas de ensaio com moléculas de substrato derivatizadas, que são técnicas complicadas. Um método muito mais simples para detectar a atividade de BoNT / A LC em baixas concentrações foi posteriormente descrito por Schmidt et al., onde uma série de substratos fluorogênicos foram utilizados para monitorar a atividade de BoNT LC em tempo real10. Técnicas adicionais descritas na literatura incluem um ensaio baseado em transferência de energia de ressonância após ressonância para detectar e quantificar a atividade de BoNT em extratos brutos; este método pode ser usado para aplicações de alto rendimento10,11, embora exija equipamentos sofisticados para medir a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) e sinais de polarização. Finalmente, vários modelos baseados em células para intoxicação por BoNT foram relatados (revisados na referência11) que permitirão aos pesquisadores estudar as propriedades muitas vezes limitantes dos compostos mencionados anteriormente, incluindo citotoxicidade, permeabilidade celular e estabilidade. No entanto, a maioria dos ensaios baseados em células existentes não são passíveis de HTS e exigem muito trabalho e tempo.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para um método HTS que utiliza o substrato BoNT/A LC baseado em FRET disponível comercialmente. O substrato é baseado na sequência de clivagem SNAP-25 e é um peptídeo sintético de 13 meros que contém um fluoróforo terminal e um atenuador. A clivagem BoNT / A separa o fluoróforo e o atenuador, abolindo o FRET e aumentando a fluorescência medida, que pode ser medida continuamente em um leitor de placas de fluorômetro. O ensaio é usado rotineiramente em nosso e em outros laboratórios para identificar novas classes de inibidores de BoNT/A LC ou para determinar a potência relativa de compostos previamente identificados5,12-15. Este ensaio é adequado para HTS devido à sua simplicidade, potencial de automação, baixo custo de materiais e capacidade de peneirar vários compostos simultaneamente (ver referência16; Caglič et al., apresentado; Bompiani et al., em preparação). Além do HTS, este ensaio pode ser usado para comparar a potência relativa dos compostos, determinando o valor IC50 (concentração necessária para inibir 50% da atividade de BoNT/A LC) de um composto. O ensaio pode ser realizado manualmente em um formato de 96 poços (seção de triagem manual do texto do protocolo) ou pode ser automatizado em um formato de 384 poços para HTS (seção de operação automatizada do texto do protocolo).

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Teknova</td><td>H1021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (grau HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (grau HPLC)</td><td>Placa de ensaio preta Sigma-Aldrich</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>96 poços</td><td>Costar</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>384 poços Placa de ensaio preta de baixo volume</td><td>Greiner</td><td>788076</td><td></td></tr><tr><td>SNAPtide FITC/Dabcyl lista de substratos</td><td>Laboratórios Biológicos</td><td>521</td><td>substrato BoNT/A LC baseado em FRET</td></tr><tr><td>Solução de limpeza de pinos</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 110</td><td></td></tr><tr><td>Papel mata-borrão sem fiapos</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 540DB</td><td></td></tr><tr><td>Biomek Selo e Amostra Tampas de folha de alumínio</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td></td></tr></tbody></table>

uma plataforma baseada em fret compatível com alto rendimento para identificação e caracterização de moduladores de cadeia leve de neurotoxina botulínica

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

A neurotoxina botulínica (BoNT) é uma toxina bacteriana potente e potencialmente letal que se liga aos neurônios motores do hospedeiro, é internalizada na célula e cliva proteínas intracelulares que são essenciais para a liberação de neurotransmissores. A BoNT é composta por uma cadeia pesada (HC), que medeia a ligação e internalização da célula hospedeira, e uma cadeia leve (LC), que cliva proteínas hospedeiras intracelulares essenciais para a liberação de acetilcolina. Enquanto as terapias que inibem a ligação/internalização da toxina têm uma pequena janela de tempo de administração, os compostos que visam a atividade intracelular da LC têm uma janela de tempo muito maior de administração, particularmente relevante dada a meia-vida extremamente longa da toxina. Nos últimos anos, pequenas moléculas têm sido fortemente analisadas como potenciais inibidores de LC com base em sua permeabilidade celular aumentada em relação a terapêuticas maiores (peptídeos, aptâmeros, etc.). A identificação de eletrodos geralmente envolve triagem de alto rendimento (HTS), onde grandes bibliotecas de pequenas moléculas são rastreadas com base em sua capacidade de modular a função do alvo terapêutico. Aqui descrevemos um ensaio baseado em FRET com um substrato comercial de BoNT / A LC e LC recombinante que pode ser automatizado para HTS de potenciais inibidores de BoNT. Além disso, descrevemos uma técnica manual que pode ser usada para triagem secundária de acompanhamento ou para comparar a potência de vários compostos candidatos.

O ensaio baseado em FRET para a LC da BoNT/A pode ser realizado manualmente de forma de baixo rendimento para caracterizar inibidores conhecidos ou triar bibliotecas pequenas; alternativamente, o protocolo pode ser reduzido e automatizado para triagem de alto rendimento (HTS) com bibliotecas grandes, com o objetivo de identificar novos inibidores da LC da BoNT/A. Independentemente da abordagem utilizada, deve-se observar um aumento na fluorescência ao longo do tempo quando a LC da BoNT/A é incubada com o substrato (<stro...

A cadeia leve da neurotoxina botulínica tipo A (BoNT/A LC) é uma metaloprotease que entra nos neurônios motores, cliva seu substrato SNAP-25 e interrompe a neurotransmissão, resultando em paralisia flácida. Utilizando um ensaio baseado em FRET compatível com alto rendimento, grandes bibliotecas de pequenas moléculas podem ser rastreadas quanto ao seu impacto na atividade enzimática de BoNT/A LC.

Uma plataforma baseada em FRET compatível com alto rendimento para identificação e caracterização de moduladores de cadeia leve de neurotoxina botulínica

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

O objetivo geral deste procedimento é rastrear pequenas moléculas para neurotoxina botulínica, uma inibição da cadeia leve. Isso é feito preparando primeiro a série de diluição do composto com alta exatidão e precisão. O segundo passo é transferir diluições compostas para uma placa preta de 96 poços.Em seguida, a enzima de cadeia leve diluída é adicionada à placa e a enzima é incubada com o composto por cinco minutos à temperatura ambiente. A etapa final é a adição do substrato de traste de cadeia leve para iniciar a reação, que é monitorada com um leitor de placa de fluorescência. Em última análise, telas secundárias que utilizam um substrato peptídico não fluorescente devem ser empregadas para confirmar a atividade do composto e determinar constantes cinéticas mais rigorosas, como a constante de dissociação do inibidor ou ki.A principal vantagem deste ensaio sobre os métodos existentes, como métodos baseados em HPLC ou baseados em células, é que ele é simples de executar, facilmente automatizado e pode ser usado para comparar a potência relativa de vários compostos. Os indivíduos podem ter dificuldades quando novos neste método ao preparar uma série de diluição de compostos e misturar adequadamente a placa depois que todos os componentes forem adicionados. Inicie este procedimento preparando os tampões e reagentes conforme descrito no protocolo de texto.Configure o leitor de placas para agitar a placa em velocidade média por 10 segundos e, em seguida, monitorar a fluorescência em um comprimento de onda de excitação de 490 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 523 nanômetros a cada cinco minutos no modo cinético por uma hora e 30 minutos à temperatura ambiente. Depois de determinar a faixa de concentração do composto, rotule os tubos com o nome e a concentração apropriados do composto, Eloqua, 100% de óxido de dimetilsulf ou DMSO em todos os tubos para prepará-los para a diluição do composto de cereais. Em seguida, preparar a diluição em série dos compostos para a série padrão de uma a três diluições.Adicione dois microlitros do composto não diluído a quatro microlitros de DMSO no primeiro tubo da série de diluição e misture bem com uma nova ponta de pipeta. Remova dois microlitros da primeira diluição e adicione a quatro microlitros de DMSO na segunda mistura de tubos. Repetir bem para as restantes diluições.Certifique-se de misturar bem as diluições do composto para garantir que as concentrações do composto sejam precisas. Cubra os tubos compostos e reserve-os À temperatura ambiente, obtenha uma placa preta opaca de 96 poços de fundo plano. Usando a configuração de placa recomendada que pode ser encontrada no protocolo de texto.Dispense manualmente um microlitro da respectiva diluição do composto diretamente no fundo de cada poço correspondente para os poços de um a nove, dispense um microlitro da concentração mais alta do composto a ser testado no poço.11. Para servir como o controle de fluorescência intrínseca composto. Este controle é para determinar se os próprios compostos são fluorescentes e/ou afetam a hidrólise do substrato.Dispense manualmente um microlitro de um inibidor potente conhecido para o poço, 12 como controle positivo e um microlitro de 100% de DMSO para o poço. 10 como controle negativo com uma dispensa de pipetador automatizada. 79 microlitros de tampão de ensaio para o lado dos poços, um a 10 e 12 e 89 microlitros para o lado do poço, 11. Certifique-se de não tocar na ponta no fundo do poço onde o composto está presente para evitar a contaminação cruzada dos poços. Vortex, a enzima de cadeia leve diluída, e use um pipetador automatizado para adicionar 10 microlitros da enzima ao lado de cada poço, exceto o poço 11. Bata suavemente na placa para garantir que o volume total da enzima adicionada vá para o fundo do poço, misture, cubra e incube suavemente a placa por cinco minutos em temperatura ambiente.Essa incubação fornece uma etapa de pré-equilíbrio para os compostos se ligarem à cadeia leve. Antes da adição do substrato, faça um vórtice suave da neurotoxina botulínica em um substrato de cadeia leve. Em seguida, usando uma pipeta automatizada, adicione 10 microlitros de substrato na lateral de cada um.Bem, certifique-se de adicionar o substrato ao lado do poço oposto de onde a enzima foi adicionada anteriormente. Bata suavemente na placa para misturar os reagentes imediatamente. Coloque a placa em um leitor de placa de microtitulação de fluorescência e inicie o programa configurado anteriormente.Após o término do programa, calcule as velocidades da enzima representando graficamente a unidade de fluorescência relativa em relação ao tempo e calculando a inclinação da linha durante o período linear da reação. Prepare-se para a operação automatizada para triagem de alto rendimento, conforme descrito no protocolo de texto, Demonstrando uma parte do protocolo de triagem de alto rendimento será um pós-doutorado em meu laboratório. Ele mostrará como os compostos são transferidos para placas para triagem de alto rendimento usando equipamentos de automação laboratorial Após dispensar neurotoxina botulínica diluída, uma enzima de cadeia leve na placa de ensaio.Atribua áreas na plataforma do manipulador de líquidos para as placas compostas, placas de ensaio e recipientes com soluções de limpeza. Programe o manipulador de líquidos para colocar as placas compostas e as placas de ensaio nas posições designadas e remova as tampas das placas antes da estampagem. Calibre o software do programa de estampagem e certifique-se de que os pinos de estampagem estejam submersos, mas não riscando o fundo da placa de ensaio.Carimbe 50 nanolitros do composto diretamente na placa de ensaio contendo oito microlitros de neurotoxina botulínica. Uma corrente leve. Limpe os pinos após cada placa, mergulhando-os em DMSO e depois secando em papel mata-borrão e repetindo esse processo com isopropanol e metanol.Por fim, seque os pinos sobre o leque depois que os compostos forem estampados nas placas de ensaio com enzima. Separadamente, empilhe as placas compostas de estoque e as placas de ensaio cobrem a placa de ensaio superior na pilha para evitar a evaporação e reserve. Certifique-se de incubar a cadeia leve com compostos por pelo menos cinco minutos em temperatura ambiente.Tempos de incubação mais longos podem ser usados ao estampar um grande número de placas. Por fim, dispense o substrato nas placas de ensaio e meça a fluorescência conforme descrito no protocolo de texto. Seja realizando o ensaio de cadeia leve de neurotoxina botulínica baseada em traste de baixo ou alto rendimento, um aumento na fluorescência deve ser observado ao longo do tempo quando a neurotoxina botulínica, uma cadeia leve é incubada com o substrato.Se diluições em série de um composto forem testadas, uma série de linhas com inclinações variadas é freqüentemente obtida. Aqui. A concentração final de um composto à base de hidroxiácido é listada em unidades micromolares. Bem, 10 no layout da placa descrito aqui serve como um controle negativo onde apenas o veículo é adicionado.A taxa desta reação é definida como 100% de atividade enzimática e as taxas na presença do composto podem ser normalizadas para esta taxa para obter a taxa relativa ou porcentagem de inibição. Quando o ensaio é realizado com diluições seriadas de um composto, um gráfico da taxa da reação versus a concentração do inibidor pode ser usado para determinar a metade da concentração inibitória máxima ou IC 50. A faixa de diluição deve ser escolhida de modo que o gráfico pareça sigmóide para um ajuste ideal da curva.O valor IC 50 é uma medida relativa de potência melhor descrita como um valor aparente de KI, pois depende da concentração da enzima presente no ensaio. Esse valor pode ser usado para comparar e classificar a potência de vários compostos, se testado. Paralelamente, a mistura adequada da placa após a adição de cada componente é crucial para obter um aumento linear suave da fluorescência ao longo do tempo, o que é necessário para determinar com precisão as velocidades iniciais.Este gráfico mostra um experimento representativo onde houve mistura insuficiente e a taxa de formação do produto não é linear ao longo do tempo. Análise de dados confusos Uma vez dominada esta técnica, pode ser feito em menos de duas horas para até oito compostos. Após este experimento, outros ensaios podem ser realizados com substratos peptídicos não fluorescentes para confirmar que os compostos inibem a neurotoxina botulínica, a cadeia leve e a atividade somática.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a potência relativa dos inibidores da cadeia leve da neurotoxina botulínica. O protocolo foi realizado em três etapas. Primeiro, a preparação de uma série de diluições compostas.Em segundo lugar, a adição de enzima de cadeia leve recombinante e, em terceiro lugar, a adição de um substrato fluorescente e subsequente medição em um leitor de placa fluorescente.

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Research

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Chemistry

Química

Uma plataforma baseada em FRET compatível com alto rendimento para identificação e caracterização de moduladores de cadeia leve da neurotoxina botulínica

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