Início do Carcinoma de mama metastático por Segmentação do ductal Epithelium com Adenovírus-Cre: Um Modelo Novel de camundongo transgênico do Câncer de Mama

Ativação de mutações latentes com adenovírus-Cre no sistema ductal resultados mamárias em um câncer de mama metastático clinicamente relevante. Incorporação de um promotor YFP permite o rastreamento de células tumorais metastáticas distais. Este modelo é útil para estudar metástase latente, a imunidade anti-tumor, e para a concepção de novas imunoterapias para tratar o câncer de mama.

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um modelo de câncer de mama em camundongos que eventualmente metastatiza na presença de um sistema imunológico saudável. Isso é conseguido primeiro administrando um adenovírus que expressa Cree no canal ductal mamário dos animais experimentais. A glândula mamária é então palpada regularmente para monitorar a progressão do tumor.

Em última análise, a metástase tumoral e a infiltração de leucócitos no linfonodo axilar podem ser avaliadas por análise por citometria de fluxo. A principal vantagem dessa técnica sobre os modelos de tumor de mama existentes é que ela permite a iniciação precisa de tumores que podem se desenvolver na presença de um sistema imunológico maduro e que podem ser rastreados pela expressão de YFP. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas introdutórias da injeção são difíceis de aprender.

A colocação correta da agulha requer precisão e prática. No dia do experimento, armazene Eloqua de quatro vezes 10 das oitavas unidades formadoras de placa de adenovírus Cree em gelo seco, descongele a temperatura ambiente definida pelo vírus e misture-a com 3% de sacarose suficiente em água estéril para elevar o volume final a 10 microlitros. Em seguida, misture delicadamente 34 microlitros de mem e quatro microlitros de cloreto de cálcio recém-preparado no vírus e incube a solução em temperatura ambiente.

Após 15 a 20 minutos, a mídia aparecerá turva, indicando a formação dos precipitados de adenovírus. Mova suavemente o tubo para certificar-se de que as partículas do vírus estejam distribuídas uniformemente por toda a suspensão e, em seguida, para injetar as partículas do vírus, retire três microlitros do vírus em uma seringa de 10 microlitros. Em seguida, coloque um camundongo anestesiado de costas no estágio iluminado de um microscópio de dissecção limpo.

Ilumine o abdômen com uma fonte de luz extra e localize a quarta esquerda ou a nona glândula mamária inguinal direita pelas pequenas manchas brancas de pelo ao redor de cada mamilo. Agora esfregue o mamilo suavemente com um aplicador de algodão embebido em etanol estéril. Em seguida, prenda o mamilo com uma pinça cirúrgica fina e puxe para cima com uma leve força.

Para remover o tampão de queratina, estabilize o mamilo entre a pinça e insira suavemente a agulha entre as pontas. Canulando o canal do duto em um ângulo de 90 graus para garantir a profundidade adequada da injeção, puxe suavemente a agulha para cima depois de inseri-la no lúmen do duto, puxando o mamilo para cima ao longo das bordas da agulha à medida que é puxado para cima. Quando a agulha for colocada adequadamente, mergulhe suavemente todo o conteúdo da seringa.

O mamilo deve inflar ligeiramente à medida que o líquido é adicionado. Após a injeção, coloque o mouse de volta na almofada de aquecimento até que ele comece a se recuperar da anestesia. Em seguida, coloque o animal de volta em uma gaiola limpa e monitore-o até que a recuperação total seja observada.

Palpe a glândula de memória injetada no dia 30 para avaliação do aumento e inchaço da glândula. Monitore a progressão do tumor a cada cinco a sete dias. Uma vez observada uma glândula mamária inchada e aumentada, meça os volumes do tumor a cada três a quatro dias para a cinética de crescimento do tumor.

Uma vez que os tumores palpáveis apareçam, o direcionamento bem-sucedido da árvore ductal mamária pode ser visualizado preparando montagens inteiras da glândula mamária após a injeção de trip e azul para verificar a injeção adequada ou após a injeção de um adenovírus expressando M cherry para verificar a preparação viral adequada e infecção de células epiteliais dúcteis. Quando os tumores são induzidos em camundongos transgênicos F Fluxed P 53 LSLK RAs, os tumores iniciais não se tornarão aparentes até por volta do dia 40, quando as glândulas mamárias ficam aumentadas e inchadas. A partir do dia 56, os tumores começarão a crescer exponencialmente.

Neste ponto, é fundamental medir os volumes do tumor a cada três dias. Se estudos cinéticos forem desejados, como haverá alguma variabilidade normal de camundongo para camundongo na progressão do tumor, grandes massas abdominais serão aparentes no dia 80, após o qual os camundongos devem ser sacrificados se os tumores excederem mais de 10% do peso corporal do animal. A análise de CDNA de três linhagens celulares derivadas de tumores de mama em camundongos transgênicos P 53 LSL KRAS de fluxo revelou que os tumores expressam mesotelina, citoqueratina oito, HER dois novos e receptor de estrogênio alfa, semelhante ao microambiente celular no câncer de mama humano, infiltração de células T alfa, beta e gama delta, bem como células supressoras derivadas de mielóides e macrófagos nos tumores é observada.

A vasculatura que drena para o linfonodo axilar começará a inchurgitar antes que os tumores cresçam e, eventualmente, abrangerá todo o tecido de memória onde a injeção foi realizada. Haverá ingurgitamento evidente da veia epigástrica superficial entre os linfonodos inguinais e axilares também. Após sete a oito semanas, o linfonodo axilar ficará aumentado devido à invasão linfovascular das células tumorais.

A invasão linfovascular e a metástase das células tumorais podem ser rastreadas cruzando camundongos transgênicos Flocked P 53 LSLK RAs com camundongos L-S-L-E-Y-F-P. Após a excisão pré-mediada, células que expressam níveis altos e baixos de YFP são detectadas no tumor e sua metástase pode ser rastreada até o linfonodo axilar de drenagem. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em uma coorte experimental de 20 camundongos em duas a três horas, se realizada corretamente.

Após este procedimento, outros modelos de tumor podem ser desenvolvidos por camundongos com bloqueios adicionais, p transgenes, para responder a perguntas como, como diferentes oncogenes afetam a patologia, microambiente imunológico e invasão metastática do câncer de mama.