Classificando de

O objetivo geral deste procedimento é classificar pellets miceliais formados por streptomyces filamentosos de acordo com o tamanho, utilizando um citômetro de fluxo COPA para partículas grandes. Isso é realizado primeiramente pelo cultivo e subsequente coleta de amostras da linhagem bacteriana desejada. Na segunda etapa, a linhagem amostral é medida por coppa.

Os dados são então analisados in silico e os pellets miceliares são classificados de acordo com parâmetros definidos pelo usuário. Em última instância, essas análises podem ser utilizadas para caracterizar ainda mais a heterogeneidade do tamanho dos pellets. Embora este método possa ser usado para streptomyces, ele também pode ser aplicado a outros organismos, como fungos filamentosos, demonstrando este procedimento será MaRous Petrus, um estudante de doutorado do nosso laboratório.

Primeiro, cultive as culturas adicionando 100 mililitros de extrato de levedura, meio extrato de malte e 0,2 mililitros de cloreto de magnésio 2,5 molar a um frasco erlenmeyer estéril de 250 mililitros, equipado com molas metálicas espiraladas para cada amostra bacteriana. Em seguida, inocule cada frasco com um vezes 10 à oitava espóros de *Streptomyces* para obter uma concentração de espóros de um vezes 10 à sexta espóros por mililitro e cultive as bactérias a 30 graus Celsius com agitação a 180 RPM. Após dois dias, use uma pipeta estéril de cinco mililitros para coletar uma amostra de cinco mililitros de cada cultura, agitando suavemente o frasco para distribuir uniformemente as células.

Em seguida, distribua cada amostra em tubos cónicos individuais de 15 mililitros. Para avaliar as amostras por análise de copus, certifique-se de que o computador do copus com bomba e o laser de argônio de 488 nanômetros estão ligados e, depois, abra o software bio source. Verifique se o frasco do fluido de revestimento está cheio e se o frasco de resíduos está vazio, e então clique em iniciar e execute.

Para ligar o laser de argônio de 488 nanômetros do modo de espera, aguarde aproximadamente 60 segundos até que o laser esteja pronto. Clique em concluído e, em seguida, verifique os manômetros. Clique na caixa de seleção ao lado da pressão.

Certo, e depois que o sistema preparar a célula de fluxo, confirme se a configuração de atraso está em 11 e se a largura está em sete. Ajuste os limiares em 50 para o sinal e 40 para o tempo de voo mínimo. Em seguida, remova a água restante do copo de amostra.

Adicione cerca de 50 mililitros de PBS e, em seguida, adicione 0,1 mililitro de uma das amostras de strep demy ao copo. Certifique-se de que o copo está bem fechado e, então, clique em adquirir para começar a coletar dados. Ajuste a velocidade de fluxo para obter entre 30 e 50 eventos por segundo quando pelo menos 2.500 eventos tiverem sido coletados.

Clique, pare e depois armazene para salvar os dados para análise estatística subsequente para classificar os pelotes bacterianos de cada amostra. Primeiro, defina os limites de classificação e insira os detalhes sobre os valores mínimos e máximos de tempo de voo. Alternativamente, selecione regiões e depois defina a região do gate para criar uma área para selecionar os pelotes com as dimensões e propriedades desejadas.

Coloque um tubo de 50 mililitros para coletar os pellets que atendem aos parâmetros de classificação. Em seguida, defina o número de pellets a serem classificados e clique em classificar manualmente para realizar a seleção com base nos parâmetros escolhidos. Após a classificação, remova a amostra restante e enxágue o copo da amostra com água duas vezes.

Antes de desligar o copo, limpe o copo da amostra com etanol a 70%. Agora, execute o sistema duas vezes: uma com água clorada e outra com água pura; em seguida, esvazie o recipiente de transbordamento. Após a limpeza, clique em parar para liberar a pressão do sistema.

Quando o motor parar, feche o programa e clique em desligar sem fazer a purga. Em seguida, desligue o computador, o copa, o laser e a bomba. Streptomyces form. Pelotas miceliares e culturas líquidas que apresentam uma ampla variedade de tamanhos.

Para analisar a distribuição de tamanho do pellet, uma cultura de *Streptomyces cila* corada com dois dias de crescimento em meio líquido foi submetida à citometria de fluxo de partículas grandes utilizando um analisador Copus Plus equipado com um bico de um milímetro. Aqui, é mostrado um gráfico de dispersão típico da saída do Copus. O eixo x representa o tempo de voo.

Quanto maior o agregado, mais tempo leva para atravessar o feixe de laser. O eixo Y indica a extinção, que representa a densidade óptica do objeto, sendo que cada ponto corresponde a uma única partícula passando através do feixe de laser. A representação dos pontos de dados em um histograma indicou que os tamanhos dessa amostra representativa não apresentavam distribuição normal.

A distribuição parecia estar inclinada para a direita no log. Transformar o conjunto de dados também não resultou em uma distribuição normal. Para avaliar se a distribuição de tamanho poderia ser explicada pela suposição de uma mistura de duas distribuições normais, os dados foram modelados matematicamente. A modelagem indicou, de fato, uma população de pelotas pequenas, composta por 92% de todas as pelotas, com tamanho médio de 248 micrômetros, e uma população de pelotas grandes, compreendendo 8% de todas as pelotas, com tamanho médio de 319 micrômetros.

Aqui é apresentada uma análise representativa de microcolônias separadas das populações de pelotas grandes e pequenas. Os tamanhos médios das pelotas das duas populações foram utilizados para definir os limites de separação, de modo a limitar a triagem de pelotas da região de sobreposição das duas distribuições de tamanho; pelotas menores que 248 micrômetros foram consideradas pertencentes à população de pelotas pequenas, enquanto pelotas maiores que 319 micrômetros foram consideradas pertencentes à população de pelotas grandes. A análise microscópica das pelotas separadas confirmou seus tamanhos distintos após este procedimento.

Outros métodos, como sequenciamento de nova geração ou proteômica, podem ser realizados para desvendar os mecanismos subjacentes a essa heterogeneidade.