Classificando de Streptomyces pellets de células usando um objeto complexo Parametric Analyzer e Sorter

O objetivo geral deste procedimento é classificar os pellets miceliais formados por estreptomices filamentosos de acordo com o tamanho, usando um citômetro de fluxo COPA de partículas grandes. Isso é realizado primeiro pelo crescimento e subsequente amostragem da cepa bacteriana desejada. Na segunda etapa, a deformação da amostra é medida por coppa.

Os dados são então analisados in silico e os pellets miceliais são classificados de acordo com parâmetros definidos pelo usuário. Em última análise, essas análises podem ser usadas para caracterizar ainda mais a heterogeneidade do tamanho do pellet. Embora este método possa ser usado para estreptomices, ele também pode ser aplicado a outros organismos, como fungos filamentosos, demonstrando que este procedimento será MaRous Petrus, um estudante de doutorado de nosso laboratório.

Primeiro, cultive as culturas adicionando 100 mililitros de extrato de levedura, meio de extrato de malte e 0,2 mililitros de cloreto de magnésio 2,5 molar a um frasco erlenmeyer estéril de 250 mililitros, equipado com molas helicoidais de metal para cada amostra bacteriana. Em seguida, inocule cada frasco com um vezes 10 elevado a oito esporos de estreptomices, para obter uma concentração de esporos de um multiplicado por seis esporos por mililitro e cultive a bactéria a 30 graus Celsius com agitação a 180 RPM. Após dois dias, use uma pipeta estéril de cinco mililitros para coletar uma amostra de cinco mililitros de cada cultura, agitando suavemente o frasco para distribuir uniformemente as células.

Em seguida, dispense cada amostra em tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Para avaliar as amostras por análise de copus, confirme se o computador da bomba copus plus e o laser de argônio de 488 nanômetros estão ligados e, em seguida, abra o software de fonte biológica. Confirme se o frasco de fluido da bainha está cheio e se o frasco de resíduos está vazio e clique em iniciar e executar.

Para alternar o laser argonne de 488 nanômetros do modo de espera para o ligado após aproximadamente 60 segundos, o laser estará pronto. Clique, concluído e verifique os manômetros. Clique na caixa de seleção ao lado de pressão.

Ok, e depois que o sistema preparar a célula de fluxo, confirme se a configuração de atraso está em 11 e se a largura está em sete. Defina os limites em 50 para sinal e 40 para tempo de voo mínimo. Em seguida, remova a água restante do copo de amostra.

Adicione cerca de 50 mililitros de PBS e, em seguida, adicione 0,1 mililitro de uma das amostras de estreptococos no copo. Certifique-se de que o copo esteja fechado corretamente e clique em adquirir para iniciar a coleta de dados. Gerencie a velocidade do fluxo para obter entre 30 e 50 eventos por segundo quando pelo menos 2.500 eventos tiverem sido coletados.

Clique, pare e armazene para salvar os dados para análise estatística subsequente para classificar os pellets bacterianos para cada amostra. Primeiro, defina os limites de classificação e insira detalhes sobre os valores de tempo mínimo e máximo de voo. Em alternativa, selecione as regiões e, em seguida, defina a região do portão para criar uma área para selecionar os pellets com as dimensões e propriedades desejadas.

Coloque um tubo de 50 mililitros para coletar os pellets que atendem aos parâmetros de classificação. Em seguida, defina o número de pellets a serem classificados e clique em classificar manualmente para classificar os parâmetros selecionados. Após a classificação, remova a amostra restante e lave o copo de amostra com água duas vezes.

Antes de desligar o copus, limpe o copo de amostra com etanol a 70%. Agora execute o sistema duas vezes. Uma vez com água clorada e uma vez com água pura, esvazie o recipiente de transbordamento Após a limpeza, clique em parar para liberar a pressão do sistema.

Quando o motor parar, feche o programa e clique em desligar sem purgar. Em seguida, desligue o computador, a copa, o laser e a bomba estreptomíce. Pellets miceliais e culturas líquidas que têm uma ampla gama de tamanhos.

Para analisar a distribuição do tamanho do pellet, uma cultura de cor de Streptomyces cila cultivada em líquido com dois dias de idade foi submetida à citometria de fluxo de partículas grandes usando um perfilador copus plus equipado com um bico de um milímetro. Aqui, um gráfico de dispersão de saída típico do copus é mostrado. O eixo x representa o tempo de voo.

Quanto maior for a apelação, mais tempo levará para passar o feixe de laser. O eixo Y indica a extinção, que representa a densidade óptica do objeto, cada ponto no corresponde a um único pellet passando pelo feixe de laser. A plotagem dos pontos de dados em um histograma indicou que os tamanhos dessa amostra representativa não eram normalmente distribuídos.

A distribuição parecia estar distorcida para o log direito. A transformação do conjunto de dados também não levou a uma distribuição normal para avaliar se a distribuição de tamanho poderia ser explicada assumindo uma mistura de duas distribuições normais, os dados foram modelados matematicamente. A modelagem de fato indicou uma população de pequenos pellets consistindo de 92% de todos os pellets com um tamanho médio de 248 micrômetros, e uma população de pellets grandes compreendendo 8% de todos os pellets com um tamanho médio de 319 micrômetros.

Aqui é mostrada uma análise representativa de microcolônias classificadas a partir das populações de pelotas grandes e pequenas. Os tamanhos médios dos pellets das duas populações foram usados para definir os limites de classificação, de modo a limitar a classificação dos pellets da porção sobreposta das duas distribuições de tamanho, pellets menores que 248 micrômetros foram considerados da população de pellets pequenos, enquanto pellets maiores que 319 micrômetros foram considerados da população de pellets grandes. A análise microscópica dos pellets classificados confirmou seus tamanhos distintos após este procedimento.

Outros métodos, como sequenciamento de próxima geração ou proteômica, podem ser realizados para desvendar os mecanismos subjacentes dessa heterogeneidade.