Classificando de Streptomyces pellets de células usando um objeto complexo Parametric Analyzer e Sorter
13 de fevereiro de 2014
Adulto líquidos culturas de Streptomyces são caracterizados por pelotas de micélio que são heterogêneos em tamanho. Nós aqui descrever um método para analisar e classificar essas pelotas de uma forma de alto rendimento. Essas pelotas podem ser usados para análises posteriores, que irá fornecer pistas para compreender e controlar a heterogeneidade do crescimento.
O objetivo geral deste procedimento é classificar os pellets miceliais formados por estreptomices filamentosos de acordo com o tamanho, usando um citômetro de fluxo COPA de partículas grandes. Isso é realizado primeiro pelo crescimento e subsequente amostragem da cepa bacteriana desejada. Na segunda etapa, a deformação da amostra é medida por coppa.
Os dados são então analisados in silico e os pellets miceliais são classificados de acordo com parâmetros definidos pelo usuário. Em última análise, essas análises podem ser usadas para caracterizar ainda mais a heterogeneidade do tamanho do pellet. Embora este método possa ser usado para estreptomices, ele também pode ser aplicado a outros organismos, como fungos filamentosos, demonstrando que este procedimento será MaRous Petrus, um estudante de doutorado de nosso laboratório.
Primeiro, cultive as culturas adicionando 100 mililitros de extrato de levedura, meio de extrato de malte e 0,2 mililitros de cloreto de magnésio 2,5 molar a um frasco erlenmeyer estéril de 250 mililitros, equipado com molas helicoidais de metal para cada amostra bacteriana. Em seguida, inocule cada frasco com um vezes 10 elevado a oito esporos de estreptomices, para obter uma concentração de esporos de um multiplicado por seis esporos por mililitro e cultive a bactéria a 30 graus Celsius com agitação a 180 RPM. Após dois dias, use uma pipeta estéril de cinco mililitros para coletar uma amostra de cinco mililitros de cada cultura, agitando suavemente o frasco para distribuir uniformemente as células.
Em seguida, dispense cada amostra em tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Para avaliar as amostras por análise de copus, confirme se o computador da bomba copus plus e o laser de argônio de 488 nanômetros estão ligados e, em seguida, abra o software de fonte biológica. Confirme se o frasco de fluido da bainha está cheio e se o frasco de resíduos está vazio e clique em iniciar e executar.
Para alternar o laser argonne de 488 nanômetros do modo de espera para o ligado após aproximadamente 60 segundos, o laser estará pronto. Clique, concluído e verifique os manômetros. Clique na caixa de seleção ao lado de pressão.
Ok, e depois que o sistema preparar a célula de fluxo, confirme se a configuração de atraso está em 11 e se a largura está em sete. Defina os limites em 50 para sinal e 40 para tempo de voo mínimo. Em seguida, remova a água restante do copo de amostra.
Adicione cerca de 50 mililitros de PBS e, em seguida, adicione 0,1 mililitro de uma das amostras de estreptococos no copo. Certifique-se de que o copo esteja fechado corretamente e clique em adquirir para iniciar a coleta de dados. Gerencie a velocidade do fluxo para obter entre 30 e 50 eventos por segundo quando pelo menos 2.500 eventos tiverem sido coletados.
Clique, pare e armazene para salvar os dados para análise estatística subsequente para classificar os pellets bacterianos para cada amostra. Primeiro, defina os limites de classificação e insira detalhes sobre os valores de tempo mínimo e máximo de voo. Em alternativa, selecione as regiões e, em seguida, defina a região do portão para criar uma área para selecionar os pellets com as dimensões e propriedades desejadas.
Coloque um tubo de 50 mililitros para coletar os pellets que atendem aos parâmetros de classificação. Em seguida, defina o número de pellets a serem classificados e clique em classificar manualmente para classificar os parâmetros selecionados. Após a classificação, remova a amostra restante e lave o copo de amostra com água duas vezes.
Antes de desligar o copus, limpe o copo de amostra com etanol a 70%. Agora execute o sistema duas vezes. Uma vez com água clorada e uma vez com água pura, esvazie o recipiente de transbordamento Após a limpeza, clique em parar para liberar a pressão do sistema.
Quando o motor parar, feche o programa e clique em desligar sem purgar. Em seguida, desligue o computador, a copa, o laser e a bomba estreptomíce. Pellets miceliais e culturas líquidas que têm uma ampla gama de tamanhos.
Para analisar a distribuição do tamanho do pellet, uma cultura de cor de Streptomyces cila cultivada em líquido com dois dias de idade foi submetida à citometria de fluxo de partículas grandes usando um perfilador copus plus equipado com um bico de um milímetro. Aqui, um gráfico de dispersão de saída típico do copus é mostrado. O eixo x representa o tempo de voo.
Quanto maior for a apelação, mais tempo levará para passar o feixe de laser. O eixo Y indica a extinção, que representa a densidade óptica do objeto, cada ponto no corresponde a um único pellet passando pelo feixe de laser. A plotagem dos pontos de dados em um histograma indicou que os tamanhos dessa amostra representativa não eram normalmente distribuídos.
A distribuição parecia estar distorcida para o log direito. A transformação do conjunto de dados também não levou a uma distribuição normal para avaliar se a distribuição de tamanho poderia ser explicada assumindo uma mistura de duas distribuições normais, os dados foram modelados matematicamente. A modelagem de fato indicou uma população de pequenos pellets consistindo de 92% de todos os pellets com um tamanho médio de 248 micrômetros, e uma população de pellets grandes compreendendo 8% de todos os pellets com um tamanho médio de 319 micrômetros.
Aqui é mostrada uma análise representativa de microcolônias classificadas a partir das populações de pelotas grandes e pequenas. Os tamanhos médios dos pellets das duas populações foram usados para definir os limites de classificação, de modo a limitar a classificação dos pellets da porção sobreposta das duas distribuições de tamanho, pellets menores que 248 micrômetros foram considerados da população de pellets pequenos, enquanto pellets maiores que 319 micrômetros foram considerados da população de pellets grandes. A análise microscópica dos pellets classificados confirmou seus tamanhos distintos após este procedimento.
Outros métodos, como sequenciamento de próxima geração ou proteômica, podem ser realizados para desvendar os mecanismos subjacentes dessa heterogeneidade.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método para classificar pellets miceliais de culturas de Streptomyces cultivadas em meio líquido com base no tamanho usando um citômetro de fluxo COPA de partícula grande. A abordagem permite a análise de alto rendimento da heterogeneidade de tamanho dos pellets, o que pode levar a insights sobre o controle do crescimento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Biologia Celular
- Biotecnologia
Fundamento
- Streptomyces são bactérias filamentosas conhecidas por seus ciclos de vida complexos.
- Os pellets miceliais formados durante o crescimento exibem heterogeneidade de tamanho.
- Entender essa heterogeneidade é crucial para aplicações em biotecnologia.
- A citometria de fluxo fornece um método para analisar o tamanho das partículas de maneira de alto rendimento.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para classificar pellets miceliais por tamanho.
- Analisar a distribuição de tamanho dos pellets de Streptomyces.
- Fornecer uma base para estudos adicionais sobre a heterogeneidade do crescimento.
Métodos Utilizados
- Crescimento de culturas de Streptomyces em um ambiente controlado.
- Amostragem e preparação de culturas para análise por citometria de fluxo.
- Uso do citômetro de fluxo COPA para medir e classificar pellets com base no tamanho.
- Análise estatística da distribuição de tamanho e modelagem das populações de pellets.
Principais Resultados
- Identificação de duas populações distintas de pellets com base no tamanho.
- Os pellets pequenos tinham uma média de 248 micrômetros, enquanto os pellets grandes tinham uma média de 319 micrômetros.
- A distribuição de tamanho não era normalmente distribuída, indicando heterogeneidade significativa.
- A análise microscópica confirmou os tamanhos distintos dos pellets classificados.
Conclusões
- O método desenvolvido classifica efetivamente os pellets miceliais por tamanho.
- Análises adicionais podem elucidar os mecanismos por trás da heterogeneidade de tamanho.
- Essa abordagem pode ser adaptada para outros organismos filamentosos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Heterogeneity in mycelial pellet size directly impacts productivity in streptomycetes-based antibiotic and enzyme production, creating a bottleneck in cell factory optimization. Sorting pellets by size enables mechanistic de-risking of growth variability and supports predictive confidence in strain performance. This capability informs early discovery decisions by linking phenotypic output to bioprocess scalability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of growth heterogeneity hypotheses by isolating defined pellet subpopulations.
- Operational Value: Provides reproducible fractionation of mycelial pellets for downstream omics or phenotypic screening.
- Strategic Value: Supports target validation by linking pellet size to productivity traits in streptomycetes cell factories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates size-sorted pellet fractions for standardized assay inputs in enzyme or metabolite screening.
- Operational Value: Delivers quantitative time-of-flight and extinction measurements for pellet classification.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization by reducing biological noise from pellet size variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables continuity from discovery to preclinical scale by providing sorted pellets for RNA, protein, or omics analysis.
- Operational Value: Supports scalable sample preparation for mechanistic studies underlying pellet heterogeneity.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement by identifying size-correlated productivity markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling phenotypic screening of pellet subpopulations prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of growth mechanisms through size-based pellet fractionation.
- Screening: Delivers assay-ready, size-homogeneous pellet samples for compound or condition testing.
- Analytics: Provides time-of-flight and extinction readouts for quantitative pellet classification and sorting.
- Translational Research: Connects sorted pellets to downstream molecular analysis for biomarker or mechanism discovery.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for pellet analysis across streptomycetes strain development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in growth studies by enabling isolation of defined pellet populations.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization in pellet analysis across batches and strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking pellet size to productivity outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of streptomycetes strains based on size-sorted productivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and streptomycetes culture handling.
- Dependent on large particle COPAS instrumentation with appropriate nozzle and laser configuration.
- Necessitates standardization of sample preparation and sheath fluid protocols across users.
- Involves adaptation of sorting gates for different pellet size ranges in various filamentous systems.
- Limited by the need for optimization of flow rates and threshold settings for accurate pellet detection.
