Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo
31 de dezembro de 2015
Descrevemos uma estratégia de classificação para espermátides de camundongos usando citometria de fluxo. As espermátides são classificadas em quatro populações altamente puras, incluindo espermogênese redonda (etapas 1-9 da espermiogênese), alongamento precoce (etapas 10-12 da espermiogênese), alongamento tardio (etapas 13-14 da espermiogênese) e espermátides alongadas (etapas 15-16 da espermiogênese). A coloração, o tamanho e a granulosidade do DNA são usados como parâmetros de seleção.
O objetivo geral deste procedimento é separar as espermátides de camundongos em quatro populações distintas, permitindo o estudo molecular da espermiogênese. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da reprodução de espelhos, como qual é o impacto da modelagem cromática na integridade genômica. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece separação de espermatozoides em população de células puras sem contaminação cruzada.
Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando observamos variações importantes na intensidade da coloração DN durante a remodelação da cromatina em parâmetros haplo no dia anterior à classificação celular. Adicione um a dois mililitros de FBS inativado por calor ao fundo redondo de polipropileno de cinco mililitros e tubos cônicos de polipropileno de 15 e 50 mililitros. Em seguida, revestir lentamente os tubos por inversão noturna a quatro graus Celsius em um rotador no dia seguinte.
Decantar cuidadosamente o FBS utilizando uma pipeta P 200 para remover qualquer FBS residual dos tubos de 15 e 50 mililitros e deixando um pequeno volume residual de 100 a 200 microlitros de FBS nos tubos de cinco mililitros para recolha das células purificadas no dia da célula. Triturando, pique as peças de teste encapsuladas em 500 microlitros de tampão de classificação. Em seguida, transfira os fragmentos de tecido para um tubo de 1,5 mililitro usando uma ponta de micropipeta truncada.
Lave as células germinativas dos túbulos seminíferos com uma pipetagem suave para cima e para baixo, seguida de lavagem com uma ponta intacta. Em seguida, use um filtro de células de 40 mícrons para remover os detritos e aglomerados que coletam o filtrado em um tubo cônico de 50 mililitros revestido com FBS. Lave o filtro uma vez com tampão de classificação até um volume total de três mililitros e transfira o filtrado para um tubo cônico de 15 mililitros revestido com FBS.
Em seguida, adicione 16 microlitros de EDTA por mililitro de suspensão celular às células e use uma pipeta de 10 mililitros para fixar lentamente as células ao longo de um minuto com três volumes de gelo frio, 100% de etanol enquanto vórtice de baixa velocidade, a suspensão ficará leitosa após a fixação. Incube as células no gelo por 15 minutos com inversão ocasional. Em seguida, centrifugue a suspensão de células, ressuspenda o palete em dois mililitros de tampão de triagem e core as células germinativas com quatro microlitros de cito16 DNAD imediatamente antes da classificação.
Filtre as células através de um filtro de 50 mícrons em um tubo de fax revestido com FBS e lave o filtro extensivamente com um a dois mililitros de tampão de classificação. Carregue as células germinativas fixas em um classificador de células equipado com laser de 488 nanômetros. Em seguida, exiba o total de eventos com um histograma que representa o número de eventos na área do andar 4 88 do Alexa e bloqueie as células de coloração de DNA positivas.
Em seguida, exiba as células desta porta em uma área de dispersão lateral em relação a um gráfico e porta de área de dispersão direta. As células, conforme indicado, exibem essas células fechadas em uma área de dispersão direta contra uma área, plotagem e portão do Alexa floor 4 88. As células novamente exibem esses portões em parcelas separadas do piso 4 88 da Alexa contra os gráficos de área do piso 4 88 da Alexa.
A espermiogênese é de um a nove e de 10 a 12. As espermátides podem então ser fechadas para triagem para coletar as etapas 13 a 14 e 15 a 16. As espermátides exibem as células da primeira porta em uma área de dispersão direta contra um gráfico de área EXOR 4 88 e porta.
As populações de células indicadas. Em seguida, exiba esses portões no Alexa individual. Piso 4 88 largura contra Alexa piso 4 88 área de parcelas e portão.
As etapas 13 a 14 e 15 a 16 espermatozóides para triagem. Por fim, colete as frações purificadas em 100 a 200 microlitros de FBS em tubos de fundo redondo de cinco mililitros revestidos com FBS individuais em gelo. Nessas imagens, é mostrada a coloração das populações atingidas classificadas por fluxo.
As etapas de espermiogênese de um a nove espermátides normalmente exibem núcleos redondos que aparecem em forma oval na espermiogênese. Espermátides do passo nove, e que são observadas como ganchos alongados nas etapas 10 a 12. As espermátides das etapas 13 a 14 e 15 a 16 das espermátides exibem núcleos com uma forma semelhante, mas com uma intensidade de coloração de DNA ligeiramente diferente, o que permite que essas populações distintas de sper sejam identificadas durante sua classificação por citometria de fluxo.
Seguindo o protocolo demonstrado, pode-se esperar que a pureza das populações individuais de S experimentadas esteja entre 95 e 100%Esta técnica pode ser concluída em seis a oito horas. Se cada passo for seguido corretamente. É preciso lembrar de manter sempre as células no gelo durante todo o procedimento, seguindo este procedimento, pois podem ser obtidas populações distintas de espermatozoides, fornecendo uma quantidade suficiente de material para análises moleculares, como caracterizar o dramático processo de remodelação ou estudar o impacto genético dessa transição.
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Visão Geral
Este artigo descreve uma estratégia de separação por citometria de fluxo para espermátides de camundongo, permitindo a separação em quatro populações distintas. O método aprimora o estudo molecular da espermiogênese e minimiza a contaminação cruzada.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Reprodutiva
- Biologia Celular
Antecedentes
- Os espermátides de camundongo passam por diversas fases durante a espermiogênese.
- Compreender essas fases é fundamental para a biologia reprodutiva.
- A remodelação da cromatina afeta a integridade genômica durante o desenvolvimento dos espermátides.
- Os métodos atuais podem não fornecer pureza suficiente nas populações celulares.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para separar espermátides de camundongo em populações puras.
- Facilitar estudos moleculares da espermiogênese.
- Investigar os efeitos da modelagem da cromatina na integridade genômica.
Métodos Utilizados
- Citometria de fluxo para separação de espermátides.
- Coloração de DNA para parâmetros de seleção.
- Classificação com base em tamanho e granulosidade.
- Preparação de tubos com FBS inativado pelo calor para separação celular.
Resultados Principais
- Separação bem-sucedida dos espermátides em quatro populações distintas.
- Alta pureza das células classificadas com mínima contaminação cruzada.
- Compreensão aprimorada das fases da espermiogênese.
- Potencial para pesquisas adicionais sobre os efeitos na remodelação da cromatina.
Conclusões
- A estratégia de separação desenvolvida é eficaz para o estudo de espermátides.
- Este método pode impulsionar pesquisas em biologia reprodutiva.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para explorar a integridade genômica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A separação citométrica por fluxo específica por etapa de espermátides de camundongo permite uma investigação molecular precisa da espermiogênese, um processo crítico para a integridade da linhagem germinativa masculina. Essa capacidade resolve um desafio de longa data no isolamento de populações puras e definidas por estágio para análises genômicas e proteômicas subsequentes. O método aumenta a confiança preditiva em estudos de remodelação da cromatina e seu impacto na estabilidade genômica, apoiando decisões ajustadas ao risco em portfólios de pesquisa em biologia reprodutiva.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a desvinculação mecanicista ao isolar populações de espermátides em estágios definidos de remodelação da cromatina.
- Apoia a validação funcional de alvos por meio de perfis moleculares específicos para cada etapa.
- Facilita estudos orientados por hipóteses sobre o impacto do remodelamento nuclear na integridade genômica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece populações celulares altamente purificadas e reprodutíveis para padronização de ensaios.
- Permite a avaliação quantitativa de marcadores moleculares em estágios definidos de diferenciação.
- Aprimoreia a preparação para triagem na avaliação de compostos que afetam a maturação de espermatídeos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha descobertas moleculares com processos relevantes à doença na pesquisa da fertilidade masculina.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de alvos reprodutivos.
- Reduz a ambiguidade biológica em estudos translacionais de defeitos na remodelação da cromatina.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de separação integra-se na interface entre a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica, permitindo análises moleculares específicas de cada estágio que orientam tanto a validação do alvo quanto a continuidade translacional.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipótese nula sobre os efeitos da remodelação da cromatina em populações definidas de espermátides.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para comparações entre diferentes condições.
- Análises: Fornece amostras de alta pureza para leituras genômicas e proteômicas robustas.
- Pesquisa Translacional: Conecta insights mecanicistas a modelos pré-clínicos de infertilidade masculina.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para separação celular específica por estágio em fluxos de trabalho de biologia reprodutiva.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de diferenciação de espermatídeos.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho de separação celular para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir em portfólios de alvos reprodutivos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos moleculares na pesquisa de fertilidade masculina.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em citometria de fluxo e biologia de células germinativas.
- Requer acesso a classificadores celulares de alta precisão e protocolos validados de coloração de DNA.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes para garantir reprodutibilidade.
- A adaptação a outras espécies ou tipos celulares pode exigir otimização do protocolo.
- A integridade e pureza da amostra dependem da estrita adesão às orientações de temperatura e manipulação.
