Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Microbiologia
0 visualizações • 3:01 min. • November 28th, 2025
Comece com tubos contendo células bacterianas geneticamente modificadas. Cada bactéria carrega fósmidos de alta cópia que codificam várias enzimas.
Incube os tubos com agitação para facilitar a expressão de várias enzimas intracelulares.
Adicione um substrato específico à enzima-alvo ao tubo de ensaio e adicione um volume igual de tampão ao tubo controle.
Incube com sacudimento. O substrato entra nas células, onde as enzimas-alvo o clivam, gerando um produto fluorescente.
Carregue o tubo de controle em um citômetro de fluxo pré-calibrado.
À medida que cada célula passa por um feixe de laser, ela dispersa a luz. Gerar um gráfico de dispersão para identificar células individuais, que espalham menos luz do que aglomerados.
Exclua os aglomerados celulares e plote o sinal de fluorescência das células individuais para estabelecer a fluorescência basal.
Coloque o tubo tratado com substrato no citometro de fluxo para medir o sinal de fluorescência.
Um aumento do sinal de fluorescência em células tratadas com substrato em comparação com as células controle confirma a expressão da enzima alvo.
Para triar as enzimas metagenômicas de interesse, incube as células separadas a 37 graus Celsius e 200 RPM a
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