Detecção da expressão de enzimas-alvo em células bacterianas geneticamente modificadas

Comece com tubos contendo células bacterianas geneticamente modificadas. Cada bactéria carrega fósmidos de alta cópia que codificam várias enzimas.

Incube os tubos com agitação para facilitar a expressão de várias enzimas intracelulares.

Adicione um substrato específico à enzima-alvo ao tubo de ensaio e adicione um volume igual de tampão ao tubo controle.

Incube com sacudimento. O substrato entra nas células, onde as enzimas-alvo o clivam, gerando um produto fluorescente.

Carregue o tubo de controle em um citômetro de fluxo pré-calibrado.

À medida que cada célula passa por um feixe de laser, ela dispersa a luz. Gerar um gráfico de dispersão para identificar células individuais, que espalham menos luz do que aglomerados.

Exclua os aglomerados celulares e plote o sinal de fluorescência das células individuais para estabelecer a fluorescência basal.

Coloque o tubo tratado com substrato no citometro de fluxo para medir o sinal de fluorescência.

Um aumento do sinal de fluorescência em células tratadas com substrato em comparação com as células controle confirma a expressão da enzima alvo.

Para triar as enzimas metagenômicas de interesse, incube as células separadas a 37 graus Celsius e 200 RPM até que o OD₆₀₀ atinja 0,5. Depois, adicione 1 micrólitro de solução de indução por cópia para amplificar o número de cópias intracelulares de fosmid.

Após três horas a 37 graus Celsius e 250 RPM, combine 0,5 mililitro das células com o substrato apropriado em um tubo de fundo arredondado de 14 mililitros para uma concentração final de 100 micromolares. Em seguida, incube as amostras controle e experimentais a 37 graus Celsius e 200 RPM por mais três horas.

Enquanto as amostras estão tremendo, defina os parâmetros da máquina FACS como acabei de demonstrar. Depois, adicione 5 microlitros de células de cada amostra em tubos individuais de fundo arredondado de 5 mililitros contendo 1 mililitro de PBS. Em seguida, carregue as células de amostra e defina a taxa de eventos para 1000 a 3000 eventos por segundo.

Crie um gráfico de área de dispersão frontal em escala logarítmica versus área de dispersão lateral em escala logarítmica, e ajuste a porta de dispersão R1 para abranger as células bacterianas do evento singlete. Depois, crie um gráfico de dispersão direta em escala logarítmica versus gráfico de área FITC em escala logarítmica e configure uma porta de classificação R2 para que menos de 0,1% das células negativas sejam detectadas. Agora, carregue o tubo de amostra e reajuste a taxa de eventos para 1000 a 3000 eventos por segundo, conforme necessário.