Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em Drosophila

O objetivo geral deste experimento é analisar os padrões de projeção do neurônio motor em embriões em estágio avançado de Drosophila melanogaster. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento neural, como orientação do axônio motor e formação de subcu neural. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece visualização precisa do axônio motor em embriões em desenvolvimento, o que permite uma análise confiável do achado do caminho axonal e direciona o defeito da condição.

Um dia após a instalação das placas de coleta de ovos, substitua as placas por novas contendo um pouco de pasta de fermento recém-feita. Após três horas nos pratos frescos, transfira as moscas para novas garrafas de comida. E incube os pratos de ovos durante a noite a 25 graus Celsius.

De manhã, adicione 1,8 mililitros de solução PBT às placas. E use um cotonete para desalojar os embriões. Em seguida, usando uma pipeta de 1 mililitro, transfira os embriões e a solução para um tubo de microcentrífuga.

Assim que os embriões se acomodarem no fundo, aspire o máximo de solução possível. Em seguida, enxágue os embriões duas vezes usando um mililitro de PBT por enxágue. Para decoreonar os embriões, substitua o último enxágue por um mililitro de alvejante a 50% e balance o tubo por três minutos em temperatura ambiente.

Para remover o alvejante, enxágue os embriões três vezes com PBT. Em seguida, substitua o último enxágue por meio mililitro de heptano a 100% e meio mililitro de paraformaldeído a 4%. Agora, incube os embriões por 15 minutos com um balanço suave.

Após a incubação, remova a camada de solução subjacente e adicione de volta 500 microlitros de metanol a 100%. Agora, por 30 segundos, agite o tubo vigorosamente para desvitelinizar os embriões. Em seguida, remova a solução sobreposta, adicione de volta 500 microlitros de metanol a 100% e agite o tubo por mais 10 segundos.

Após agitar o tubo, bata nele para ajudar os embriões a se assentarem e remova o máximo de solução possível. Em seguida, enxágue brevemente os embriões com 100% de metanol. Em seguida, enxágue imediatamente os embriões com PBT três vezes.

Agora, ressuspenda os embriões em um mililitro de PBT fresco. E incube os embriões a 37 graus Celsius por 15 minutos para prepará-los para a coloração LacZ. Enquanto os embriões incubam, prepare uma alíquota de um mililitro de solução de coloração X-gal.

Aqueça a alíquota em banho-maria a 65 graus Celsius até que fique turva. Em seguida, transfira-o para um bloco de calor de 37 graus Celsius. Depois de os embriões terem sido aquecidos durante 15 minutos, retirar a solução de PBT e substituí-la por uma alíquota de um mililitro de solução de coloração.

Em seguida, adicione 20 microlitros de substrato X-gal. Por cerca de duas a quatro horas, incube o tubo a 37 graus Celsius com um balanço suave até formar um precipitado azul. Em seguida, remova a solução de coloração e enxágue os embriões três vezes com PBT em temperatura ambiente.

Após os enxágues, use uma sonda de agulha ou fórceps para classificar manualmente os embriões em um microscópio de dissecação. Colete os embriões corados de interesse em um tubo de microcentrífuga de meio milímetro usando uma pipeta de um mililitro. Em seguida, lave os embriões selecionados com 0,4 mililitros de PBT.

Em seguida, substitua o PBT por 0,3 mililitros de solução de bloqueio e deixe os embriões incubarem com agitação suave por 15 minutos. Após 15 minutos, adicione 75 microlitros do anticorpo primário e continue a incubação durante a noite. Na manhã seguinte, lave os embriões com PBT por cerca de duas horas, trocando a solução de lavagem aproximadamente a cada 30 minutos.

Após a lavagem, adicione 0,3 mililitros de solução de bloqueio contendo o anticorpo secundário e incube o tubo com um balanço suave à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, lave os embriões com PBT por cerca de três horas. Troque o PBT pelo menos cinco vezes durante o período de lavagem.

Após a lavagem, ressuspenda os embriões em 0,3 mililitros de solução dab e adicione dois microlitros de peróxido de hidrogênio a 3%. Em seguida, incube-os no escuro com um balanço suave à temperatura ambiente até que seja produzido precipitado suficiente. Isso geralmente leva de 30 a 60 minutos.

Em seguida, enxágue os embriões com PBT quatro vezes e ressuspenda-os em 0,2 mililitros de solução de montagem. Agora, permita que os embriões se equilibrem no escuro a 4 graus Celsius. Para filetar os embriões, coloque-os em uma lâmina de vidro.

Primeiro, mova-os para uma gota de glicerol com o lado ventral para cima. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, corte a parte anterior e 1/4 do comprimento do corpo e remova a região mais posterior, que está livre de axônios motores. Agora, usando uma sonda de agulha, mova a preparação para fora do glicerol, orientada para o lado dorsal para cima e posicione-a horizontalmente no campo de visão.

O próximo passo requer uma agulha fina de tungstênio que foi inserida na região oca de uma sonda de agulha e, em seguida, dobrada no final. Usando a agulha de tungstênio, faça um pequeno corte na extremidade posterior do embrião e continue a cortar a linha média dorsal. Certifique-se de que a ponta da agulha de tungstênio não toque na superfície da lâmina de vidro durante a dissecação, porque a agulha se dobrará facilmente contra o vidro.

Em seguida, com a sonda, retorne a preparação de volta à gota de glicerol e posicione-a com o lado dorsal para cima. Lá, separe o intestino da parede do corpo, desdobrando cada parede do corpo na direção ventral-lateral. As duas paredes do corpo devem se separar.

Agora, usando a sonda, mova cuidadosamente as abas da parede do corpo para uma lâmina de vidro. No slide, use uma agulha de tungstênio para remover os órgãos internos, empurrando-os lateralmente. Para estabilizar a agulha de tungstênio e evitar que ela seja danificada, mantenha a agulha oca sondada e segure a agulha de tungstênio apoiada contra a superfície da lâmina de vidro enquanto manipula a agulha de tungstênio.

Agora, monte as preparações em oito microlitros de solução de montagem em uma nova lâmina de vidro. Coloque uma lamínula e sele as bordas com esmalte comum. Em seguida, capture imagens em alta resolução usando a óptica DIC.

Usando o método descrito, os embriões do estágio 16 foram corados com o anticorpo Fas2 e preparados para visualização dos neurônios motores e hemissegmentos abdominais A3 e A4. Normalmente, pelo menos sete neurônios motores estendem e fasciculam seus axônios para formar um ramo nervoso ISNb. Muitos feixes nervosos circundantes também foram identificáveis nesta preparação. Quando o feixe de nervos intersegmentares atinge o ponto de escolha no músculo 6 e 7, dois axônios seletivamente desfasciculam e enervam os músculos 6 e 7.

O mesmo ocorre em outros pontos de escolha, pois o feixe se estende dorsalmente. Então, no último ponto de escolha, dois axônios enervam o músculo 12. Em contraste, em embriões mutantes Sema-1a, os mesmos axônios não conseguem desfascicular em seus pontos de escolha.

Isso não é inesperado, pois o produto egeu Sema-1 é conhecido por ajudar a formar conexões entre os axônios motores e os músculos-alvo durante o desenvolvimento neural. Assim, o método descrito pode ser usado para analisar fenótipos mutantes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como classificar os embriões mutantes desejados, como imunocolorir os padrões de projeção axonal dos neurônios motores e como dissecar embriões fixos para preparação plana.