Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em

O objetivo geral deste experimento é analisar os padrões de projeção dos neurônios motores em embriões de estágio avançado de Drosophila melanogaster. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área do desenvolvimento neural, como o direcionamento dos axônios motores e a formação de subcamadas neurais. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma visualização precisa dos axônios motores em embriões em desenvolvimento, o que permite uma análise confiável do rastreamento axonal e dos defeitos nas condições-alvo.

Um dia após a montagem das placas de coleta de ovos, substitua as placas por outras novas contendo uma gota de pasta de levedura recém-preparada. Após três horas em placas frescas, transfira as moscas para novos frascos com alimento. Incube as placas de ovos durante a noite a 25 graus Celsius.

No período da manhã, adicione 1,8 mililitros de solução PBT às placas. E use um cotonete para desprender os embriões. Em seguida, utilizando uma pipeta de 1 mililitro, transfira os embriões e a solução para um tubo de microcentrífuga.

Uma vez que os embriões assentem no fundo, aspire a maior quantidade possível de solução. Em seguida, lave os embriões duas vezes utilizando um mililitro de PBT por lavagem. Para descorionar os embriões, substitua a última lavagem por um mililitro de hipoclorito a 50% e agite o tubo durante três minutos à temperatura ambiente.

Para remover o alvejante, lave os embriões três vezes com PBT. Em seguida, substitua a última lavagem por meio mililitro de heptano a 100% e meio mililitro de paraformaldeído a 4%. Incube, agora, os embriões por 15 minutos com agitação suave.

Após a incubação, remova a camada de solução inferior e adicione novamente 500 microlitros de metanol a 100%. Agora, agite o tubo vigorosamente por 30 segundos para desvietelinar os embriões. Em seguida, remova a solução sobrenadante, adicione novamente 500 microlitros de metanol a 100% e agite o tubo por mais 10 segundos.

Após agitar o tubo, bata nele para ajudar os embriões a sedimentarem e remova o máximo de solução possível. Em seguida, lave brevemente os embriões com metanol a 100%. Depois, lave imediatamente os embriões com PBT três vezes.

Agora, ressuspenda os embriões em um mililitro de PBT fresco. E incube os embriões a 37 graus Celsius por 15 minutos para prepará-los para a coloração com LacZ. Enquanto os embriões estão em incubação, prepare uma alíquota de um mililitro da solução de coloração com X-gal.

Aqueça a alíquota em banho-maria a 65 graus Celsius até ficar turva. Em seguida, transfira-a para um bloco térmico a 37 graus Celsius. Após os embriões terem sido aquecidos por 15 minutos, remova a solução PBT e substitua pela alíquota de um mililitro da solução de coloração.

Em seguida, adicione 20 microlitros de substrato X-gal. Incube o tubo a 37 graus Celsius com agitação suave por cerca de duas a quatro horas, até a formação de um precipitado azul. Em seguida, remova a solução de coloração e lave os embriões três vezes com PBT à temperatura ambiente.

Após as lavagens, use uma sonda de agulha ou pinças para separar manualmente os embriões sob um microscópio estereoscópico. Colete os embriões corados de interesse em um tubo microcentrífugo de meio milímetro usando uma pipeta de um mililitro. Em seguida, lave os embriões selecionados com 0,4 mililitros de PBT.

Em seguida, substitua o PBT por 0,3 mililitros de solução bloqueadora e deixe os embriões incubar sob agitação suave por 15 minutos. Após 15 minutos, adicione 75 microlitros do anticorpo primário e continue a incubação durante a noite. Na manhã seguinte, lave os embriões com PBT por cerca de duas horas, trocando a solução de lavagem aproximadamente a cada 30 minutos.

Após a lavagem, adicione 0,3 mililitros de solução bloqueadora contendo o anticorpo secundário e incube o tubo com agitação suave em temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, lave os embriões com PBT por cerca de três horas. Troque o PBT pelo menos cinco vezes durante o período de lavagem.

Após a lavagem, re-suspenda os embriões em 0,3 mililitros de solução dab e adicione dois microlitros de peróxido de hidrogênio a 3%. Em seguida, incube-os no escuro com agitação suave à temperatura ambiente até que seja produzido precipitado suficiente. Isso geralmente leva de 30 a 60 minutos.

Em seguida, lave os embriões com PBT quatro vezes e re-suspenda-os em 0,2 mililitros de solução de montagem. Agora, deixe os embriões equilibrarem no escuro a 4 graus Celsius. Para filetar os embriões, posicione-os em uma lâmina de vidro.

Primeiro, coloque-os em uma gota de glicerol com o lado ventral voltado para cima. Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, corte a parte anterior e 1/4 do comprimento do corpo e remova a região mais posterior, que é livre de axônios motores. Agora, usando uma sonda de agulha, mova o preparado para fora do glicerol, com o lado dorsal voltado para cima, e posicione-o horizontalmente no campo de visão.

O próximo passo exige uma agulha fina de tungstênio que foi inserida na região oca de uma sonda de agulha e, em seguida, dobrada na extremidade. Usando a agulha de tungstênio, faça um pequeno corte na extremidade posterior do embrião e continue cortando ao longo da linha média dorsal. Certifique-se de que a ponta da agulha de tungstênio não toque a superfície da lâmina de vidro durante a dissecação, pois a agulha se dobrará facilmente ao contato com o vidro.

Em seguida, com a preparação do bastão retornada, volte à gota de glicerol e posicione-a com o lado dorsal voltado para cima. Nesse momento, desprenda o intestino da parede corporal desdobrando cada parede corporal em direção ventro-lateral. As duas paredes corporais devem se separar.

Agora, utilizando a sonda, mova cuidadosamente as abas da parede corporal para uma lâmina de vidro. Na lâmina, use uma agulha de tungstênio para remover os órgãos internos, empurrando-os lateralmente. Para estabilizar a agulha de tungstênio e evitar que seja danificada, mantenha a agulha oca sondada e segure a agulha de tungstênio apoiada contra a superfície da lâmina de vidro enquanto a manipula.

Agora, monte as preparações em oito microlitros de solução de montagem sobre uma lâmina de vidro nova. Aplique uma lamínula e feche as bordas com esmalte comum. Em seguida, capture imagens em alta resolução utilizando óptica DIC.

Utilizando o método descrito, embriões do estágio 16 foram corados com anticorpo contra Fas2 e preparados para a visualização dos neurônios motores e dos hemissegmentos abdominais A3 e A4. Normalmente, pelo menos sete neurônios motores estendem e fasciculam seus axônios para formar um ramo nervoso ISNb. Muitos feixes nervosos circundantes também foram identificáveis nesta preparação. Quando o feixe nervoso intersegmentar atinge o ponto de escolha nos músculos 6 e 7, dois axônios desfasciculam-se seletivamente e inervam os músculos 6 e 7.

O mesmo ocorre em outros pontos de escolha à medida que o feixe se estende dorsalmente. Em seguida, no último ponto de escolha, dois axônios inervam o músculo 12. Em contraste, em embriões mutantes de Sema-1a, os mesmos axônios não conseguem desfascicularizar em seus pontos de escolha.

Isso não é inesperado, pois sabe-se que o produto Sema-1 aegean ajuda na formação de conexões entre axônios motores e músculos-alvo durante o desenvolvimento neural. Assim, o método descrito pode ser utilizado para analisar fenótipos mutantes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como separar os embriões mutantes desejados, como imunomarcar os padrões de projeção axonal dos neurônios motores e como dissecar embriões fixados para preparação plana.