Visualização de padrões de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila

Comece com um tubo contendo embriões de Drosophila em estágio avançado 16 em um meio de montagem.

Os neurônios motores da Drosophila são imunomarcados.

Transfira um embrião para uma lâmina de vidro e remova-o do meio de montagem.

Em seguida, coloque o lado ventral do embrião para cima e disseque-o.

Oriente a seção anterior que contém os neurônios motores com o lado dorsal para cima.

Usando uma agulha de tungstênio, corte ao longo da linha média dorsal e espalhe a parede do corpo. Mova o embrião para o meio de montagem. Em seguida, remova os órgãos internos para expor os

neurônios marcados.

Transfira o embrião para uma nova lâmina, monte-o e sele-o.

Observe sob um microscópio de contraste de interferência diferencial à medida que a luz passa pelo embrião, gerando uma imagem de alta resolução.

Os neurônios marcados com padrões de projeção axonal aparecem marrom escuro em um fundo claro.

Os neurônios motores se ramificam em dois nervos principais: os nervos intersegmentar e segmentar, e um ramo menor, o nervo transverso, que inerva os músculos.

Para filetar os embriões, coloque-os em uma lâmina de vidro

Primeiro, mova-os para uma gota de glicerol com o lado ventral para cima. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, corte a parte anterior em 1 quarto do comprimento do corpo. E remova a região mais posterior, que está livre de axônios motores.

Agora, usando uma sonda de agulha, mova a preparação para fora do glicerol, orientada para cima, e posicione-a horizontalmente no campo de visão. O próximo passo requer uma agulha fina de tungstênio que foi inserida na região oca de uma sonda de agulha e depois dobrada no final. Usando a agulha de tungstênio, faça um pequeno corte na extremidade posterior do embrião e continue a cortar a linha média dorsal.

Certifique-se de que a ponta da agulha de tungstênio não toque na superfície da lâmina de vidro durante a dissecação, porque a agulha se dobrará facilmente contra o vidro.

Em seguida, com a sonda, retorne a preparação de volta à gota de glicerol e posicione-a com o lado dorsal para cima. Lá, separe o intestino da parede do corpo, desdobrando cada parede do corpo na direção lateral ventral. As duas paredes do corpo devem se separar. Agora, usando a sonda, mova cuidadosamente as abas da parede do corpo para uma lâmina de vidro. No slide, use uma agulha de tungstênio para remover os órgãos internos, empurrando-os lateralmente.

Para estabilizar a agulha de tungstênio e evitar que ela seja danificada, mantenha as sondas de agulha ocas que seguram a agulha de tungstênio apoiadas contra a superfície da corrediça de vidro enquanto manipula a agulha de tungstênio.

Agora monte as preparações e 8 microlitros de solução de montagem em uma nova lâmina de vidro. Prenda uma lamínula e sele as bordas com esmalte comum. Em seguida, capture imagens em alta resolução usando a óptica DIC.