Visualizando a migração de células da crista neural em um embrião de peixe-zebra usando imagens de lapso de tempo multifóton

Comece com um embrião de peixe-zebra transgênico vivo e descorionado embebido em agarose de baixo ponto de fusão e colocado em uma câmara cheia de meio embrionário.

O embrião expressa células da crista neural marcadas com proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP).

Posicione a câmara no microscópio stage. Usando iluminação de campo claro, ajuste a objetiva para focar e centralizar o embrião no campo de visão.

Mude para o objetivo de imersão em água e concentre-se novamente no embrião.

Ajuste os parâmetros de imagem para adquirir imagens Z-stack da borda lateral para a medial, capturando a largura do olho.

Desligue a iluminação de campo claro, cubra o palco e inicie a imagem de lapso de tempo.

Reabasteça a câmara com mídia conforme necessário durante a geração de imagens.

Sob iluminação a laser, as células da crista neural fluorescem.

Visualize a migração dessas células do tubo neural para as regiões craniofaciais, ao redor do olho em desenvolvimento para preencher o mesênquima periocular e o processo frontonal, e ventralmente para formar os arcos faríngeos.

Depois de colocar toda a configuração no palco do microscópio, de acordo com o protocolo de texto, use a objetiva de cinco vezes para localizar o embrião. Em seguida, levante manualmente a platina para a posição mais alta e use o foco fino para posicionar o embrião no meio da faixa do microscópio.

Abaixe manualmente o stage e altere a objetiva de cinco vezes para a objetiva de imersão em água de 25 vezes. Levante cuidadosamente o palco para trazer o embrião de volta ao foco. No software, clique no modo xyzt para obter várias imagens em intervalos de tempo ou t no plano xy sobre uma profundidade de z.

Use a visualização de epifluorescência ou campo claro para encontrar a profundidade de foco na área de interesse, que demarcará a pilha z. Para esses experimentos, a borda lateral do olho é o início da pilha z. Quando focado aqui no software, clique no botão Iniciar. Depois de focar na linha média do embrião, que é o final da pilha z, clique no botão Terminar.

Uma etapa crítica é garantir que a etapa z englobe a área de interesse. No nosso caso, queremos capturar a largura do olho das bordas laterais para as mediais.

Clique no menu para ajustar o tempo de aquisição e a frequência de imagem. Para uma recuperação adequada do fluoróforo e sobrevivência do embrião, permita uma proporção de pelo menos 1 para 3 entre a aquisição da pilha z quando a energia do laser estiver ligada e o tempo de recuperação quando a energia do laser estiver desligada. Com o tempo apropriado para a recuperação do embrião, defina o tempo entre as pilhas z e a janela designada. Em seguida, defina o período total de tempo para o experimento na janela apropriada.

Agora ative a configuração de imagem ao vivo para fazer os ajustes finais nas configurações do laser. Ajuste as barras deslizantes de transmissão, ganho e deslocamento do laser no software para otimizar a imagem de fluorescência. Além disso, ajuste a orientação do embrião conforme necessário, dependendo da duração do experimento, crescimento antecipado do embrião, etc. Certifique-se de que a área de interesse permaneça dentro do quadro durante o experimento.

Durante a aquisição de lapso de tempo, desligue a fonte de luz de epifluorescência. Cubra o palco com a caixa de segurança do laser, que é adequada para proteção contra a luz de fundo. Em seguida, pressione Iniciar.

Acesse a câmara de banho aberta através das portas deslizantes na caixa de segurança do laser para reabastecê-la com meio embrionário de lapso de tempo a cada 8 a 12 horas. Após a aquisição da imagem, abra os arquivos no software de processamento de imagem. Realce a série de imagens correta.

No software, escolha o menu Processar. Clique em Deconvolução 3D e aplique para desconvoluir cada pilha z. Importe arquivos TIFF individuais para o software de processamento de vídeo. Em seguida, selecione todos os arquivos TIFF e arraste-os para o editor de vídeo. Ajuste a duração de cada imagem no vídeo para 0,1 segundos. Por fim, exporte o vídeo como um arquivo MOV ou MP4.