Um método para gerar Pulmonar Neutrofilia Usando Aerosolized Lipopolysaccharide

Descreve-se um método para a indução de inflamação pulmonar neutrofílica desafio por aerossol para lipopolissacarídeo por nebulização, para modelar a lesão pulmonar aguda. Além disso, também são descritas as técnicas cirúrgicas básicas para isolamento pulmonar, intubação traqueal e lavado bronco-alveolar.

O objetivo geral deste procedimento é gerar neutrofilia consistente e reprodutível das vias aéreas por exposição ao LPS aerossolizado. Isso é feito carregando primeiro o LPS suspenso em solução salina em um nebulizador conectado a uma câmara de exposição. Em seguida, os camundongos são expostos ao LPS aerossolizado e, em seguida, a lavagem broncoalveolar é coletada e as células inflamatórias na lavagem são enumeradas.

Finalmente, o tecido pulmonar é fixado, formalmente para inclusão e secção e análise imuno-histoquímica. Em última análise, as contagens de células totais e diferenciais da lavagem broncoalveolar podem ser usadas para avaliar o recrutamento de neutrófilos para os pulmões. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como a administração intratraqueal de LPS, são a distribuição uniforme do LPS aerossolizado pelos pulmões, a facilidade de desempenho e o treinamento mínimo necessário para uma aplicação bem-sucedida. Para gerar um aerossol de LPS usando EPI adequado e dentro de uma coifa de risco biológico ventilada de nível dois, comece inserindo uma entrada vermelha em um nebulizador e, em seguida, conectando o nebulizador ao ar ambiente pressurizado pela tubulação fornecida pelo fabricante.

Em seguida, use um filtro de ar para conectar a saída do nebulizador a um medidor de fluxo de massa e, em seguida, conecte o medidor de fluxo de massa a uma fonte de alimentação elétrica. Ajuste o fluxo de ar para cinco litros por minuto, mantendo a pressão em um a dois bar e, em seguida, remova o medidor de fluxo de massa e desconecte o fluxo de ar. Em seguida, conecte a saída do nebulizador a um tubo bifurcado de 15.9 milímetros conectado a caixas de plexiglass 2 1 50 por 1 63 por 2 0 5 milímetros equipadas com tampas removíveis.

Cada caixa deve ter um orifício de cinco milímetros no lado oposto à entrada para evitar o acúmulo de pressão. Agora coloque até cinco ratos em cada caixa e feche as tampas. Em seguida, abra o nebulizador.

Encha o inserto com quatro a oito mililitros de LPS dissolvido em solução salina ou veículo salino sozinho e reconecte a entrada ao suprimento de ar. Permita que o aerossol flua para as caixas fechadas de plexiglass com monitoramento contínuo dos animais e certificando-se de que o suprimento de ar permaneça firmemente preso à entrada do nebulizador durante a aerossolização. Após 10 minutos, desconecte o suprimento de ar e deixe os animais nas caixas de acrílico por mais dois minutos.

Em seguida, abra as tampas. Permita que o aerossol se disperse e retorne os camundongos às suas gaiolas no ponto final experimental Para cada animal, por sua vez, primeiro use uma tesoura para fazer um único corte anterior posterior para expor o tórax. Em seguida, levante a caixa torácica pela ponta anterior do esterno e puncione o diafragma no ponto mais ventral sem cortar nenhum tecido pulmonar.

Em seguida, abra a caixa torácica com dois cortes que se encontram abaixo da mandíbula na direção ântero-posterior. Depois que a caixa torácica for aberta, use uma pinça para separá-la suavemente e cortar a traqueia abaixo da laringe. Agora levante a traqueia e corte os ligamentos que conectam os lobos pulmonares à cavidade torácica.

Em seguida, puxe suavemente os pulmões e a traqueia para cima e para longe do tecido adiposo e cardíaco e coloque-os em um pedaço de papel de embalagem de seringa. Em seguida, insira um tubo de polietileno de 0,965 milímetro na traqueia e prenda-o com um fio de seda. Amarre o lóbulo múltiplo com linha de seda também e, em seguida, insira uma agulha de calibre 23 no tubo de polietileno.

Em seguida, para coletar a lavagem broncoalveolar, use uma seringa de um mililitro para injetar lentamente 250 microlitros de gelo chamado PBS estéril no lobo único e bater cuidadosamente nos pulmões e contra a superfície da bancada de trabalho 30 vezes puxe lentamente o líquido de volta para a seringa e colete-o em um tubo após repetir o procedimento com 200 microlitros de PBS fresco, Coloque o lavado broncoalveolar no gelo para posterior análise. Para fixar o tecido pulmonar para análise histológica, remova o lóbulo múltiplo e estalo. Congele em gelo seco.

Armazene o lóbulo a menos 80 graus Celsius. Para fixar o tecido para análise histológica, montar uma seringa de 60 mililitros sem êmbolo em um suporte de metal para insufar o lobo único com formalina por cinco minutos. Em seguida, desconecte a agulha e puxe o fio de seda para removê-lo junto com o tubo de polietileno da traqueia.

Fechando simultaneamente a traqueia e retendo a pressão no pulmão. Em seguida, mergulhe o lóbulo em Formin por 24 horas a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave o tecido fixo três vezes por pelo menos 20 minutos de cada vez em etanol a 70%.

Depois de incorporar o tecido desidratado no filme para, corte o lóbulo em seções de quatro a cinco mícrons e core as seções com hematina e eoína para avaliação histológica. O número total de células no fluido de lavagem broncoalveolar de camundongos expostos a um aerossol gerado apenas com veículo é tipicamente em torno ou abaixo de 200.000 células. As células consistem em 95 a 100% de células mononucleares com apenas alguns linfócitos e sem neutrófilos.

Camundongos desafiados com um miligrama por mililitro de aerossolizado. LPS. No entanto, exibem um número total de células aumentado no fluido de lavagem broncoalveolar, tipicamente superior a 500.000 células após seis horas, com infiltrados celulares permanecendo altos após 24 horas e com um perfil celular deslocado para uma predominância de neutrófilos. Um perfil celular inflamatório semelhante e neutrofilia pulmonar também é observado com nebulização de cinco miligramas por mililitro de LPS.

Neutrófilos foram observados na submucosa epitelial, bem como nos espaços ao redor das vias aéreas condutoras e vasos sanguíneos após seis e 24 horas de desafio com LPS, mas não no controle. Camundongos tratados com solução salina. O conteúdo total de proteína no fluido de lavagem broncoalveolar de camundongos desafiados com LPS é aumentado em comparação com camundongos expostos à solução salina e a expressão do quimiocina atrativo de neutrófilos quimiocinas c, XCL um e C XCL dois também é aumentada em camundongos desafiados com LPS.

Embora este método possa fornecer informações sobre a inflamação pulmonar induzida por LPs. Também pode ser aplicado a outros modelos de doenças, como infecções bacterianas ou virais, pois o vapor aerossolizado pode ser adaptado para oferecer muitos desafios diferentes.