Um método para gerar Pulmonar Neutrofilia Usando Aerosolized Lipopolysaccharide
15 de dezembro de 2014
Descreve-se um método para a indução de inflamação pulmonar neutrofílica desafio por aerossol para lipopolissacarídeo por nebulização, para modelar a lesão pulmonar aguda. Além disso, também são descritas as técnicas cirúrgicas básicas para isolamento pulmonar, intubação traqueal e lavado bronco-alveolar.
O objetivo geral deste procedimento é gerar neutrofilia consistente e reprodutível das vias aéreas por exposição ao LPS aerossolizado. Isso é feito carregando primeiro o LPS suspenso em solução salina em um nebulizador conectado a uma câmara de exposição. Em seguida, os camundongos são expostos ao LPS aerossolizado e, em seguida, a lavagem broncoalveolar é coletada e as células inflamatórias na lavagem são enumeradas.
Finalmente, o tecido pulmonar é fixado, formalmente para inclusão e secção e análise imuno-histoquímica. Em última análise, as contagens de células totais e diferenciais da lavagem broncoalveolar podem ser usadas para avaliar o recrutamento de neutrófilos para os pulmões. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como a administração intratraqueal de LPS, são a distribuição uniforme do LPS aerossolizado pelos pulmões, a facilidade de desempenho e o treinamento mínimo necessário para uma aplicação bem-sucedida. Para gerar um aerossol de LPS usando EPI adequado e dentro de uma coifa de risco biológico ventilada de nível dois, comece inserindo uma entrada vermelha em um nebulizador e, em seguida, conectando o nebulizador ao ar ambiente pressurizado pela tubulação fornecida pelo fabricante.
Em seguida, use um filtro de ar para conectar a saída do nebulizador a um medidor de fluxo de massa e, em seguida, conecte o medidor de fluxo de massa a uma fonte de alimentação elétrica. Ajuste o fluxo de ar para cinco litros por minuto, mantendo a pressão em um a dois bar e, em seguida, remova o medidor de fluxo de massa e desconecte o fluxo de ar. Em seguida, conecte a saída do nebulizador a um tubo bifurcado de 15.9 milímetros conectado a caixas de plexiglass 2 1 50 por 1 63 por 2 0 5 milímetros equipadas com tampas removíveis.
Cada caixa deve ter um orifício de cinco milímetros no lado oposto à entrada para evitar o acúmulo de pressão. Agora coloque até cinco ratos em cada caixa e feche as tampas. Em seguida, abra o nebulizador.
Encha o inserto com quatro a oito mililitros de LPS dissolvido em solução salina ou veículo salino sozinho e reconecte a entrada ao suprimento de ar. Permita que o aerossol flua para as caixas fechadas de plexiglass com monitoramento contínuo dos animais e certificando-se de que o suprimento de ar permaneça firmemente preso à entrada do nebulizador durante a aerossolização. Após 10 minutos, desconecte o suprimento de ar e deixe os animais nas caixas de acrílico por mais dois minutos.
Em seguida, abra as tampas. Permita que o aerossol se disperse e retorne os camundongos às suas gaiolas no ponto final experimental Para cada animal, por sua vez, primeiro use uma tesoura para fazer um único corte anterior posterior para expor o tórax. Em seguida, levante a caixa torácica pela ponta anterior do esterno e puncione o diafragma no ponto mais ventral sem cortar nenhum tecido pulmonar.
Em seguida, abra a caixa torácica com dois cortes que se encontram abaixo da mandíbula na direção ântero-posterior. Depois que a caixa torácica for aberta, use uma pinça para separá-la suavemente e cortar a traqueia abaixo da laringe. Agora levante a traqueia e corte os ligamentos que conectam os lobos pulmonares à cavidade torácica.
Em seguida, puxe suavemente os pulmões e a traqueia para cima e para longe do tecido adiposo e cardíaco e coloque-os em um pedaço de papel de embalagem de seringa. Em seguida, insira um tubo de polietileno de 0,965 milímetro na traqueia e prenda-o com um fio de seda. Amarre o lóbulo múltiplo com linha de seda também e, em seguida, insira uma agulha de calibre 23 no tubo de polietileno.
Em seguida, para coletar a lavagem broncoalveolar, use uma seringa de um mililitro para injetar lentamente 250 microlitros de gelo chamado PBS estéril no lobo único e bater cuidadosamente nos pulmões e contra a superfície da bancada de trabalho 30 vezes puxe lentamente o líquido de volta para a seringa e colete-o em um tubo após repetir o procedimento com 200 microlitros de PBS fresco, Coloque o lavado broncoalveolar no gelo para posterior análise. Para fixar o tecido pulmonar para análise histológica, remova o lóbulo múltiplo e estalo. Congele em gelo seco.
Armazene o lóbulo a menos 80 graus Celsius. Para fixar o tecido para análise histológica, montar uma seringa de 60 mililitros sem êmbolo em um suporte de metal para insufar o lobo único com formalina por cinco minutos. Em seguida, desconecte a agulha e puxe o fio de seda para removê-lo junto com o tubo de polietileno da traqueia.
Fechando simultaneamente a traqueia e retendo a pressão no pulmão. Em seguida, mergulhe o lóbulo em Formin por 24 horas a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave o tecido fixo três vezes por pelo menos 20 minutos de cada vez em etanol a 70%.
Depois de incorporar o tecido desidratado no filme para, corte o lóbulo em seções de quatro a cinco mícrons e core as seções com hematina e eoína para avaliação histológica. O número total de células no fluido de lavagem broncoalveolar de camundongos expostos a um aerossol gerado apenas com veículo é tipicamente em torno ou abaixo de 200.000 células. As células consistem em 95 a 100% de células mononucleares com apenas alguns linfócitos e sem neutrófilos.
Camundongos desafiados com um miligrama por mililitro de aerossolizado. LPS. No entanto, exibem um número total de células aumentado no fluido de lavagem broncoalveolar, tipicamente superior a 500.000 células após seis horas, com infiltrados celulares permanecendo altos após 24 horas e com um perfil celular deslocado para uma predominância de neutrófilos. Um perfil celular inflamatório semelhante e neutrofilia pulmonar também é observado com nebulização de cinco miligramas por mililitro de LPS.
Neutrófilos foram observados na submucosa epitelial, bem como nos espaços ao redor das vias aéreas condutoras e vasos sanguíneos após seis e 24 horas de desafio com LPS, mas não no controle. Camundongos tratados com solução salina. O conteúdo total de proteína no fluido de lavagem broncoalveolar de camundongos desafiados com LPS é aumentado em comparação com camundongos expostos à solução salina e a expressão do quimiocina atrativo de neutrófilos quimiocinas c, XCL um e C XCL dois também é aumentada em camundongos desafiados com LPS.
Embora este método possa fornecer informações sobre a inflamação pulmonar induzida por LPs. Também pode ser aplicado a outros modelos de doenças, como infecções bacterianas ou virais, pois o vapor aerossolizado pode ser adaptado para oferecer muitos desafios diferentes.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para induzir inflamação pulmonar neutrófila por meio da nebulização de lipopolissacarídeo (LPS) em aerossol, modelando lesão pulmonar aguda. Também apresenta técnicas cirúrgicas básicas para isolamento pulmonar, intubação traqueal e lavagem broncoalveolar.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Inflamação Pulmonar
- Lesão Pulmonar Aguda
Contexto
- A LPS nebulizada é utilizada para criar um modelo para o estudo da inflamação neutrófila.
- A lavagem broncoalveolar permite a coleta de células inflamatórias.
- Compreender o recrutamento de neutrófilos é essencial para o estudo de doenças pulmonares.
- Este método oferece vantagens em relação às técnicas tradicionais de administração de LPS.
Objetivo do Estudo
- Gerar neutrofilia das vias aéreas de forma consistente em um ambiente controlado.
- Avaliar o recrutamento de neutrófilos para os pulmões.
- Aprimorar os métodos existentes de indução de inflamação pulmonar.
Métodos Utilizados
- Carregar LPS suspenso em solução salina para um nebulizador.
- Expor camundongos ao LPS nebulizado em uma câmara de exposição.
- Coletar lavado broncoalveolar para contagem celular.
- Fixar o tecido pulmonar para análise imunohistoquímica.
Resultados Principais
- Demonstrou recrutamento eficaz de neutrófilos utilizando LPS aerosolizado.
- Forneceu um método confiável para avaliar a inflamação pulmonar.
- Mostrou vantagens na distribuição e facilidade de uso em comparação com métodos intratraqueais.
- Permitiu análise detalhada das respostas inflamatórias no tecido pulmonar.
Conclusões
- O método com LPS aerosolizado é uma ferramenta valiosa para o estudo da inflamação pulmonar.
- Essa técnica permite obter resultados reprodutíveis em ambientes de pesquisa.
- Estudos futuros podem se basear neste método para explorar intervenções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a indução reprodutível de neutrofilia pulmonar, uma característica patológica fundamental nas lesões pulmonares agudas e nas doenças inflamatórias pulmonares. Ao fornecer um sistema padronizado e de baixo custo para administração por aerossol, ele apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em programas iniciais de descoberta voltados para a patologia pulmonar mediada por neutrófilos. A abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao fornecer leituras inflamatórias quantificáveis relevantes para triagem terapêutica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação dos mecanismos de recrutamento de neutrófilos e das vias de quimiocinas, como CXCL1 e CXCL2, em um ambiente inflamatório controlado.
- Valor Operacional: Fornece um modelo padronizado para avaliar o engajamento de alvos e a modulação de vias na inflamação pulmonar mediada por neutrófilos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera resultados quantificáveis de lavado broncoalveolar, incluindo contagens totais e diferenciais de células e níveis totais de proteína, para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Apoia o desenvolvimento de pontos finais inflamatórios reprodutíveis para triagem de compostos que modulam a entrada ou ativação de neutrófilos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a inflamação neutrófila relevante para doenças observadas na lesão pulmonar aguda humana, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco, permitindo a avaliação consistente de compostos anti-inflamatórios ou moduladores de neutrófilos entre estudos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e os testes de eficácia pré-clínicos, especialmente para programas voltados à inflamação pulmonar e lesão tecidual mediada por neutrófilos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de quimiotaxia de neutrófilos e modulação da cascata inflamatória no parênquima pulmonar.
- Triagem: Oferece uma inflamação neutrófila padronizada para triagem confiável de compostos e validação de alvos em modelos de doenças pulmonares.
- Análises: Fornece leituras quantitativas de lavado broncoalveolar (contagem de células, níveis de proteína, porcentagem de neutrófilos) para comparar respostas inflamatórias entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Modela inflamação pulmonar neutrófila relevante ao ser humano, permitindo continuidade pré-clínica para lesão pulmonar aguda e indicações relacionadas.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de baixo custo e com exigência mínima de treinamento, para uso repetido em múltiplos projetos que estudam inflamação pulmonar ou interações hospedeiro-patógeno.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a variabilidade na indução da inflamação neutrófila.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e escalabilidade por meio da entrega padronizada de aerossóis e requisitos mínimos de expertise técnica.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou interromper projetos ao fornecer fenótipos inflamatórios mecanicamente relevantes e quantificáveis no início do processo de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em dados consistentes de recrutamento de neutrófilos e expressão de quimiocinas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer treinamento básico em geração de aerossóis, manipulação de camundongos e técnica de lavagem broncoalveolar.
- Depende do acesso a um nebulizador, fonte de ar comprimido, câmara de exposição em plexiglass e cabine de segurança biológica para o manuseio de LPS.
- Necessita padronização da concentração de LPS, duração da exposição e condições pós-exposição entre laboratórios para comparabilidade entre estudos.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o sistema para entrega de outros agentes aerossolizados, como patógenos virais ou bacterianos.
- Limitado à pesquisa exploratória não-GMP; não é adequado para toxicologia regulamentada ou produção de materiais clínicos sem validação adicional.
