Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

O objetivo geral deste protocolo experimental é fornecer um procedimento não invasivo e tecnicamente não intensivo para induzir pneumonia bacteriana em camundongos e a subsequente quantificação da resposta de defesa do hospedeiro in vivo nos pulmões. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de doenças infecciosas e imunologia, sobre os genes e vias moleculares que controlam a resposta do hospedeiro à infecção. A principal vantagem deste método de infecção pulmonar é sua simplicidade técnica.

O que permite até a laboratórios com pouca experiência em procedimentos pulmonares estudar a resposta imune inata pulmonar. Em uma instalação de nível biosseguro dois, descongele um estoque glicerinado de K.pneumoniae e transfira um mililitro das bactérias para um frasco de cultura de 500 mililitros contendo 50 mililitros de Caldo Tripticasa de Soja. Incube a cultura em suspensão durante a noite a 37 graus Celsius e 200 a 225 RPM.

Na manhã seguinte, dilua de um a cinco mililitros da cultura bacteriana em um novo frasco contendo 50 mililitros de caldo Triptica de Soja e incube a cultura, no agitador, a 37 graus Celsius por mais 2,5 horas para alcançar a fase log. Ao final da segunda incubação, transfira um mililitro de bactérias da segunda cultura para um tubo de 1,5 mililitro para centrifugação. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet e ressuspenda suavemente as bactérias em um mililitro de solução salina estéril por três lavagens separadas.

Após a terceira lavagem, re-suspenda as bactérias em outro mililitro de solução salina estéril e prepare diluições seriadas em escala logarítmica do inóculo. Meça um mililitro das diluições de um para 10 e um para 100 em cubetas descartáveis, em duplicata, para determinar a DO600 das K. pneumoniae lavadas. Uma DO600 de 1,0 é aproximadamente equivalente a quatro a sete vezes 10 elevado à oitava UFC por mililitro.

Após calcular a concentração das bactérias em cada diluição, reconstitua a dose desejada de UFC do inóculo em 50 a 60 microlitros de solução salina estéril por animal receptor com idade entre oito e doze semanas. Para administrar as bactérias aos animais, aspire o inóculo da dose em uma ponteira de pipeta P200 e posicione o camundongo anestesiado em posição supina semi-recumbente, suspenso pelos incisivos maxilares por meio de uma faixa de borracha esticada entre os pinos de uma placa de Plexiglas inclinada. Utilizando um par de pinças rombudas e sem ranhuras, puxe suavemente a língua para o lado e deposite a dose na cavidade oral do animal, tomando cuidado para evitar traumas à língua ou à faringe oral.

Mantendo a língua retraída, oclua suavemente o nariz com um dedo enluvado, até que o animal inspire duas a três vezes. Quando nenhum líquido for visível na cavidade oral, transfira o camundongo da tábua de inoculação para sua gaiola, na posição supina, para evitar o bloqueio das narinas enquanto o animal se recupera. Faça um corte longitudinal logo abaixo do esterno.

Em seguida, levante o esterno com uma pinça, faça um pequeno corte no diafragma, permitindo que o pulmão retorne à cavidade torácica. Continue a incisão para cima através da cavidade torácica em ambos os lados da vasculatura e suba pelo pescoço. Quando a traqueia estiver visível, corte cuidadosamente ao meio o pescoço e afaste os tecidos para os lados para evitar danificar a vasculatura circundante.

Agora, faça um pequeno corte na traqueia a cerca de um quarto do caminho a partir da cabeça e insira caudalmente uma cânula acoplada a uma seringa de um mililitro pré-carregada com um mililitro de PBS na traqueia. Empurre lentamente o volume para dentro dos pulmões, permitindo que todos os lobos se inflem. Em seguida, aspire novamente o volume com a seringa e reúna as lavagens coletadas em um tubo de 15 mililitros, mantido no gelo.

No ponto final experimental apropriado, colete o sangue do ventrículo esquerdo e transfira-o para um tubo heparinizado para evitar coagulação. Em seguida, retire todos os lobos pulmonares em um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de PBS e o baço em um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de PBS. A seguir, utilize homogeneizadores descartáveis individuais para cada amostra, para macerar os tecidos sobre gelo, seguido por diluições seriadas das suspensões teciduais.

Plaque as diluições, em duplicata, em lados separados de uma única placa de TSA e deixe as amostras secarem brevemente. Em seguida, inverta as placas e cultive as amostras em estufa estática a 37 graus Celsius durante a noite, fazendo a média das colônias bacterianas de ambos os lados da placa e de cada diluição na manhã seguinte. Com 2000 UFC de K.pneumoniae, os camundongos, normalmente, começam a demonstrar sintomas clínicos entre 12 e 24 horas após a infecção.

Em 48 a 72 horas, muitos dos animais apresentam sintomas de doença e morbidade, geralmente precedidos por uma perda média de peso de 20 por cento. No entanto, uma dose LD50 permite a detecção tanto do aumento quanto da diminuição relativos da sobrevida dentro do grupo experimental, podendo ser preferida para estudos de longo prazo. A infecção do trato respiratório inferior por K. pneumoniae é caracterizada por uma acentuada entrada de leucócitos nas vias aéreas nas seis horas seguintes à infecção, que atinge um pico em 24 horas e é majoritariamente representada por neutrófilos.

As citocinas são detectáveis no fluido de lavagem broncoalveolar em 24 e 48 horas após a infecção com K. pneumoniae, e fornecem informações sobre o microambiente pulmonar e seu recrutamento imunológico próprio em resposta à invasão bacteriana. A carga bacteriana no pulmão, sangue e baço também aumenta drasticamente entre 24 e 48 horas de infecção. Uma vez dominado, o método de aspiração orofaríngea para infecção pulmonar pode ser realizado em apenas um a dois minutos por camundongo, se realizado corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não utilizar um volume excessivo de aspiração. Um volume de 50 a 60 microlitros geralmente funciona bem para um camundongo com oito a 12 semanas de idade. Após este procedimento, uma variedade de métodos pode ser realizada nos pulmões e tecidos periféricos para permitir a quantificação da resposta imune na eliminação do patógeno.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir pneumonia bacteriana experimental por meio da administração orofaríngea de patógenos e de como determinar a carga de patógenos em camundongos. Não se esqueça de que trabalhar com microrganismos pode ser perigoso e de que precauções e práticas básicas de BSL-2 devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.