Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

O objetivo geral deste protocolo experimental é fornecer um procedimento não invasivo e tecnicamente não intensivo para induzir pneumonia bacteriana em camundongos e a subsequente quantificação da resposta de defesa do hospedeiro in vivo nos pulmões. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de doenças infecciosas e imunologia, sobre os genes e vias moleculares que controlam a resposta do hospedeiro à infecção. A principal vantagem desse método de infecção pulmonar é sua simplicidade técnica.

O que permite que mesmo laboratórios com pouca experiência em procedimentos pulmonares estudem a resposta imune inata pulmonar. Em uma instalação de nível dois de biossegurança, descongele um estoque de glicerol de K. pneumoniae e transfira um mililitro da bactéria para um frasco de cultura de 500 mililitros contendo 50 mililitros de caldo de soja tríptico. Incubar a cultura de suspensão durante a noite a 37 graus Celsius e 200 a 225 RPM.

Na manhã seguinte, dilua de um a cinco mililitros da cultura bacteriana em um novo frasco contendo 50 mililitros de caldo de soja tríptico e incube a cultura, no shaker, a 37 graus Celsius por mais 2,5 horas para atingir a fase logarítmica. No final da segunda incubação, transfira um mililitro de bactérias da segunda cultura para um tubo de 1,5 mililitro para centrifugação. Remova o sobrenadante sem perturbar a paleta e ressuspenda suavemente as bactérias em um mililitro de solução salina estéril por três lavagens separadas.

Após a terceira lavagem, ressuspenda as bactérias em outro mililitro de solução salina estéril e estabeleça diluições em série do inóculo. Meça um mililitro das diluições de um a 10 e de um a 100 em cubetas descartáveis, em duplicata, para determinar o OD600 do K. pneumoniae lavado. Um OD600 de 1,0 é aproximadamente equivalente a quatro a sete vezes 10 elevado ao oitavo UFC por mililitro.

Depois de calcular a concentração da bactéria em cada diluição, ressuspenda a dose desejada de UFC de inóculo em 50 a 60 microlitros de solução salina estéril por animal receptor de oito a 12 semanas de idade. Para entregar a bactéria aos animais, coloque o inóculo dosador em uma ponta de pipeta P200 e coloque o camundongo anestesiado em decúbito dorsal semi-reclinado, suspenso pelos incisivos superiores, a partir de um elástico esticado entre os pinos de uma placa de acrílico inclinada. Usando uma pinça romba e sem estrias, puxe suavemente a língua para o lado e deposite a dose na cavidade oral do animal, tomando cuidado para evitar induzir trauma na língua ou na faringe oral.

Mantendo a língua retraída, oclua suavemente o nariz com o dedo enluvado, até que a casa inspire duas a três vezes. Quando nenhum líquido for visível na cavidade oral, transfira o camundongo da placa de inoculação para sua gaiola, em decúbito dorsal, para evitar o bloqueio das narinas enquanto o camundongo está se recuperando. Faça um corte longitudinal logo abaixo do esterno.

Em seguida, levantando o esterno com uma pinça, corte o diafragma, permitindo que o pulmão caia de volta para a cavidade torácica. Continue a incisão pela cavidade torácica em ambos os lados da vasculatura e suba pelo pescoço. Quando a traqueia estiver visível, corte cuidadosamente o meio do pescoço e empurre o tecido para os lados para evitar danificar a vasculitura circundante.

Agora corte a traqueia cerca de um quarto da cabeça e insira caudalmente uma cânula presa a uma seringa de um mililitro pré-carregada com um mililitro de PBS na traqueia. Empurre o volume para os pulmões, lentamente, permitindo que todos os lóbulos inflem. Em seguida, puxe o volume de volta com a seringa e agrupe as lavagens coletadas em um tubo de 15 mililitros, no gelo.

No ponto final experimental apropriado, colete o sangue do ventrículo esquerdo e transfira-o para um tubo heparinizado para evitar a coagulação. Em seguida, colha todos os lobos pulmonares em um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de PBS e o baço em um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de PBS. Em seguida, use homogeneizadores individuais e descartáveis por amostra, para macerar os tecidos no gelo, seguido de diluição em série das pastas dos tecidos.

Colocar as diluições em duplicado em lados separados de uma única placa TSA e deixar secar brevemente as amostras. Em seguida, inverta as placas e cultive as amostras em uma incubadora estática de 37 graus Celsius durante a noite, calculando a média das colônias bacterianas de ambos os lados da placa e de cada diluição na manhã seguinte. Em 2000 UFC de K. pneumoniae, os camundongos, tipicamente, começam a demonstrar sintomas clínicos 12 a 24 horas após a infecção.

Dentro de 48 a 72 horas, muitos dos animais apresentam sintomas de doença e morbidade que normalmente são precedidos por uma média de 20% de perda de peso. Uma dose de DL50, no entanto, permite a detecção da sobrevida relativamente aumentada e diminuída dentro do grupo experimental e pode ser preferida para estudos de longo prazo. A infecção do trato respiratório inferior por K. pneumoniae é caracterizada por um influxo robusto de leucócitos nas vias aéreas dentro de seis horas após a infecção, que atinge o pico em 24 horas e é representado principalmente por neutrófilos.

As citocinas são detectáveis no líquido da lavagem broncoalveolar 24 e 48 horas após a infecção por K. pneumoniae e fornecem informações sobre o microambiente pulmonar e seu auto-recrutamento imunológico em resposta à invasão bacteriana. A carga bacteriana no pulmão, sangue e baço também aumenta drasticamente entre 24 e 48 horas de infecção. Uma vez dominado, o método de aspiração orofaríngea de infecção pulmonar pode ser feito em apenas um a dois minutos por camundongo, se for executado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não usar um volume de aspiração excessivo. Um volume de 50 a 60 microlitros normalmente funciona bem para um camundongo de oito a 12 semanas de idade. Após este procedimento, uma variedade de métodos pode ser realizada no pulmão e nos tecidos periféricos para permitir a quantificação da resposta imune na eliminação do patógeno.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir pneumonia bacteriana experimental por meio da entrega de patógenos orofaríngeos e determinar a carga de patógenos em camundongos. Não se esqueça de que trabalhar com micróbios pode ser perigoso e que as precauções e práticas básicas do BSL-2 devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.