Name: Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Aprenda a purificar proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos usando resina Strep-Tactin reticulada com BS3. Este método oferece alta recuperação, pureza e compatibilidade com espectrometria de massa para análise.

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Agradecemos o apoio técnico da Sini Miettinen, Minna Pöllänen e Taru Rautavesi. Agradecemos Helka Nurkkala para fornecer HEK 293 células expressando twin-Strep-marcado GFP e Pekka Evijärvi para o fornecimento de equipamentos de gravação de som. Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia, conceder números 138329, 134684 e 258978.

1. Cross-linking de Strep-Tactin polimetacrilato Resina com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3) <ol><li> Equilibrar um microtubo selado contendo 2 mg de BS3 de reticulação à temperatura ambiente. CUIDADO: BS3 é uma substância perigosa. Usar luvas e óculos de proteção. </li><li> Resina de polimetacrilato Ressuspender Strep-Tactin (50% de suspensão em 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM; NaCl 150 mM) por breve agitação vigorosa e transferir imediatamente 600 uL da suspensão para uma coluna de centrifugação utilizando uma ponta de pipeta com a extremidade cortada. </li><li> Centrifugar a 1.500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar o fluxo e adicionar 450 ul de salina tamponada com fosfato (PBS) para a coluna. </li><li> Repetir o passo anterior mais 2 vezes para substituir completamente o tampão Tris com PBS e deixar a resina em 430 ul de PBS, ajustado a pH 8,0, após a última centrifugação. </li><li> Perfurar a folha do microtubo com BS3 com uma ponteira que contém 1001; l de água ultrapura. Dissolver o pó em água BS3 cuidado pipetando para cima e para baixo e imediatamente adicionar 20 mL da solução para a coluna de centrifugação. A concentração final de BS3 na reacção de ligação cruzada é de aproximadamente 1,2 mM. </li><li> Girar a coluna durante 30 minutos à temperatura ambiente. Verificar que a resina é misturada com a solução adequadamente BS3. </li><li> Para terminar a reacção, adiciona-se 6 mL de Tris-HCl 3 M, pH 7,5 e a coluna rodar durante mais 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a 1.500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar o fluxo e ressuspender a resina reticulada, em 450 ul de solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST). Repetir a centrifugação e passos de lavagem mais duas vezes. Na última etapa, ressuspender a resina em 450 ul de TBS. </li><li> Transferir a suspensão de resina, para um tubo novo utilizando uma ponta de pipeta com a extremidade cortada. Ressuspender a resina deixada na coluna com mais 450 mL de TBS e transferir para o mesmo tubo. Repita ªe último passo mais uma vez para assegurar a transferência máxima da resina a partir da coluna para o tubo. </li><li> Deixe o tubo de repousar durante 10 minutos à temperatura ambiente e ajustar o volume para 600 mL, removendo o excesso de TBS. A resina está pronta para utilização imediata (recomendado), ou pode ser armazenado a 4 ° C, sem congelação. </li></ol> 2. Ligação da proteína Bait Twin-Strep-marcados e Complexos Associated ao reticulado Strep-Tactin polimetacrilato Resina <ol><li> Centrifugar 1 ml da amostra de proteína isco em tampão de ligação a 17000 xg durante 10 min a 4 ° C e transferir o sobrenadante para um tubo fresco. </li><li> Para minimizar a ligação de proteínas biotiniladas endógenos para a resina de Strep-Tactin, adicionar avidina a uma concentração final de 100 ug / ml e rodar durante 15 min a 4 ° C. <ol><li> Se a resina reticulada do passo 1.10 foi armazenado durante um longo período de tempo, a 4 ° C, recolher a resina por centrifugação a 400 xg for 1 min a 4 ° C, deitar fora o sobrenadante e lava-se a resina com 1 ml de TBST. Repita a centrifugação e lavagem passos mais duas vezes, primeiro com TBST e, em seguida, com TBS. Centrifuga-se o tubo a 400 xg durante 1 min a 4 ° C e ajusta-se o volume original, removendo o excesso de TBS. </li></ol></li><li> Ressuspender a resina Strep-Tactin reticulado por vórtice. Imediatamente adicionar 50 ul da suspensão de resina para o tubo contendo a amostra de proteína isco utilizando uma ponta de pipeta de corte e rodar durante mais 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Enquanto espera, definido termomisturador a 55 ° C e pré-aquecer a 500 ul de tampão de eluição para o uso no passo 3.1. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e lava-se a resina sobre um rotador durante 5 min a 4 ° C com 1 ml de tampão de lavagem pré-refrigerada # 1. Repetir a centrifugação e passos de lavagem três vezes. Na última etapa, ressuspender a resina em 250 ul de tampão de lavagem # 2. </li><li> Tr<html> ansfer a suspensão de resina para uma coluna de rotação fresca. Ressuspender a resina remanescente no tubo em mais 250 ul de tampão de lavagem 2 e transferir a mesma coluna. </li><li> Centrifugar a 400 xg por 3 min a 4 ° C, descarte o flow-through e transferir a coluna para um golfinho-nariz 2 tubo fresco ml. Vá imediatamente para a etapa de eluição abaixo. </li></ol> 3. Eluição de complexos de proteínas específicas <ol><li> Adicionar 150 ul de tampão de eluição pré-aquecida do passo 2.4 para a coluna de centrifugação. </li><li> Incubar em termomisturador durante 5 min a 55 ° C, com agitação a 1400 rpm. </li><li> Centrifugar a 1.500 xg durante 1 min à temperatura ambiente. </li><li> Descartar a coluna e armazenar as proteínas alvo purificados a ≤ -20 ° C. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598"><tbody><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Salina tamponada com fosfato (PBS) </td></tr>0 &quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Na 2 HPO 4 </td><td style="width:299px;"> 10 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> KH 2 PO 4 </td><td style="width:299px;"> 2 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 137 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> KCl </td><td style="width:299px;"> 2,7 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> pH ajustado para 7,4, salvo indicação contrária (pH 8,0 na secção 1.4) </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Solução salina tamponada com Tris (TBS) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 7,4 </td><td style="width:299px;"> 50 mM </td></tr><tr height="20"><td hei<html> ght = estilo &quot;20&quot; = &quot;height: 20px; width: 299px;&quot;&gt; NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 7,4 </td><td style="width:299px;"> 50 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tween 20 </td><td style="width:299px;"> 0,1% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Tampão de ligação </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td>x; &quot;&gt; 550 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaF </td><td style="width:299px;"> 5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0,5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Glicerina </td><td style="width:299px;"> 10% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0,1 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Lave tampão # 1 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 500 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaF </<html> td&gt; <td style="width:299px;"> 5 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> EDTA </td><td style="width:299px;"> 0,4 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Igepal CA-630 </td><td style="width:299px;"> 0,2% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Glicerina </td><td style="width:299px;"> 5% (v / v) </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> PMSF </td><td style="width:299px;"> 0,1 mM </td></tr><tr height="20"><td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:597px;"> Lave tampão # 2 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> NaCl </td><td style="width:299px;"> 150 mM </td></tr><tr height="20">2 &quot;height =&quot; &quot;style =&quot; 20 height: 20px; width: 597px; &quot;&gt; tampão de eluição </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:299px;"> Tris-HCl, pH 8,0 </td><td style="width:299px;"> 25 mM </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:299px;"> SDS </td><td style="width:299px;"> 1% (w / v) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tampões utilizados no presente estudo.

<ol><li>Voss, S., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+a+flexible+loop+in+streptavidin+leads+to+higher+affinity+for+the+Strep-tag+II+peptide+and+improved+performance+in+recombinant+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification.</a> Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).</li>
<li>Schmidt, T. G., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Strep-tag+system+for+one-step+purification+and+high-affinity+detection+or+capturing+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).</li>
<li>Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+Strep-tag+purification+for+the+isolation+and+identification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells.</a> Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).</li>
<li>Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP70+and+its+cochaperone+CPIP+promote+potyvirus+infection+in+Nicotiana+benthamiana+by+regulating+viral+coat+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions.</a> Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).</li>
<li>Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+histone+modifications+in+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of histone modifications in plant leaves.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+protein+purification+from+plant+material+using+the+eight-amino+acid+StrepII+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope.</a> Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).</li>
<li>Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+biochemical+characterization%2C+and+subcellular+localization+of+allantoate+amidohydrolases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean.</a> Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).</li>
<li>Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+from+an+affinity+column%3A+an+encounter+with+a+new+villain+in+the+world+of+membrane-protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization.</a> Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).</li>
<li>Hendrickson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+core+streptavidin+determined+from+multiwavelength+anomalous+diffraction+of+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).</li>
<li>Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+surface+hydrophobic+stripe+in+the+coiled-coil+domain+of+type+I+keratins+mediates+tetramer+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability.</a> J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).</li>
<li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+von+Willebrand+factor+studied+using+small+angle+neutron+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering.</a> J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5 (9), (2010).</li>
<li>Wang, W., Barger, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+quaternary+structure+and+cysteine+residues+in+the+activity+of+human+serine+racemase%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase.</a> BMC Biochem. 12, 63(2011).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+cross-linking+and+target+elution+protocols+used+for+immunoprecipitation+significantly+modulate+signal-to+noise+ratio+in+downstream+2D-PAGE+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis.</a> Proteome Sci. 9, 45(2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo acima pode ser utilizado para purificar qualquer proteína isco duplo-Strep-tag de interesse e os seus complexos associados em qualquer tampão adequado, que não contém biotina ou desnaturantes fortes. Na versão atual do protocolo, obrigatório e lavagem são realizadas em condições relativamente severas na presença de alto teor de sal e detergente não-iônico. Embora isto resulta em menos fundo, complexos de proteína frágeis podem dissociar sob estas condições. Para preservar os complexos de afinidade inferior, ...

Nos últimos anos, a tecnologia Strep-tag tornou-se amplamente utilizado em muitas áreas de pesquisa biomédica, incluindo proteômica e biologia estrutural. Esta tecnologia de purificação de proteínas, o qual baseia-se na fusão de proteínas recombinantes a um péptido curto Strep-tag, amadureceu com o advento de matrizes de afinidade que transportam Strep-Tactin, uma variante geneticamente modificada de estreptavidina com uma melhor capacidade de ligação de péptidos 1, 2. As proteínas de fusão contendo duas cópias do Strep-tag II, designados-Strep-tag ou twin-tag SIII, exibem uma maior afinidade para matrizes Strep-Tactin do que aqueles que contêm apenas uma tag Strep único, garantindo a purificação mais eficiente das proteínas recombinantes e seus parceiros de ligação associados. No entanto, a maior afinidade de proteínas twin-Strep-tag para Strep-Tactin também tem seu lado negativo. Eluição competitiva de tais proteínas, com o excesso de biotina pode ser incompleta, levando à produção de proteína alvo diminui. Um mminério eficiente alternativa é a eluição com SDS, mas conduz a uma contaminação indesejada da amostra com Strep-Tactin libertado da resina, tornando o ensaio de incompatibilidade com a análise de proteoma. Este documento apresenta uma técnica para superar esta limitação, o primeiro estabilizador tetrâmero acoplado à resina de Strep-Tactin por reticulação química e, em seguida, utilizando SDS para eluir proteínas de duplo Strep-tag e os seus complexos associados a partir da resina com ligações cruzadas resultante. Assim, o rendimento de proteína suficiente pode ser conseguida sem a contaminação da amostra com Strep-Tactin, permitindo, assim, ainda mais a análise por espectrometria de massa. O método é adequado para a purificação de qualquer proteína de fusão recombinante com uma etiqueta de SIII exposto à superfície ou 3-Strep-tag duplo (WSHPQFEK sequência de aminoácidos (GGGS) 3 WSHPQFEK SAWSHPQFEK e (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectivamente). A proteína pode ser de origem animal, vegetal ou de origem bacteriana e pode ser isolado a partir de qualquer célula totaislisado ou fracção enriquecida organelo. Como exemplo, descrevemos aqui a purificação de uma proteína marcada com SIII VPg-Pro de batata vírus A (PVA) 4 a partir da fracção nuclear de PVA-infectadas de plantas de Nicotiana benthamiana. A fracção nuclear foi isolado como descrito anteriormente 5, com as seguintes modificações: As células não foram tratadas com o formaldeído, o butirato de sódio foi substituído em todos os tampões, com fluoreto de sódio 5 mM, inibidor de protease completo foi substituído com PMSF, Triton X-100 a concentração na extracção tampão # 2 foi reduzido para 0,3% (v / v) e o sedimento nuclear obtida por centrifugação através de almofada de sacarose (tampão de extracção # 3) foi novamente suspenso em 1,45 ml de tampão de ligação pré-refrigerado e rodado durante 1,5 horas a 4 ° C. O extrato nuclear resultante contendo a proteína isca SIII-marcados e complexos associados (amostra proteína isca) foi processado de acordo com o protocolo descrito a seguir (ver secção 2).

<table><tbody><tr><td>Suberato de bis(sulfosuccinimidil) (BS3), formato sem pesagem, 8 x 2 mg</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>21585</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com CUIDADO: Substância perigosa. Causa irritação respiratória, cutânea e ocular grave. Use luvas de proteção e proteção para os olhos.</a></td></tr><tr><td>Resina Strep-Tactin MacroPrep (50% de suspensão)</td><td>IBA</td><td>2-1505</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr><tr><td>Filtro de tubo de centrífuga Spin-X, membrana de acetato de celulose, tamanho dos poros 0,45 &mu; m, não estéril</td><td>Costar (Corning)</td><td>8163</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Tubos nariz de golfinho</td><td>Costar (Corning)</td><td>3213</td><td><a href="http://www.corning.com/lifesciences/">www.corning.com/lifesciences/</a></td></tr><tr><td>Avidin&nbsp;</td><td>IBA</td><td>2-0204</td><td><a href="http://www.iba-lifesciences.com/">www.iba-lifesciences.com</a></td></tr></tbody></table>

um passo de purificação de proteínas twin-strep-tag e seus complexos de strep-tactin resina reticulado com bis (sulfossuccinimidilo) suberato (bs3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

A purificação por afinidade das proteínas de fusão marcadas com Strep-resinas que transportam um estreptavidina engenharia (Strep-Tactin) tornou-se um método utilizado para o isolamento de complexos de proteínas sob condições fisiológicas. As proteínas de fusão que contêm duas cópias de Strep-tag II, designadas-Strep-tag ou duplo SIII-tag, têm a vantagem de uma maior afinidade para o Strep-Tactin em comparação com aquelas que contêm apenas um Strep-tag único, permitindo assim a purificação da proteína mais eficiente. No entanto, esta vantagem é compensada pelo fato de que a eluição de proteínas twin-Strep-marcadas com biotina pode ser incompleta, levando a baixa recuperação de proteína. A recuperação pode ser drasticamente melhorada utilizando desnaturação eluição com dodecil-sulfato de sódio (SDS), mas isto conduz a amostra de contaminação com Strep-Tactin libertado da resina, tornando o ensaio de incompatibilidade com a análise de proteómica jusante. Para superar esta limitação, temos desenvolvido um método pelo qual tetrâmero acoplados à resina de Strep-Tactiné estabilizada pela primeira vez por reticulação covalente com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3), e a resina com ligações cruzadas resultante é, então, utilizada para purificar complexos de proteínas-alvo em um único passo de purificação por lotes. Eluição eficiente com SDS garante uma boa recuperação de proteína, enquanto a ausência de contaminação Strep-Tactin permite a análise de proteínas downstream por espectrometria de massa. Como prova do conceito, aqui descrita de um protocolo para a purificação de proteínas virais SIII marcado com VPg-Pro a partir de núcleos de N. infectadas com vírus benthamiana plantas utilizando a resina de polimetacrilato Strep-Tactin reticulados com BS3. O mesmo protocolo pode ser utilizado para purificar qualquer proteína duplo-Strep-tag de interesse e caracterizar os seus parceiros de ligação fisiológicas.

O procedimento de purificação está esquematicamente ilustrada na Figura 1, juntamente com uma representação de problemas associados com outros métodos de purificação existentes. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/51536/51536fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1. Representação esquemática do procedimento de purificação. O fluxo de trabalho inclui a estabilização da Strep-Tactin tet...

É descrito um método para a purificação eficiente de proteínas de fusão duplo-Strep-marcados e os seus complexos específicos de estreptavidina modificada (Strep-Tactin) resina covalentemente reticulado com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). O método tem as vantagens de alta velocidade, uma boa recuperação da proteína alvo e de elevada pureza, e é compatível com a análise subsequente por espectrometria de massa.

Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Olá, sou Christina McKennan da Universidade de Helsinque, Finlândia. Um dos desafios na caracterização de um complexo proteico específico é determinar sua composição molecular. Isso exige o desenvolvimento de métodos para isolar e purificar o complexo a partir de seu ambiente celular.A área de pesquisa em microrganismos é a interação entre vírus de plantas e hospedeiros, e, portanto, estamos interessados nos diversos complexos de proteínas nucleares virais formados durante a infecção. No passado, estudamos com sucesso esses complexos utilizando purificação baseada em afinidade por coluna em nosso laboratório. A coluna twin strep mostrou-se uma das melhores colunas.No entanto, observamos certas limitações em seu uso, sendo uma delas o baixo rendimento, e por isso desejamos aperfeiçoar este método. Olá, meu nome é Mata e eu irei guiá-lo pelo protocolo experimental. Mas primeiro, permita-me apresentar uma visão geral do método.Utilizamos perlas de preparação macro tachin strep para purificar complexos específicos entre proteínas duplamente marcadas com strep tag e seus parceiros de ligação fisiológicos. O tetramero marcado com strep tag é mostrado em verde, a proteína duplamente marca

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Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos uma nova técnica proteômica quantitativa para a identificação de complexos de proteína em Saccharomyces cerevisiae. Neste estudo, nós utilizamos o método SILAC juntamente com purificação de afinidade seguido por espectrometria de massa para identificar com alta especificidade dos parceiros de ligação de uma proteína ER, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Um romance e altamente eficiente em duas etapas cromatografia de afinidade protocolo foi desenvolvido e é descrita em detalhes. O método é baseado em uma tag de purificação com duas pequenas afinidades inerentes e é aplicável a uma grande variedade de proteínas-alvo com propriedades diferentes.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a...

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Fonte: Murata, T., et al. Purificação de uma proteína de alta massa molecular em Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para a purificação de uma proteína marcada com poli-histidina secretada por Streptococcus mutans.

Um procedimento para a purificação de uma proteína marcada com poli-histidina de Streptococcus mutans

Este vídeo demonstra a purificação de afinidade em tandem - uma técnica para purificar complexos de proteínas de células eucarióticas para estudar a interação proteína-proteína. O complexo contém duas proteínas marcadas com diferentes tags de epítopos. Após a purificação do complexo usando duas resinas com afinidade pelas duas marcas diferentes de maneira sequencial, a presença de ambas as proteínas no eluidor confirma a interação entre as duas.

Ensaio de purificação de afinidade em tandem para estudar interações proteína-proteína

O método Tandem Affinity Purification (TAP) tem sido amplamente utilizado para isolar complexos nativos de extrato celular, principalmente eucariótico, para proteômica. Aqui, apresentamos um protocolo do método TAP otimizado para purificação de complexos nativos para estudos estruturais.

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Descrito aqui é um método simples para a purificação de um produto genético em Streptococcus mutans. Esta técnica pode ser vantajosa na purificação de proteínas, especialmente proteínas de membrana e proteínas de massa molecular elevada, podendo ser utilizada com várias outras espécies bacterianas.

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

A reconstituição in vitro de proteínas citoesqueléticas é uma ferramenta vital para entender as propriedades funcionais básicas dessas proteínas. O presente trabalho descreve um protocolo para purificar e avaliar a qualidade de complexos de septina recombinante, que desempenham um papel central na divisão e migração celular.

Purificação e Controle de Qualidade de Complexos de Septina Recombinante para Reconstituição Livre de Células

Aprenda a purificar proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos usando resina Strep-Tactin reticulada com BS3. Este método oferece alta recuperação, pureza e compatibilidade com espectrometria de massa para análise.

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Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

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