Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

Olá, sou Christina McKennan da Universidade de Helsinque, Finlândia. Um dos desafios na caracterização de um complexo proteico específico é determinar sua composição molecular. Isso exige o desenvolvimento de métodos para isolar e purificar o complexo a partir de seu ambiente celular.

A área de pesquisa em microrganismos é a interação entre vírus de plantas e hospedeiros, e, portanto, estamos interessados nos diversos complexos de proteínas nucleares virais formados durante a infecção. No passado, estudamos com sucesso esses complexos utilizando purificação baseada em afinidade por coluna em nosso laboratório. A coluna twin strep mostrou-se uma das melhores colunas.

No entanto, observamos certas limitações em seu uso, sendo uma delas o baixo rendimento, e por isso desejamos aperfeiçoar este método. Olá, meu nome é Mata e eu irei guiá-lo pelo protocolo experimental. Mas primeiro, permita-me apresentar uma visão geral do método.

Utilizamos perlas de preparação macro tachin strep para purificar complexos específicos entre proteínas duplamente marcadas com strep tag e seus parceiros de ligação fisiológicos. O tetramero marcado com strep tag é mostrado em verde, a proteína duplamente marcada com strep tag em azul, seu parceiro de ligação em laranja e duas cópias da strep tag em vermelho.

As proteínas não ligadas, representadas como estruturas em forma de grade, são removidas por lavagem na abordagem canônica. Os complexos ligados são eluídos de forma competitiva com biotina, mostrada em rosa. No entanto, ao utilizar esta abordagem, observamos uma eluição incompleta dos complexos ligados, com apenas uma fração se destacando com sucesso das microesferas de estreptactina.

Isso resulta em baixa recuperação da proteína alvo. A recuperação da proteína alvo pode ser melhorada usando eluição desnaturante com S-D-S-S-D-S, o que complica qualquer análise adicional. Células perdidas são formadas ao redor da proteína isca desnaturada com a etiqueta twin strep ttag.

Seu parceiro de ligação e ao redor dos monômeros dissociados da estreptactina. A contaminação resultante da amostra com estreptactina liberada é inaceitável se a amostra precisar ser posteriormente analisada por espectrometria de massa. Para superar o problema de contaminação da amostra, desenvolvemos um método no qual o tetrâmero de estreptactina é primeiro estabilizado por reticulação química.

A resina reticulada resultante é usada para purificar a proteína isca e seu parceiro de ligação; a eluição da amostra com SDS garante alta recuperação proteica, enquanto a reticulação química da resina assegura a eluição da proteína isca marcada com strept e seu parceiro de ligação, na ausência de contaminação da amostra com strept liberada. Equilibre um tubo microselado contendo dois miligramas do reticulador BS três à temperatura ambiente.

Prepare uma ponta de pipeta para a transferência da resina cortando a extremidade da ponta para reus ressuspender a resina strep tact e macro prep com agitação breve e vigorosa e, em seguida, transfira imediatamente 600 microlitros da suspensão para uma coluna de filtro CoStar SpinX. Centrifugue a 4.000 RPM durante 30 segundos. Adicione 450 microlitros de solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente. O objetivo desta etapa é substituir a triss de amina primária por fosfato não reativo.

Descarte o fluxo inicial. Misture o conteúdo invertendo o tubo várias vezes. Repita as etapas de centrifugação e lavagem duas vezes e deixe a resina em 430 microlitros de P-B-S-P-H oito.

Após a última centrifugação, perfure a folha de alumínio do microtubo no way com a ponteira de uma pipeta contendo 100 microlitros de água milli Q. Dissolva o pó de BS three na água pipetando suavemente para cima e para baixo. Assim que o BS three estiver completamente dissolvido, adicione imediatamente 20 microlitros da solução à coluna spin X. Certifique-se de que os conteúdos sejam misturados adequadamente.

Rotacione a coluna por 30 minutos à temperatura ambiente, certificando-se de que a resina esteja adequadamente misturada com a solução BS três. Para encerrar a reação, adicione seis microlitros de triss 3 molar ajustado a pH 7,5 com ácido clorídrico. Rotacione a coluna por mais 15 minutos à temperatura ambiente e centrifugue a 4.000 RPM por 30 segundos.

À temperatura ambiente, reús, suspenda a resina reticulada em 450 microlitros de solução salina tamponada com tris contendo tween 20 e descarte o fluxo passante. Repita as etapas de centrifugação e lavagem mais duas vezes. Na última etapa, suspenda a resina em 450 microlitros de TBS. Transfira a suspensão de resina para um tubo novo, suspenda a resina remanescente na coluna com outros 450 microlitros de TBS e transfira para o mesmo tubo.

Repita o último passo mais uma vez para garantir a transferência máxima da resina da coluna para o tubo. Deixe o tubo com a suspensão da resina repousar por 10 minutos à temperatura ambiente e ajuste o volume para 600 microlitros. Ao remover o excesso de TBS, a resina estará pronta para uso imediato ou pode ser armazenada a quatro graus Celsius sem congelamento.

Este método é adequado para a purificação de qualquer proteína de fusão com dupla marcação Strep e seus complexos associados. A proteína pode ser de origem animal, vegetal ou bacteriana e pode ser isolada tanto de lisado celular total quanto de fração organolar enriquecida. Neste exemplo, isolamos uma proteína com dupla marcação Strep, a VPG Pro do vírus do mosaico A da batateira, a partir da fração nuclear de plantas infectadas, iniciando com a centrifugação de um mililitro da amostra da proteína isca em tampão de ligação a 13.000 RPM durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Transfira o sobrenadante para um tubo novo para minimizar a ligação de proteínas biotiniladas endógenas ao strep tact e à resina. Adicione avadon a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro, certificando-se de que o conteúdo seja completamente misturado. Incube em rotação durante 15 minutos a quatro graus Celsius.

Resuspenda a resina reticulada por vortex e, utilizando uma ponteira cônica, adicione imediatamente 50 microlitros da suspensão de resina ao tubo contendo a amostra da proteína isca. Incube em rotação por mais 30 minutos a quatro graus Celsius enquanto aguarda. Ajuste o misturador térmico para 55 graus Celsius e pré-aqueça 500 microlitros do tampão de eluição para uso na etapa de eluição. Centrifugue a 2000 RPM por um minuto a quatro graus Celsius.

Descarte o sobrenadante e lave a resina com um mililitro de tampão de lavagem previamente resfriado. Primeiro, gire por cinco minutos a quatro graus Celsius. Repita as etapas de centrifugação e lavagem três vezes na última etapa.

Resuspenda a resina em 250 microlitros do tampão de lavagem número dois e transfira a suspensão de resina para uma nova coluna spinx. Resuspenda a resina remanescente no tubo em outros 250 microlitros do tampão de lavagem número dois e transfira para a mesma coluna. Centrifugue a 2000 RPM durante três minutos a quatro graus Celsius. Transfira a coluna para um tubo fresh dolphin nose de dois mililitros e descarte o fluxo passante.

Prossiga imediatamente para o próximo passo de eluição. Adicione 150 microlitros de tampão de eluição pré-aquecido à coluna spinx. Incube a solução no misturador térmico por cinco minutos a 55 graus Celsius, agitando a 1400 RPM, centrifugue a 4.000 RPM por um minuto à temperatura ambiente e descarte a coluna.

As proteínas-alvo purificadas estão agora prontas para análises adicionais e podem ser armazenadas abaixo de menos 20 graus Celsius. A imagem demonstra que a eluição de proteínas a partir da resina strept actin macro prep com biotina é incompleta em comparação com a eluição com SDS. A diferença nas intensidades dos sinais no western blot reflete os diferentes rendimentos proteicos obtidos com as duas técnicas de eluição. Embora a eluição com SDS seja muito mais eficiente do que a eluição com biotina, ela resulta na contaminação da amostra com strept actin liberada.

A imagem mostra o gel da coloração com prata de EITs de SDS a partir da resina Strept actin Macro prep. Observe a presença de strept actin liberada na fita esquerda, mas sua ausência na fita direita. A amostra da esquerda foi eluída da resina não reticulada e a amostra da direita, da resina reticulada com BS três. Com base nesses resultados, concluímos que a reticulação com BS três impede a liberação de strept actin da resina durante a eluição com SDS.

Neste exemplo, utilizamos resina Strept actin macro prep reticulada com BS three para purificar a proteína isca VPG PRO e seus parceiros de ligação. Uma alíquota da amostra purificada foi submetida à análise por espectrometria de massas para identificação proteica. A ausência de uma banda específica no controle negativo confirma a especificidade do pull down.

A banda inferior corresponde à proteína isca VPG PRO e a banda superior ao seu parceiro de ligação NIB réplica identificado por espectrometria de massas. Olá, acabamos de mostrar como o cruzamento químico pode ser usado para superar as limitações associadas à Dena e ilusão da resina strep tact. Além da purificação de complexos proteína-proteína, o método também pode ser usado para purificar complexos proteicos com ácidos nucleicos, incluindo aqueles revertidos por cruzamento com formaldeído.

Por fim, o método pode ser utilizado para purificar proteínas de membrana com marcação strep tag. Solubilizadas com detergentes. Detergentes são necessários para manter essas proteínas hidrofóbicas em solução.

No entanto, sua presença pode levar à contaminação da amostra com liberação de strep tane. Mesmo quando se utiliza uma evolução branda de biotina, acreditamos que a reticulação da resina pode fornecer uma solução para o problema de contaminação da amostra. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos. Ok.