Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

É descrito um método para a purificação eficiente de proteínas de fusão duplo-Strep-marcados e os seus complexos específicos de estreptavidina modificada (Strep-Tactin) resina covalentemente reticulado com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). O método tem as vantagens de alta velocidade, uma boa recuperação da proteína alvo e de elevada pureza, e é compatível com a análise subsequente por espectrometria de massa.

Olá, sou Christina McKennan, da Universidade de Helsinque, Finlândia. Um dos desafios na caracterização de um determinado complexo proteico é determinar sua composição molecular. Isso requer o desenvolvimento de métodos para isolar e purificar o complexo de seu ambiente celular.

A área de pesquisa em micróbios são as interações entre vírus de plantas e hospedeiros e, portanto, estamos interessados nos vários complexos de proteínas nucleares de ripon viral formados durante a infecção. No passado, estudamos com sucesso esses complexos usando purificação baseada em dutos de afinidade em nossas mãos. O ducto estreptocócico duplo provou ser um dos melhores patos.

No entanto, observamos algumas limitações em seu uso, sendo uma delas o baixo rendimento e, portanto, queríamos melhorar esse método. Olá, meu nome é Mata e vou guiá-lo através do protocolo experimental. Mas primeiro, deixe-me dar uma visão geral do método.

Empregamos grânulos de preparação de macro strep tachin para purificar complexos específicos entre proteínas marcadas com strept gêmeo e seus parceiros de ligação fisiológica. Strep strept marcado e tetrâmero é mostrado em verde proteína marcada com estreptococo gêmeo Em azul, seu parceiro de ligação em laranja e duas cópias da marca estreptocócica. Em vermelho.

As proteínas não ligadas descritas como medos da graça são removidas pela lavagem na abordagem canônica. Os complexos ligados são aludidos competitivamente com a biotina mostrada em rosa. No entanto, ao usar essa abordagem, observamos eluição incompleta de complexos ligados com apenas uma fração se desprendendo com sucesso dos grânulos de taquina estreptocócica.

Isso resulta em baixa recuperação de proteínas-alvo. Para complicar qualquer análise posterior, a recuperação da proteína-alvo pode ser melhorada usando eluição desnaturante com S-D-S-S-D-S. As células Miss são formadas em torno da proteína de isca de ttag estreptocócica gêmea desnaturada.

Seu parceiro de ligação e em torno dos monômeros dissociados da actina strept. A contaminação da amostra resultante com actina de estrepto liberada é inaceitável se a amostra precisar ser analisada por espectrometria de massa. Para superar o problema de contaminação da amostra, desenvolvemos um método pelo qual o tetrâmero de taquina estreptocócica é primeiro estabilizado por reticulação química.

A resina reticulada resultante é usada para purificar a proteína da isca e sua eluição de amostra parceira de ligação com SDS garante alta recuperação de proteína, enquanto a reticulação química da resina garante a eluição da proteína de isca marcada com strept e sua ligação. Parceiro na ausência de contaminação da amostra com strept liberado equilibra um selado de jeito nenhum. Microtubo contendo dois miligramas de BS três reticuladores à temperatura ambiente.

Prepare uma ponta de pipeta para transferência de resina cortando a extremidade da ponteira reussuspender, tato estreptocócico e resina de preparação macro por agitação breve e vigorosa e transfira imediatamente 600 microlitros da suspensão para uma centrífuga de coluna de filtro spinx CoStar a 4.000 RPM por 30 segundos. À temperatura ambiente, adicione 450 microlitros de solução salina tamponada com fosfato. O objetivo desta etapa é substituir o triss médio primário por fosfato não reativo.

Descarte o fluxo. Misture o conteúdo virando o tubo várias vezes. Repita as etapas de centrifugação e lavagem duas vezes e deixe a resina em 430 microlitros de P-B-S-P-H oito.

Após a última centrifugação, perfure a folha do microtubo de forma alguma com uma ponta de pipeta contendo 100 microlitros de mili Q.Water dissolver o pó BS três em água pipetando suavemente para cima e para baixo. Assim que o BS três estiver completamente dissolvido, adicione imediatamente 20 microlitros da solução à coluna de spin X. Certifique-se de que o conteúdo esteja misturado corretamente.

Gire a coluna por 30 minutos à temperatura ambiente, certificando-se de que a resina esteja bem misturada com a solução BS três. Para extinguir a reação, adicione seis microlitros de três triss molares ajustados para pH 7,5 com ácido clorídrico. Gire a coluna por mais 15 minutos em centrifugação à temperatura ambiente a 4.000 RPM por 30 segundos.

À temperatura ambiente reus, suspender a resina reticulada em 450 microlitros de solução salina tamponada com tris com tween 20 e descartar o fluxo. Repita as etapas de centrifugação e lavagem mais duas vezes Na última etapa, ressuspenda a resina em 450 microlitros de TBS. Transfira a suspensão de resina para um tubo novo, ressuspenda a resina deixada na coluna com mais 450 microlitros de TBS e transfira para o mesmo tubo.

Repita a última etapa mais uma vez para garantir a transferência máxima da resina da coluna para o tubo. Deixe o tubo com a suspensão de resina repousar por 10 minutos em temperatura ambiente e ajuste o volume para 600 microlitros. Ao remover o excesso de TBS, a resina está pronta para uso imediato ou pode ser armazenada a quatro graus Celsius sem congelar.

Este método é adequado para a purificação de qualquer proteína de fusão marcada com estreptococos gêmeos e seus complexos associados. A proteína pode ser de origem animal, vegetal ou bacteriana e pode ser isolada do lisado celular total ou da fração orgânica enriquecida. Neste exemplo, isolamos uma proteína de marca estreptocócica dupla VPG Pro do vírus da batata A da fração nuclear de plantas infectadas pelo vírus, começando centrifugando um mililitro da amostra de proteína de isca em tampão de ligação a 13.000 RPM por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Transfira o sobrenadante para um tubo novo para minimizar a ligação de proteínas biotiniladas endógenas ao tato estreptocócico e à resina. Adicionar avadon a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro, certificando-se de que o conteúdo está bem misturado. Gire por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Ressuspenda a resina reticulada por vórtice e, usando uma ponta de pipeta de xícara, adicione imediatamente 50 microlitros da suspensão de resina ao tubo que contém a amostra de proteína da isca. Gire por mais 30 minutos a quatro graus Celsius enquanto espera. Defina o misturador térmico para 55 graus Celsius e pré-aqueça 500 microlitros de tampão Elu para uso na centrífuga de passo elúcio a 2000 RPM por um minuto a quatro graus Celsius.

Descarte o sobrenadante e lave a resina com um mililitro de tampão de lavagem pré-resfriado. Número um, gire por cinco minutos a quatro graus Celsius. Repita as etapas de centrifugação e lavagem três vezes na última etapa.

Ressuspenda a resina em 250 microlitros de tampão de lavagem número dois e transfira a suspensão de resina para uma nova coluna spinx. Ressuspenda a resina restante no tubo em mais 250 microlitros de tampão de lavagem número dois e transfira para a mesma centrífuga de coluna a 2000 RPM por três minutos a quatro graus Celsius. Transfira a coluna para um tubo fresco de dois mililitros e descarte o fluxo.

Prossiga imediatamente para a próxima etapa eluciana. Adicione 150 microlitros de tampão de eluição pré-aquecido à coluna spinx. Incube a solução no misturador térmico por cinco minutos a 55 graus Celsius, agitando a 1400 RPM centrífuga a 4.000 RPM por um minuto em temperatura ambiente E descarte a coluna.

As proteínas-alvo purificadas estão agora prontas para análise posterior e podem ser armazenadas abaixo de menos 20 graus Celsius, pois a imagem demonstra que a eluição de proteínas da resina de macro-preparação de actina com biotina é incompleta em comparação com a eluição com SDS. A diferença nas intensidades de sinal de western blot reflete diferentes rendimentos de proteínas obtidos com as duas técnicas elucianas. Embora o eluciano com SDS seja muito mais eficiente do que o eluciano com biotina, ele leva à contaminação da amostra com actina estrepta liberada.

A imagem mostra o gel de coloração de prata dos SDS EITs da nota de resina de preparação Strept actin Macro, a presença de strept actin liberada na faixa esquerda, mas sua ausência na faixa direita. A amostra à esquerda foi aludida da resina não reticulada e a amostra à direita da resina reticulada com BS três. Com base nesses resultados, concluímos que a reticulação com BS três impede a liberação de actina estrepta da resina durante a eluição de SDS.

Neste exemplo, usamos resina de preparação de macro actina Strept reticulada com BS três para purificar a proteína de isca VPG PRO e seus parceiros de ligação. Uma alíquota da amostra purificada foi submetida à análise de espectrometria de massa para identificação de proteínas. A ausência de uma banda específica no controlo negativo confirma a especificidade do puxão para baixo.

A banda inferior corresponde à proteína isca VPG PRO e a banda superior ao seu parceiro de ligação NIB replicado identificado por espectrometria de massa. Olá, acabamos de mostrar como a reticulação química pode ser usada para superar as limitações associadas à Dena e à ilusão do tato estreptocócico na resina. Além da purificação de complexos proteína-proteína, o método também pode ser usado para purificar complexos proteicos com ácidos nucléicos, incluindo aqueles reticulados com formaldeído.

Finalmente, o método pode ser usado para purificar proteínas de membrana de tecnologia estreptocócica. Solubilizado com detergentes. Detergentes são necessários para manter essas proteínas hidrofóbicas em solução.

No entanto, sua presença pode levar à contaminação da amostra com estreptococos de liberação. Mesmo quando a evolução suave da biotina é usada, achamos que a reticulação da resina pode fornecer uma solução para o problema de contaminação da amostra. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos. Okey.