Descobrindo Interações proteína e caracterização da função das proteínas Usando HaloTag Tecnologia

O objetivo geral deste procedimento é isolar eficientemente complexos de proteínas de células de mamíferos. Isso é feito primeiro seccionando as células com uma construção de fusão de halo para expressar a proteína de interesse. O segundo passo é cortar as células e capturar covalentemente os complexos de proteínas na resina via etiqueta de halo.

Em seguida, os complexos de proteínas na resina são lavados suavemente para remover quaisquer interações não específicas. A etapa final é eluir os complexos de proteínas da resina. Em última análise, os pulldowns de etiquetas de halo são usados para isolar e descobrir novas interações proteicas de sistemas de mamíferos.

Os métodos que demonstraremos aqui hoje podem permitir descobertas importantes na área de proteômica funcional, incluindo a identificação de novas interações proteicas e a determinação da localização de proteínas dentro das células. Realizando esses procedimentos hoje estão dois de nossos cientistas seniores, Jackie Mendez e Alen Beek. Primeiro, para cada fusão ou controle, prepare um prato de 15 centímetros com 30 mililitros de células em três a quatro vezes 10 elevado à quinta células por mililitro, ou uma a 1,2 vezes 10 elevado ao total de sete células por construção.

Incube as células por 18 a 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Após a incubação, transfecte a construção com o reagente de transfecção desejado. Após 24 a 48 horas, após a transfecção, remova o meio e lave suavemente a camada celular com 20 a 25 mililitros de PBS gelado, remova a lavagem com PBS e adicione 25 a 30 mililitros de PBS resfriado a quatro graus Celsius.

Em seguida, raspe suavemente as células do prato com um raspador de células. Uma vez que as células tenham sido coletadas em tubos cônicos, centrifugue as amostras por cinco a 10 minutos a 2000 vezes G e quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, colocar os grânulos celulares a 80 graus Celsius negativos por um mínimo de 30 minutos ou um máximo de seis meses.

Para cada amostra de fusão ou controle, prepare 18 mililitros de tampão de lavagem de equilíbrio de resina. Misture suavemente a resina invertendo o frasco para obter uma suspensão uniforme. Para cada experimento de puxar para baixo, dispense 200 microlitros de resina em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Centrifugue a amostra por um minuto a 800 vezes G. Após a centrifugação. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a resina no fundo do tubo. Uma vez descartado o sobrenadante, adicione 800 microlitros de tampão de lavagem de equilíbrio de resina à amostra e misture bem invertendo o tubo várias vezes. Depois.

Centrifugando a amostra por dois minutos a 800 vezes. G. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Repita as etapas anteriores mais duas vezes para um total de três lavagens.

Após descongelar os pellets celulares resus, suspenda-os em 300 microlitros de lise de mamíferos previamente preparados. Tamponamento pipetando para cima e para baixo. Em seguida, transfira para um novo tubo de microcentrífuga e adicione seis microlitros de 50 x coquetel inibidor de protease.

Em seguida, adicione três microlitros de DNAs RQ one e inverta a amostra por 10 minutos. À temperatura ambiente, as células passam a amostra cinco a 10 vezes através de uma agulha de seringa de calibre 25 ou 27. Uma vez centrifugada a 14 000 vezes, G durante cinco minutos a quatro graus Celsius, transferir o lisado límpido para um novo tubo e colocá-lo sobre gelo.

Em seguida, adicione mais 700 microlitros de um tampão XTBS previamente preparado ao lisado transparente e misture bem pipetando para cima e para baixo. Remova as lavagens finais dos tubos de resina equilibrada previamente preparados sem mexer na resina no fundo de cada tubo. Em seguida, adicione um mililitro do lisado diluído a cada tubo.

Incube as amostras com mistura em um rotador de tubo por 15 minutos a 22 graus Celsius. Após esta centrífuga, os tubos de resina por dois minutos a 800 vezes G.Depois de descartar o sobrenadante, adicione um mililitro de tampão de lavagem de equilíbrio de resina e misture bem invertendo cada tubo de resina manualmente várias vezes após a centrifugação dos tubos de resina por dois minutos a 800 vezes. G. Descarte as lavagens depois que as etapas anteriores e de lavagem forem repetidas três vezes.

Adicione um mililitro de tampão de lavagem de equilíbrio de resina aos tubos após incubar as amostras a 22 graus Celsius por cinco minutos com rotação constante, centrifugue os tubos de resina por dois minutos a 800 vezes G e descarte as lavagens. Neste ponto, a resina de cada amostra é suspensa em 50 microlitros de tampão de eluição SDS. Agite os tubos à temperatura ambiente com um agitador automático de tubos de microcentrífuga por 30 minutos.

Após centrifugação por dois minutos a 800 vezes G.Transfira os EITs para tubos novos para análise Para western blot ou gel de coloração de prata, carregue de cinco a 10 microlitros das amostras em um gel desnaturante SDS para espectrometria de massa. Armazene 40 microlitros de cada amostra a menos 20 graus Celsius para análise futura. Em uma lamínula de oito poços para cada proteína de fusão ou placa de controle, 400 microlitros de células HELOC em seu meio apropriado em cada poço a uma densidade de uma a duas vezes 10 elevado a quinta células por mililitro.

Depois de incubar as células por 18 a 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de CO2, transfectá-las com o reagente de transfecção desejado após 18 a 24 horas, diluir o ligante TMR pós-transfecção de um a 200 no meio celular apropriado. Em seguida, adicione 100 microlitros desta solução a cada poço e misture delicadamente. Em seguida, incube as células transfectadas contendo o ligante por 15 minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Quando terminar, aspire o meio contendo o ligante e substitua-o por 500 microlitros do meio apropriado sem ligante de etiqueta de fusão de proteína, que foi pré-avisado para 37 graus Celsius. Uma vez que a etapa anterior tenha sido repetida duas vezes para um total de três lavagens. Coloque as células de volta na incubadora por 30 minutos.

Após a incubação de 30 minutos, aspire o meio e substitua por 500 microlitros de meio apropriado, que foi pré-aquecido a 37 graus Celsius. Após esta imagem, as células em um microscópio usando os parâmetros de aquisição apropriados usando o protocolo halo, BRD quatro e expressão de controle de tag halo são observadas. A expressão da proteína de fusão também pode ser detectada usando Western blots com anticorpos anti-marca halo ou anticorpos para a proteína isca.

Géis de coloração de prata de réplicas biológicas de Halo BRD quatro e pulldowns de controle demonstram alta reprodutibilidade e mostram proteínas que interagem com a proteína BRD quatro. A alta abundância de componentes de PTF B, CDK nove e ciclina T, bem como a proteína BRD nove, confirma a captura específica de complexos BRD quatro. Os géis apresentaram outras proteínas identificadas como potenciais interagentes do BRD quatro.

Como exemplo adicional, isolamentos complexos foram realizados com a proteína Halo HD one. Neste caso, a protease TEV foi usada para clivar em uma região de ligação entre a tag Halo e a H DAC one, liberando quantidades significativas da proteína de isca HD one. Como observado.

As amostras de pulldown HD um mostraram altos níveis de atividade de HD um, que foi inibida pelo inibidor de HDA saha. Para demonstrar ainda mais a especificidade, nenhuma inibição da HDA foi observada com o inibidor da família de sirtuínas EX 5 27 e nenhum sinal foi detectado usando apenas o tampão. As células A transfectadas com Halo BRD quatro e Halo HDAC um foram marcadas com TMR por fluorescência.

A imagem do ligante mostrou que ambos se localizaram no núcleo e demonstraram que a etiqueta não alterou a localização celular fisiológica de seus parceiros de fusão. Assim, seguindo este procedimento, as proteínas isoladas e seus parceiros de interação podem ser identificados e analisados usando uma variedade de métodos analíticos, como espectrometria de massa e western blotting.