Descobrindo Interações proteína e caracterização da função das proteínas Usando HaloTag Tecnologia

O objetivo geral deste procedimento é isolar com eficiência complexos proteicos de células de mamíferos. Isso é realizado primeiramente transfectando as células com um construto de fusão com a marcação halo para expressar a proteína de interesse. O segundo passo é lisar as células e capturar covalentemente os complexos proteicos em resina por meio da marcação halo.

Em seguida, os complexos proteicos na resina são lavados suavemente para remover quaisquer interações não específicas. O passo final consiste em eluir os complexos proteicos da resina. Em última análise, os ensaios de precipitação com marcação halo são utilizados para isolar e descobrir novas interações proteicas em sistemas de mamíferos.

Os métodos que demonstraremos aqui para você hoje podem permitir descobertas fundamentais na área da proteômica funcional, incluindo a identificação de novas interações proteicas e a determinação da localização proteica no interior das células. Realizando estes procedimentos hoje estão dois de nossos cientistas sênior, Jackie Mendez e Alen Beek. Primeiro, para cada fusão ou controle, prepare um prato de 15 centímetros com 30 mililitros de células a três a quatro vezes 10 à quinta células por mililitro, ou um a 1,2 vezes 10 à sétima células no total por construto.

Incube as células por 18 a 24 horas a 37 graus Celsius e 5%CO2. Após a incubação, transfecte o construto com o reagente de transfeção desejado. Após 24 a 48 horas, pós-transfeção, remova o meio e lave suavemente a camada celular com 20 a 25 mililitros de PBS frio a 4 °C, remova a lavagem com PBS e adicione 25 a 30 mililitros de PBS resfriado a 4 graus Celsius.

Em seguida, remova suavemente as células do recipiente com um espátula para células. Uma vez que as células tenham sido coletadas em tubos cónicos, centrifugue as amostras por cinco a 10 minutos a 2000 ×g e quatro graus Celsius. Após a remoção do sobrenadante, coloque os pellets celulares a menos 80 graus Celsius por um mínimo de 30 minutos ou um máximo de seis meses.

Para cada amostra de fusão ou controle, prepare 18 mililitros de tampão de equilíbrio e lavagem da resina. Misture suavemente a resina invertendo o vial para obter uma suspensão uniforme. Para cada experimento de precipitação, distribua 200 microlitros de resina em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.

Centrifugue a amostra por um minuto a 800 vezes G. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a resina no fundo do tubo. Uma vez descartado o sobrenadante, adicione 800 microlitros de tampão de equilibração/lavagem da resina à amostra e misture bem invertendo o tubo várias vezes.

Centrifugue a amostra por dois minutos a 800 vezes. G. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Repita os passos anteriores mais duas vezes, para um total de três lavagens.

Após descongelar os pellets celulares, suspenda-os em 300 microlitros do tampão de lise para mamíferos previamente preparado, pipetando para cima e para baixo. Em seguida, transfira para um novo tubo de microcentrífuga e adicione seis microlitros do coquetel de inibidores de protease 50 x.

Em seguida, adicione três microlitros de DNAs RQ um e inverta a amostra durante 10 minutos. Lisar as células à temperatura ambiente passando a amostra de cinco a 10 vezes por uma agulha de seringa de 25 ou 27 gauge. Após centrifugar a amostra a 14.000 ×g por cinco minutos a 4 °C, transfira o lisado claro para um novo tubo e coloque-o no gelo.

Em seguida, adicione mais 700 microlitros do tampão 1 XTBS previamente preparado ao lisado claro e misture bem pipetando para cima e para baixo. Remova as últimas lavagens dos tubos de resina equilibrada previamente preparados sem perturbar a resina no fundo de cada tubo. Em seguida, adicione um mililitro do lisado diluído a cada tubo.

Incube as amostras com agitação em um rotador de tubos por 15 minutos a 22 graus Celsius. Após essa etapa, centrifugue os tubos de resina por dois minutos a 800 vezes G. Após descartar o sobrenadante, adicione um mililitro de tampão de equilíbrio/lavagem da resina e misture bem invertendo manualmente cada tubo de resina várias vezes, seguido de centrifugação dos tubos de resina por dois minutos a 800 vezes G. Descarte as soluções de lavagem após repetir os passos anteriores e de lavagem por três vezes.

Adicione um mililitro de tampão de equilíbrio da resina aos tubos após incubar as amostras a 22 graus Celsius por cinco minutos com rotação constante, centrifugue os tubos da resina por dois minutos a 800 vezes G e descarte os sobrenadantes. Neste ponto, ressuspenda a resina de cada amostra em 50 microlitros de tampão de eluição SDS. Agite os tubos à temperatura ambiente com um agitador automático de tubos de microcentrífuga por 30 minutos.

Após centrifugação por dois minutos a 800 vezes G, transfira os EITs para tubos novos para análise. Para blotagem ocidental ou gel de coloração com prata, carregue de cinco a 10 microlitros das amostras em um gel desnaturante de SDS para espectrometria de massa. Armazene 40 microlitros de cada amostra a menos 20 graus Celsius para análises futuras. Em uma lâmina de vidro com oito poços para cada proteína de fusão ou placa controle, adicione 400 microlitros de células HELOC em seu meio apropriado em cada poço, numa densidade de um a dois vezes 10 à quinta células por mililitro.

Após incubar as células por 18 a 24 horas a 37 graus Celsius e 5% CO₂, transfete-as com o reagente de transfeção desejado após 18 a 24 horas; posteriormente à transfeção, dilua o ligante TMR de um para 200 no meio celular apropriado. Em seguida, adicione 100 microlitros dessa solução a cada poço e misture suavemente. A seguir, incube as células transfectadas contendo o ligante por 15 minutos a 37 graus Celsius e 5% CO₂.

Quando terminar, aspire o meio contendo o ligante e substitua por 500 microlitros do meio apropriado sem o ligante da marcação por fusão proteica, que deve ter sido previamente aquecido a 37 graus Celsius. Após repetir o passo anterior duas vezes, perfazendo um total de três lavagens, coloque as células de volta no incubador por 30 minutos.

Após a incubação de 30 minutos, aspire o meio e substitua por 500 microlitros de meio apropriado, previamente aquecido a 37 graus Celsius. Em seguida, visualize as células em um microscópio utilizando os parâmetros de aquisição apropriados, conforme o protocolo halo, BRD quatro, e observe a expressão do controle da marcação halo. A expressão da proteína de fusão também pode ser detectada por meio de blotagens sulternas com anticorpos anti-marcação halo ou anticorpos contra a proteína isca.

Géis corados com prata de réplicas biológicas de Halo BRD4 e ensaios de precipitação por afinidade controle demonstram alta reprodutibilidade e mostram proteínas que interagem com a proteína BRD4. A alta abundância de componentes do PTEFb CDK9 e Ciclina T, bem como da proteína BRD9, confirma a captura específica de complexos BRD4. Os géis mostraram outras proteínas identificadas como interatores potenciais de BRD4.

Como exemplo adicional, foram realizadas isolamentos complexos com a proteína Halo HD um. Nesse caso, a protease TEV foi utilizada para clivar uma região de ligação entre a marcação Halo e a H DAC um, liberando quantidades significativas da proteína isca HD um. Como observado.

As amostras de pulldown de HD um mostraram altos níveis de atividade de HD um, os quais foram inibidos pelo inibidor de HDA saha. Para demonstrar ainda mais a especificidade, nenhuma inibição de HDA foi observada com o inibidor da família sirtuína EX 5 27 e nenhum sinal foi detectado utilizando apenas tampão. Células He A transfectadas com Halo BRD quatro e Halo HDAC um foram marcadas fluorescentemente com TMR.

A imagem de ligante mostrou que ambos estão localizados no núcleo e demonstra que a marcação não alterou a localização celular fisiológica de seus parceiros de fusão. Assim, após este procedimento, as proteínas isoladas e seus parceiros interagentes podem ser identificados e analisados posteriormente utilizando uma variedade de métodos analíticos, como espectrometria de massas e western blotting.