Name: Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprenda a purificação por afinidade em tandem para identificar parceiros de proteína em estudos de interação vírus-hospedeiro. Este método utiliza células HEC 293 e permite isolar complexos proteicos nativos para análise.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa Wellcome Senior confiança atribuído ao Dr. Ian Goodfellow.

1. Geração de linhas celulares: pMEP4 transfecção / expressão <ol><li> Transfectar células com o vetor de expressão pMEP4 e selecione com 100 mg de higromicina B / ml (Roche), até que todas as células transfectadas simulados foram mortos fora. O plasmídeo pMEP4 é mantida episomally portanto, não há necessidade de isolar clones específicos. </li><li> As células contendo o vector pMEP4 pode ser induzida por tratamento com 10 uM CdCl 2 durante 16 horas. Expressão e indutibilidade deve ser confirmado, em pequena escala antes da amplificação das linhas de células. A proteína TAP-etiquetados pode ser prontamente detectada como os domínios de proteína G se ligam a anticorpos a partir de quase todas as espécies. Para grande escala purificações normalmente 10 confluentes 175 cm 2 frascos de células são necessários. Isso equivale a cerca de 2 X10 8 células que expressam. </li></ol> 2. Preparação lisado celular <ol><li> Raspe as células em PBS e combinam em um único tubo ml 50. Spin 1200X gfou 5 minutos (isto deve resultar em 2-3 ml de eritrócitos para começar, o que reduz a cerca de 1,5 ml, após lavagem). </li><li> Lave as células três vezes em PBS gelado (50 ml de cada vez). </li><li> Lisar as células em 5 ml de tampão de lise (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 125 mM, glicerol 5%, 0,2% de NP-40, 1,5 mM de MgCl2, 25 mM NaF, 1 mM de Na 3 VO 4 e inibidor de protease ). Nota: NaF, Na 3 VO 4 e inibidores da protease devem ser adicionados fresco. Pipetar cima e para baixo 10 vezes antes de sair durante 5 minutos em gelo. Seringas cima e para baixo 5-10 vezes usando uma agulha romba antes de sair novamente em gelo durante 5 minutos em gelo. Repita syringing e deixar durante mais 5 minutos em gelo. </li><li> Freeze-descongelar o lisado duas vezes (gelo N2 líquido / ou seca e etanol). Não permitir amostra para alcançar uma maior do que 4 ° C. Nota: você pode armazenar esta amostra a -80 ° C até que você tenha tempo para processar. </li><li> Alíquota de amostra em tubos de 1,5 ml e remover as células unlysed edebris por centrifugação (10 minutos a 4 ° C, 16.000 X g). </li><li> Recuperar o sobrenadante, combinar num tubo Falcon 15 ml e (opcionalmente) passar através de um filtro de 0,45 antes de tomar uma amostra de 20 uL para a quantificação produção de proteína. Remover uma alíquota de 50 ul adicionais para análise subsequente (Amostra 1). </li></ol> 3. A ligação a IgG de coelho-agarose (Nota: Todos os spins deve ser realizado a 1200X g numa centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que indicado de outra forma) <ol><li> Suavemente ressuspender o IgG de coelho-agarose solução (Sigma-Aldrich) por agitação do frasco. Tome 380 uL de IgG de agarose (usando um corte ponta de pipeta de 1 ml) e remover o transporte / solução conservante por centrifugação durante 1 minuto. Lavar os agarose três vezes em tampão de lise refrigerados (4 ° C) usando centrifugação para clarificar. O rendimento final de agarose deve ser de cerca de 250 uL de pérolas de embalados. </li><li> Adicionar o lisado celular eliminado 2,6 (em uma cuba 15 ml Falcone) para o lavada-coelho IgG de agarose e incubar durante 3 horas (ou durante a noite) a 4 ° C usando um misturador rotativo. </li><li> Girar para baixo as esferas de agarose durante 5 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante para análise subsequente (Amostra 2). Nota: O TAP etiquetados com proteína deve agora ser associada com as esferas. </li></ol> 4. TEV clivagem protease (Nota: Todos os spins deve ser realizado a 1200X g numa centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que indicado de outra forma) <ol><li> Lavar os grânulos de coelho IgG de agarose três vezes em tampão de lise refrigerados (4 ° C) usando centrifugação para clarificar (nota: o tampão de lise não deve conter inibidores de protease). Cuidados devem ser tomados para não remover ou perder todas as pérolas durante as etapas de lavagem. </li><li> Lavar os grânulos mais duas vezes, com TEV protease-tampão de clivagem (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 100 mM, e 0,2% de NP-40) usando a centrifugação para clarificar. Após a última lavagem cuidadosamente remover todo o liquid a partir dos grânulos. </li><li> Prepara-se uma mistura de clivagem de TEV protease; para cada amostra incluem 467,5 uL de H2O, 25 uL de 20x tampão TEV (Invitrogen), 5 ul 0,1 M DTT e 2,5 ul (25 U) TEV Protease (Invitrogen). Adicionar 500 uL desta mistura de clivagem de TEV para cada amostra de grânulos compactados e transferir toda a mistura para um tubo de 1,7 ml de pré-lubrificado (Costar). Antes da incubação remover uma alíquota 30 ul para análise subsequente (Amostra 3). </li><li> Incubar a reacção protease de TEV durante a noite a 4 ° C utilizando um misturador rotativo. Note-se que tempos mais curtos incubações podem ser utilizadas dependendo da natureza da proteína isco e da acessibilidade do sítio de clivagem da protease de TEV, mas o tempo de incubação mínima deve ser determinado empiricamente. </li></ol> 5. A ligação às ULTRALINK estreptavidina imobilizada Além disso contas (Nota: Todos os spins deve ser realizado a 1200X g numa centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que indicado de outra forma) </p&gt; <ol><li> Centrifugar a reacção de clivagem de TEV contendo os grânulos de coelho IgG de agarose durante 5 minutos a 1200X g (4 ° C). Remover uma alíquota de 20 ul do sobrenadante clarificado para análise (Exemplo 4) </li><li> Transferir o sobrenadante remanescente (cerca de 480 uL) a uma ml 1,5 fresca pré-lubrificado tubo (Costar) e deixar em gelo. Não jogue fora este sobrenadante - contém sua proteína isca TEV clivados e as proteínas associadas vinculativos. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de lise gelada (Seção 2.3) para os restantes coelho IgG contas de agarose e ressuspender. Centrifugar esta mistura a clarificar as esferas antes de remover o sobrenadante e combinando-o com que a partir do passo 5.2. Deixar este tubo em gelo (deve conter agora ~ ul de amostra 980). </li><li> Guarde as contas de IgG de coelho de agarose para análise posterior (amostra 5). Nota: se executar esta amostra num gel de SDS-PAGE (ou Western blot) que irá dar um lote de fundo devido à presença da cadeia pesada de IgG e de luzcadeias. </li><li> Enquanto isso delicadamente ressuspender o Ultralink Imobilizado contas estreptavidina Plus agarose (Pierce) agitando o frasco. Usando uma ponteira 200 ul com o corte final, alíquota de 70 ul de contas estreptavidina por amostra em pré-lubrificadas tubos de 1,5 ml e remover transporte / solução conservante por centrifugação. Nota: estas contas são muito pequenas e por isso &quot;duck-billed&quot; ou apartamento / narrow-ended dicas podem ser usadas para minimizar a perda de talão durante a lavagem. </li><li> Lave as esferas de estreptavidina três vezes em tampão de lise frio (4 ° C) usando centrifugação para clarificar. Isso deve deixar cerca de 45-50 ul de contas embalados por tubo. </li><li> Transferir o sobrenadante de clivagem de protease-TEV (isto é, o uL de amostra 980 a partir do passo 5.3) para o tubo contendo as esferas de estreptavidina lavadas e incubar durante 3 horas (ou durante a noite) a 4 ° C usando um misturador rotativo. </li><li> Girar para baixo as esferas de estreptavidina durante 5 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante para análise subsequente (Samplo 6). Lave as esferas de estreptavidina três vezes em tampão de lise frio (4 ° C) usando centrifugação para clarificar. Após a lavagem final, cuidadosamente remover todo o tampão de lavagem restante. </li></ol> 6. Biotina eluição do péptido de ligação a estreptavidina e proteína isco (Nota: Todos os spins deve ser realizado a 1200X g numa centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que indicado de outra forma) <ol><li> Eluir proteínas marcadas a partir das pérolas de estreptavidina por adição de 500 ul de PBS: Biotina (1 mM D-biotina) e incubando a 4 ° C durante 3 horas (ou durante a noite), utilizando um misturador rotativo. </li><li> Girar para baixo as esferas de estreptavidina durante 5 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml de pré-lubrificado (Nota: esta é a sua amostra final / eluição (Exemplo 7). </li><li> Adicionar outra Biotina 500 uL: PBS para as esferas de estreptavidina restantes e incubar a 4 ° C durante 2-3 horas (ou durante a noite), utilizando um misturador rotativo. </li><li> Returfa passo 6,2 e combinar as duas eluições (Exemplo 7). Este eluição final pode ser armazenado a -80 ° C. </li><li> Para avaliar a eficiência da eluição biotina, congelar as esferas de estreptavidina restantes e ferver mais tarde, em tampão de amostra SDS (Exemplo 8) (recomendações: LaneMarker tampão de amostra de 5x reduzindo a partir de Fisher). </li></ol> 7. A concentração de proteína <ol><li> O eluato final (Amostra 7) tem de ser concentrada antes da análise por causa da concentração de proteína de baixo e de volume relativamente elevado. Isto pode conseguido usando baixo peso molecular (&lt;5 kDa) colunas spin Vivaspin (Vivascience). Destinam-se a concentrar-se o volume até menos de 100 uL. Esta amostra final pode ser fervido e armazenado em tampão de amostra de proteína (recomendações: LaneMarker tampão de amostra de 5x reduzindo a partir de Fisher). </li></ol> 8. Análise <ol><li> As amostras 1-8 pode ser analisada por Western blot para determinar a eficiência de puxar para baixo. Nota: A maioria dos anticorpos secundários vontadereagem de forma cruzada com os domínios da proteína G da proteína de fusão, mas este é removido após a clivagem protease de TEV. </li><li> Exemplo 7 pode ser analisada por 1D e 2D SDS-PAGE. Coloração pode ser realizada usando prata ou de Coomassie (recomendações: SilverQuest coloração de prata e coloidais Blue kits coloração com Coomassie de Invitrogen). Identificação de proteínas pode ser realizada utilizando espectrometria de massa. </li></ol> 9. Os resultados representativos Um exemplo de análise de SDS-PAGE 1D da eluição final (Amostra 7) a partir de este protocolo para identificar parceiros de ligação de eIF4E TAP etiquetados é fornecido na Figura 2. Este gel representante reflecte a natureza complexa e abundante de interacções com outras proteínas eIF4E na célula. A comparação com o controlo negativo também mostrada na Figura 2, gerada a partir de uma linha celular expressando somente a marca TAP, ilustra a especificidade deste eIF4E iscado pull-down. Neste exemplo 15% da eluição concentrado final (Amostra7) foi analisada por 1D SDS-PAGE utilizando disponíveis comercialmente géis pré-moldados de gradiente antes de serem coradas utilizando o kit de coloração de prata Silverquest a partir de Invitrogen. Tipicamente 50-85% da eluição concentrado restante final (Amostra 7) é analisado com Coomassie coloidal mancha (Invitrogen). As amostras (fatias de gel / bandas) a partir da pista inteira foram então extraídos e analisados ​​por espectrometria de massa. Proteínas identificadas no eIF4E pull-down foram filtrados contra os parceiros de ligação a partir do controlo negativo para identificar não-específicos parceiros de ligação. As proteínas finais identificados usando este processo de etiquetagem eIF4E TAP pode ser visto na Figura 2, que é representativo das proteínas normais identificados usando esta técnica. Além disso, um certo número de subunidades eIF3 também foram identificados (dados não mostrados). <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Esquemática doParalelamente processo de purificação de afinidade. O conjunto de seis passos afinidade purificação protocolo (TAP) envolve a geração linha celular, a lise celular, coelho IgG agarose imuno-precipitação, TEV clivagem protease, estreptavidina purificação por afinidade talão e eluição finalmente biotina. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Tandem purificação por afinidade da proteína de murino eIF4E. Interagindo parceiros do N terminal TAP etiquetados eIF4E foram purificados a partir de células HEK293 eucarióticas, utilizando o protocolo em anexo. Uma fracção de 20% da eluição final (Amostra 7) foi analisado por SDS-PAGE num gel de gradiente pré-fundido 4-12% (TAP-eIF4E pista). Uma análise foi realizada equivalente para a marca de sozinho (pista TAP). As proteínas foram identificadas usando coloração com prata. Proteínas subsequentemente identificadas por espectrometria de massa da mesma amostra são destacadas sobre este gel. Abreviaturas: eIF4G; eucariótico de iniciação da tradução fgama ator 4, PABP; polyA proteína de ligação, eIF4A: fator de iniciação eucariótico tradução 4 alpha, SBP-eIF4E; a proteína isca restante TAP contendo o peptídeo estreptavidina ligação fundida ao eucariótica 4E fator de iniciação da tradução, 4EBPs; tradução eucariótica 4E fator de iniciação de ligação proteínas, eIF4eNiF1l eucariótico de iniciação da tradução fator 4E fator de importação nuclear 1, SBP, o peptídeo estreptavidina restante ligação do peptídeo TAP TEV não fundido.

<ol><li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li>
<li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein%2C+NAP1%2C+affects+Rev+function%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li>
<li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li>
<li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep%2FFLAG+%28SF%29-TAP+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li>
<li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP%2FUSP7%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li>
<li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li>
<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li>
<li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+initiation+factor+4E%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A técnica de marcação TAP ilustrado aqui demonstra um método altamente específico e rigoroso para isolar os parceiros de ligação de proteínas isca em células eucarióticas. Esta abordagem pode ser aplicada a ambas as proteínas celulares e virais. Para o nosso conhecimento, este é a primeira vez que uma tal técnica tem sido aplicada à eIF4E factor de iniciação da tradução. Identificação do conhecido eIF4G proteínas eIF4E vinculativa e os 4EBPs usando esta técnica confirma a validade de tal abordagem. Além disso, a identificação do componente restante do complexo eIF4F, a saber, eIF4A, e PABP confirma que a interacção indirecta e complexos terciárias permanecer intacto durante o processo de purificação. A identificação de múltiplas isoformas dos canónicos eIF4E proteínas de ligação também era evidente. Estes são descritos em mais detalhe na Figura 2. Com relação às limitações da abordagem, certos cuidados devem ser tomadas medidas em relação à escolhade proteína isco e se ou não a colocar a etiqueta de TAG na extremidade N-ou C-terminal. Pode ser aconselhável realizar um ensaio funcional ou examinar a localização da proteína de fusão por microscopia antes da purificação escala completa para assegurar o derivado marcado é funcional. Membrana Integral ou proteínas nucleares não podem necessariamente ser liberado pelas condições relativamente suaves detergente descritos na etapa de lise. Como com todas as imunoprecipitações e semelhantes pull-down ensaios, as modificações podem ser feitas com a natureza e as concentrações do detergente no tampão de lise para aumentar a eficiência de lise. A concentração iónica dos buffers de lise e de lavagem pode também ser modificado para aumentar ou diminuir o rigor da purificação. É também possível realizar a purificação inicial sob condições padrão suaves (descrito acima), mas posteriormente dividir as esferas de estreptavidina (secção 5.8) em alíquotas 4-5, que podem posteriormente ser lavados sob crescente con iónicoções. Isso pode permitir que o usuário a identificar as condições ideais que removem não-específicas proteínas que interagem. Todo o processo pode também ser realizada usando transfecção transiente em que os parceiros que interagem são conhecidos ea sua presença ou ausência determinada por Western blot subsequente apenas. Neste caso, sugiro dois 100cm 2 pratos de cada células transfectadas com 8 mg de plasmídeo de expressão. Este procedimento modificado é de particular utilidade quando se examina a capacidade de derivados de mutantes da proteína de fusão TAP-para interagir com parceiros de ligação conhecidos. Análise de amostras de 1 a 8 em corado com prata de SDS-PAGE (gel ou por western blot se um anticorpo está disponível) é um excelente meio de resolução de problemas, se a técnica de falhar para gerar os resultados aceitáveis. A eficiência de cada precipitação afinidade baseada e eluição específico podem ser analisados ​​usando esta abordagem sistemática de amostragem. As amostras de um a oito deve ser tomado durante optimização do protocolo para cada nova isca. A técnica de marcação TAP fornece uma alternativa poderosa e robusta para outras abordagens, tais como GST pull-baixos, de levedura dois ensaios híbridos etc A purificação por afinidade dupla e os passos de eluição específicos (de clivagem de TEV e eluição biotina) fornecer especificidade e rigor que ser mantido a uma elevado nível durante todo o procedimento de purificação. Criticamente esta técnica pode ser aplicada a qualquer proteína e, portanto, representa um excelente método para identificar parceiros de ligação para um alvo da proteína de interesse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> IgG de coelho Agarose </td><td> Sigma </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TEV Protease </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> Cocktail inibidor de protease </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> Ultralink Imobilizado contas estreptavidina Plus </td><td> Perfurar </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin concentrador de 500 centrífugas (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest kit coloração com prata </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex coloidal Azul kit de coloração de Coomassie </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ml tubos previamente lubrificados</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Microcapilar ponteiras </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4-12% gradiente de Bis-Tris géis </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> Tampão de amostra SDS 5x </td><td> Pescador </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identificação de parceiros de proteína interagir utilizando tandem purificação por afinidade

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Um passo crítico e, muitas vezes limitante na compreensão da função do hospedeiro e proteínas virais é a identificação de interagir parceiros de proteínas celulares ou virais. Existem muitas abordagens que permitem a identificação de parceiros que interagem, incluindo o sistema de levedura duas híbrido, bem como puxar para baixo, utilizando ensaios de proteínas recombinantes e imunoprecipitação de proteínas endógenas seguidos por espectrometria de massa de identificação 1. Estudos recentes revelaram a utilidade de duplo afinidade purificação mediada tag, juntamente com dois passos de eluição específicos na identificação de proteínas que interagem. Esta abordagem, denominado Tandem purificação por afinidade (TAP), foi inicialmente utilizado em levedura 2,3 mas mais recentemente foi adaptado para usar em células de mamíferos 4-8. Como prova de conceito, criámos uma purificação por afinidade tandem (TAP) usando o método do bem caracterizada eucariótico de iniciação da tradução factor eIF4E 9,10. O eIF4E fator celular de tradução é um componente crítico do complexo eIF4F celular envolvido na cap-dependente de início da tradução 10. A etiqueta de TAP utilizado no presente estudo é composto de duas unidades de proteína G e um péptido de ligação a estreptavidina separados por um vírus de Tabaco Etch (TEV) sequência de clivagem de protease. A etiqueta de TAP utilizado no presente estudo é composto de duas unidades de proteína G e um péptido de ligação a estreptavidina separados por um vírus de Tabaco Etch (TEV) a sequência de clivagem de protease 8. Para renunciar a necessidade para a geração de linhas de células clonais, foi desenvolvido um sistema rápido que depende da expressão da proteína TAP-etiquetados com isco de um plasmídeo episomally mantida com base em pMEP4 (Invitrogen). Expressão de etiquetados eIF4E murino a partir deste plasmídeo foi controlado usando o cádmio cloreto de promotor de metalotioneina indutível. Lise das células que expressam e subsequente purificação por afinidade através de ligação a rabbit IgG agarose, TEV clivagem protease, a ligação a estreptavidina agarose ligada e eluição biotina subseqüente identificaram proteínas numerosas aparentemente específicos para o eIF4E pull-down (quando comparado ao grupo controle linhas de células que expressam a marca TAP sozinho). As identidades das proteínas foram obtidos por excisão das bandas de espectrometria de massa de SDS-PAGE e subsequente em tandem 1D. Os componentes identificados incluído as proteínas de ligação conhecidos eIF4E eIF4G e 4EBP-1. Além disso, outros componentes do complexo eIF4F, dos quais eIF4E é um componente foram identificados, ou seja, eIF4A e Poly-A proteína de ligação. A capacidade de identificar não apenas conhecidos diretos parceiros de ligação, bem como secundárias proteínas interagem entre si, acentua ainda mais a utilidade desta abordagem para a caracterização de proteínas de função desconhecida.

Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

Uma etapa crítica e frequentemente limitante na compreensão da função de proteínas do hospedeiro e virais é a identificação de proteínas celulares ou virais interagentes...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar um método conhecido como purificação por afinidade em tandem para isolar parceiros de ligação proteica. Olá, sou dLAN Bailey da seção de Virologia do Imperial College London. Em nosso laboratório, estudamos as interações entre vírus e hospedeiro para diferentes membros da família de vírus.Identificar proteínas que interagem com outras proteínas celulares ou virais é um excelente ponto de partida para investigar a interação entre o vírus e seu hospedeiro durante a infecção. Neste vídeo, explicarei uma abordagem que utilizamos em nosso laboratório, a purificação por afinidade em tandem ou marcação com a etiqueta Tap. A etiqueta Tap utilizada neste estudo é uma marcação na extremidade N-terminal, composta por duas unidades da proteína G e um peptídeo de ligação à estreptavidina.Estes são separados por uma sequência de clivagem da protease TEV que permite a eluição específica da proteína isca. Neste exemplo, a EIF4E murina está no extremo C desta construção de fusão. O protocolo de marcação TAP é um procedimento de seis etapas.Após a transfeção e geração de linhagens celulares, as células são induzidas a expressar a proteína marcadora antes de serem lisadas em um tampão de lise suave. Dois passos de purificação por afinidade e duas soluções específicas são utilizados para purificar a proteína alvo e quaisquer possíveis parceiros interagentes, gerando assim linhagens celulares. Células HEC 293 devem ser transfectadas com o vetor de expressão P met quatro que codifica.As células com a proteína isca marcada por tap são então selecionadas com cem microgramas por mililitro de higromicina B. Como o plasmídeo é mantido de forma episomal, não é necessário isolar clones específicos. Dez frascos confluentes de células são induzidos pelo tratamento com cloreto de cádmio 10 micromolar por 16 horas antes de serem raspados para o meio de cultura. As células em suspensão são então transferidas para tubos de 15 mL e as células são pelotizadas por centrifugação.Essas células são então lavadas três vezes com PBS gelado antes de finalmente serem centrifugadas. Na segunda etapa, a lise celular é realizada em cinco mililitros de tampão de lise frio por pipetagem repetida, seguida de incubação no gelo por cinco minutos. Para garantir uma lise eficiente, as células são então passadas através de uma agulha romba de diâmetro estreito e submetidas a ciclos de congelamento e descongelamento.O sobrenadante resultante é distribuído em tubos de 1,5 mL e células e detritos removidos por centrifugação. Vale ressaltar que o tamanho do pellet é acentuadamente reduzido após esta etapa de centrifugação. Os sobrenadantes do lisado são então combinados em um tubo Falcon de 15 mL e passados por um filtro de 0,45 micrômetro para remover quaisquer detritos adicionais.Devem ser coletadas alíquotas de 50 microlitros desse lisado para análises subsequentes. Esta amostra é denominada amostra um. Passo três, ligação ao Aeros de IgG de coelho.Nesta etapa do protocolo, as marcas de proteína G são imunoprecipitadas por anticorpos de coelho IgG. Para alocar as microesferas de anticorpo, remova a extremidade da ponta de pipeta. Isso ajuda a evitar danos às microesferas.Resuspenda suavemente a solução de aro de IgG de coelho girando o frasco antes de transferir os aros para um tubo de 15 ml. Lave os aros três vezes com tampão de lise resfriado, utilizando centrifugação de baixa velocidade para clarificar as perlas a cada etapa. As perlas de IgG de coelho sedimentadas devem ser visíveis após a centrifugação.Após cada etapa, remova cuidadosamente o tampão sem perturbar as microesferas. Após a conclusão da lavagem final, adicione o lisado filtrado e clarificado às microesferas empacotadas e incube por três horas ou durante a noite. É preferível a quatro graus C utilizando um misturador rotativo.Após a imunoprecipitação, centrifugue os grânulos de agarose e remova o sobrenadante para análises subsequentes. Se necessário, você pode usar uma ponta fina para remover qualquer líquido remanescente deste tubo. Este sobrenadante é a amostra dois, etapa quatro, clivagem pela protease TEV.Nesta etapa, a isca é clivada das marcas de proteína G. Este passo permite o clivagem específico da proteína de isca, funcionando efetivamente como uma etapa de eluição da imunoprecipitação com IgG de coelho em microesferas de aros. Prepare a mistura de clivagem por TEV e adicione-a às microesferas de aros usando uma ponteira com a extremidade removida, transfira esta mistura para um tubo de microcentrífuga silanizado e inverta para suspender as microesferas de aros antes da incubação noturna a quatro graus C. Retire uma alíquota desta reação de clivagem por TEV para análise.Esta é a amostra três. A incubação durante a noite no misturador rotativo deve permitir que a reação TEV progrida até quase a conclusão. Passo cinco, ligação para imobilizar as microesferas de estrept avidina.Nesta etapa, a isca Cleve e quaisquer parceiros de ligação potenciais são purificados por afinidade a partir da solução. Primeiramente, centrifugue a reação de clivagem TEV contendo as microesferas de IgG de coelho aros. Para obter o pellet das aros, remova uma OTT do sobrenadante clarificado para análise.Esta é a amostra quatro. Remova cuidadosamente todo o sobrenatante remanescente, que contém sua proteína de captura, para um tubo novo. Novamente, use o pipetador com cuidado.Centrifugue para remover todo o sobrenatante possível. Retenha as microesferas de IgG de coelho para análise subsequente. Esta é a amostra cinco.Para evitar danos aos grânulos de strep adin, remova a extremidade de uma ponteira descartável. Resuspenda suavemente os grânulos e retire uma alíquota para um tubo silanizado. Lave os grânulos contendo strep adin com tampão S, clarificando por centrifugação de baixa velocidade.Após cada lavagem. Após cada lavagem, remova cuidadosamente o tampão. As microesferas Strept adin são muito pequenas e podem ser facilmente deslocadas, mesmo ao usar pipeta fina.Prepare as dicas de purificação. Após as microesferas de estreptavidina terem sido lavadas, adicione o sobrenadante da reação de clivagem por TEV a essas microesferas e incube a reação por três horas ou durante a noite a quatro graus C, utilizando um agitador rotativo.Após a incubação, centrifugue e remova o sobrenadante dos grânulos de streptavidina. Esta é a amostra seis. Observação.A proteína Beit está agora associada às perolas remanescentes no tubo. Lave as perolas de estreptavidina contendo sua proteína isca com tampão de lise. Para remover quaisquer proteínas contaminantes adicionais, remova a solução remanescente de lavagem das perolas e mantenha-as em gelo.Etapa seis, eluição com biotina. Nesta etapa, a biotina é adicionada às microesferas de estreptavidina. A interação entre a biotina e as microesferas de estreptavidina desloca a isca, que retorna à solução.Adicione a solução de biotina diretamente às esferas e inverta para misturar. Incube a reação a quatro graus C por três horas ou durante a noite usando um misturador rotativo centrífugo, a mistura de biotina com aerossol e colete cuidadosamente a mistura em um tubo novo. Esta é a sua EIT final, denominada amostra sete.As esferas restantes de strept havein são a amostra oito. Devido à sua baixa concentração de proteína, este eluato final precisa ser concentrado antes da análise. Isso é realizado utilizando colunas de centrifugação com corte de peso molecular baixo, reduzindo o volume por meio de centrifugação, monitorando regularmente o processo.Essa amostra concentrada pode ser dividida e analisada em géis SDS-PAGE por coloração com Coomassie e prata. Se as amostras devem ser analisadas por espectrometria de massas, recomendamos o uso de géis comerciais pré-moldados. As bandas individuais podem então ser extraídas e as proteínas identificadas por espectrometria de massas.Neste caso, a isca era murina, EIF para a proteína E. A vantagem do sistema tap é que você tem a capacidade de expressar sua proteína de interesse em uma linhagem celular específica, e, dependendo da linhagem celular em que estiver interessado, também lhe confere a possibilidade de expressar a proteína em níveis relativamente baixos. Você decide isso, e todas as modificações pós-traducionais e a localização são mantidas, de modo que frequentemente é possível purificar o complexo nativo.

identification-protein-interacting-partners-using-tandem-affinity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a...

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Nós apresentamos uma variação da abordagem QUICK (Imunoprecipitação quantitativos em conjunto com Knockdown) que foi introduzida anteriormente para distinguir entre verdadeiros e falsos interacções proteína-proteína. A nossa abordagem é...

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Este vídeo demonstra a purificação de afinidade em tandem - uma técnica para purificar complexos de proteínas de células eucarióticas para estudar a interação proteína-proteína. O complexo contém duas proteínas marcadas com diferentes tags de epítopos. Após a purificação do complexo usando duas resinas com afinidade pelas duas marcas diferentes de maneira sequencial, a presença de ambas as proteínas no eluidor confirma a interação entre as duas.

Ensaio de purificação de afinidade em tandem para estudar interações proteína-proteína

Drosophila é famoso por sua poderosa manipulação genética, mas não para a sua adequação de análises bioquímicas em profundidade. Aqui apresentamos um procedimento baseado em TAP para identificar interagindo parceiros de qualquer proteína de interesse a partir do cérebro da mosca. Este procedimento pode potencialmente levar a novos caminhos de pesquisa.

Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas.

Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

Utilizando microarrays de proteína que contêm quase toda a S. cerevisiae proteoma é sondado para um rápido interrogatório imparcial de milhares de interações proteína-proteína em paralelo. Este método pode ser utilizado para a molécula de proteína-pequena, a modificação pós-traducional, e outros ensaios in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

O método Tandem Affinity Purification (TAP) tem sido amplamente utilizado para isolar complexos nativos de extrato celular, principalmente eucariótico, para proteômica. Aqui, apresentamos um protocolo do método TAP otimizado para purificação de complexos nativos para estudos estruturais.

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Interações da proteína-proteína e proteína-metabólito são cruciais para todas as funções celulares. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise paralela dessas interações com uma proteína de escolha. Nosso protocolo foi otimizado para culturas de células de plantas e combina a purificação da afinidade com espectrometria de massa base de proteína e deteção do metabólito.

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Aprenda a purificação por afinidade em tandem para identificar parceiros de proteína em estudos de interação vírus-hospedeiro. Este método utiliza células HEC 293 e permite isolar complexos proteicos nativos para análise.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

Explorar mais vídeos