Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

O objetivo geral deste procedimento é utilizar um método conhecido como purificação por afinidade em tandem para isolar parceiros de ligação proteica. Olá, sou dLAN Bailey da seção de Virologia do Imperial College London. Em nosso laboratório, estudamos as interações entre vírus e hospedeiro para diferentes membros da família de vírus.

Identificar proteínas que interagem com outras proteínas celulares ou virais é um excelente ponto de partida para investigar a interação entre o vírus e seu hospedeiro durante a infecção. Neste vídeo, explicarei uma abordagem que utilizamos em nosso laboratório, a purificação por afinidade em tandem ou marcação com a etiqueta Tap. A etiqueta Tap utilizada neste estudo é uma marcação na extremidade N-terminal, composta por duas unidades da proteína G e um peptídeo de ligação à estreptavidina.

Estes são separados por uma sequência de clivagem da protease TEV que permite a eluição específica da proteína isca. Neste exemplo, o EIF4E murino está no extremo C desta construção de fusão. O protocolo de marcação TAP é um procedimento de seis etapas.

Após a transfeção e geração de linhagens celulares, as células são induzidas a expressar a proteína de marcação antes de serem lisadas em um tampão de lise suave. Dois passos de purificação por afinidade e duas soluções específicas são utilizados para purificar a proteína de interesse e quaisquer parceiros interatores potenciais, visando gerar linhagens celulares. Células HEC 293 devem ser transfectadas com o vetor de expressão P met quatro que codifica.

As células com a proteína isca marcada por tap são então selecionadas com cem microgramas por mililitro de higromicina B. Como o plasmídeo é mantido de forma episomal, não é necessário isolar clones específicos. Dez frascos confluentes de células são induzidos pelo tratamento com 10 micromolares de cloreto de cádmio por 16 horas antes de serem raspados para o meio. As células em suspensão são então transferidas para tubos de 15 mL e as células são pelotizadas por centrifugação.

Essas células são então lavadas três vezes com PBS gelado antes de finalmente serem centrifugadas. Na segunda etapa, a lise celular é realizada em cinco mililitros de tampão de lise frio por pipetagem repetida, seguida de incubação no gelo por cinco minutos. Para garantir uma lise eficiente, as células são então passadas através de uma agulha romba de diâmetro estreito e submetidas a ciclos de congelamento e descongelamento.

O sobrenadante resultante é distribuído em tubos de 1,5 mL e células e debris removidos por centrifugação. Vale notar que o tamanho do pellet é acentuadamente reduzido após esta etapa de centrifugação. Os sobrenadantes do lisado são então combinados em um tubo cônico de 15 mL e passados por um filtro de 0,45 micrômetro para remover qualquer debris adicional.

Aliquotas de 50 microlitros desse lisado devem ser coletadas para análises subsequentes. Esta amostra é denominada amostra um. Passo três, ligação ao Aeros de IgG de coelho.

Nesta etapa do protocolo, as marcas de proteína G são imunoprecipitadas por anticorpos de coelho IgG. Para alocar as microesferas de anticorpos, remova a extremidade da ponta de pipeta. Isso ajuda a evitar danos às microesferas.

Resuspenda suavemente a solução de aro de IgG de coelho girando o frasco antes de transferir os aros para um tubo de 15 ml. Lave os aros três vezes com tampão de lise gelado, utilizando centrifugação de baixa velocidade para clarificar as perlas em cada etapa. As perlas de IgG de coelho em pellet devem ser visíveis após a centrifugação.

Após cada etapa, remova cuidadosamente o tampão sem perturbar as microesferas. Após a conclusão da lavagem final, adicione o lisado filtrado e clarificado às microesferas empacotadas e incube por três horas ou durante a noite. É preferível a quatro graus C utilizando um misturador rotativo.

Após a imunoprecipitação, centrifugue os grânulos de agarose e remova o sobrenadante para análises subsequentes. Se necessário, você pode usar uma ponta fina para remover qualquer líquido remanescente deste tubo. Este sobrenadante é a amostra dois, etapa quatro, clivagem pela protease TEV.

Nesta etapa, a isca é clivada das marcas de proteína G. Este passo permite o clivagem específico da proteína de isca, funcionando efetivamente como uma etapa de eluição da imunoprecipitação com IgG de coelho em microesferas de aros. Prepare a mistura de clivagem por TEV e adicione-a às microesferas de aros usando uma ponteira com a extremidade removida, transfira esta mistura para um tubo de microcentrífuga silanizado e inverta para suspender as microesferas de aros antes da incubação noturna a quatro graus C. Retire uma alíquota desta reação de clivagem por TEV para análise.

Esta é a amostra três. A incubação durante a noite no misturador rotativo deve permitir que a reação TEV progrida até a quase conclusão. Passo cinco, ligação para imobilizar as microesferas de estreptavidina.

Nesta etapa, a isca Cleve e quaisquer parceiros de ligação potenciais são purificados por afinidade a partir da solução. Primeiramente, centrifugue a reação de clivagem TEV contendo as microesferas de IgG de coelho aros. Para obter o pellet das aros, remova uma OTT do sobrenadante clarificado para análise.

Esta é a amostra quatro. Remova cuidadosamente todo o sobrenatante remanescente, que contém sua proteína de captura, para um tubo novo. Novamente, use o pipetador com cuidado.

Centrifugue para remover todo o sobrenatante possível. Retenha as microesferas de IgG de coelho para análise subsequente. Esta é a amostra cinco.

Para evitar danos aos grânulos de strep adin, remova a extremidade de uma ponteira descartável. Resuspenda suavemente os grânulos e transfira uma alíquota para um tubo silanizado. Lave os grânulos contendo strep adin com tampão S, clarificando por centrifugação de baixa velocidade.

Após cada lavagem, remova cuidadosamente o tampão. As microesferas Strept adin são muito pequenas e podem ser facilmente deslocadas, mesmo ao usar pipeta fina.

Prepare as dicas de purificação. Após as microesferas de estreptavidina terem sido lavadas, adicione o sobrenadante da reação de clivagem por TEV a essas microesferas e incube a reação por três horas ou durante a noite a quatro graus C, utilizando um agitador rotativo.

Após a incubação, centrifugue e remova o sobrenadante dos grânulos de streptavidina. Esta é a amostra seis. Vale ressaltar.

A proteína Beit agora está associada às bolinhas remanescentes no tubo. Lave as bolinhas de estreptavidina contendo sua proteína isca com tampão de lise. Para remover quaisquer proteínas contaminantes adicionais, remova a solução remanescente de lavagem das bolinhas e mantenha-as em gelo.

Etapa seis, eluição com biotina. Nesta etapa, a biotina é adicionada às microesferas de estreptavidina. A interação entre a biotina e as microesferas de estreptavidina desloca a isca, que retorna à solução.

Adicione a solução de biotina diretamente às esferas e inverta para misturar. Incube a reação a quatro graus C por três horas ou durante a noite usando um misturador rotativo centrífugo, a mistura de biotina com aerossol e colete cuidadosamente a mistura em um tubo novo. Esta é a sua EIT final, denominada amostra sete.

As microesferas restantes de strept havein correspondem à amostra oito. Devido à sua baixa concentração de proteína, este eluato final precisa ser concentrado antes da análise. Isso é realizado utilizando colunas de centrifugação com corte de peso molecular baixo, reduzindo o volume por meio da centrifugação, monitorando regularmente o processo.

Essa amostra concentrada pode ser dividida e analisada em géis SDS-PAGE por coloração com Coomassie e prata. Se as amostras devem ser analisadas por espectrometria de massas, recomendamos o uso de géis comerciais pré-moldados. As bandas individuais podem então ser extraídas e as proteínas identificadas por espectrometria de massas.

Neste caso, a isca era murina, EIF para a proteína E. A vantagem do sistema tap é que você tem a capacidade de expressar sua proteína de interesse em uma linhagem celular específica, e, dependendo da linhagem celular em que estiver interessado, também lhe confere a possibilidade de expressar a proteína em níveis relativamente baixos. Você decide isso, e todas as modificações pós-traducionais e a localização são mantidas, de modo que frequentemente é possível purificar o complexo nativo.