Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

O objetivo geral deste procedimento é usar um método conhecido como purificação de afinidade Tandem para isolar parceiros de ligação a proteínas. Olá, sou dLAN Bailey, da seção de Virologia do Imperial College London. Em nosso laboratório, trabalhamos em interações vírus-hospedeiro para diferentes membros da família de vírus.

Identificar proteínas que interagem com outras proteínas celulares ou virais é um ótimo ponto de partida para investigar a interação entre o vírus e seu hospedeiro durante a infecção. Neste vídeo, explicarei uma abordagem que usamos em nosso laboratório, purificação tandem e e ou marcação de torneira. A etiqueta Tap usada neste estudo é uma etiqueta terminal N que consiste em duas unidades de proteína G e um peptídeo de ligação à adina estreptocócica.

Estes são separados por uma sequência de clivagem de protease TEV que permite a eluição específica da proteína da isca. Neste exemplo, murino, EIF quatro E está no terminal C desta construção de fusão. O protocolo de marcação de toque é um procedimento de seis etapas.

Após a transfecção e geração de linhagens celulares, as células são induzidas a expressar a proteína de abatimento de tag antes de serem colocadas em um tampão de lise leve. Duas etapas de purificação de afinidade e duas soluções específicas são usadas para purificar a isca e quaisquer parceiros potenciais de interação para gerar linhagens celulares. As células HEC 2 93 devem ser transfectadas com a codificação do vetor de expressão P met four.

As células proteicas de isca marcadas com torneira são então selecionadas com cem microgramas por mil higromicina B. Como o plasmídeo é mantido episo, não há necessidade de isolar clones específicos. 10 frascos confluentes de células são induzidos pelo tratamento com cloreto de cádio 10 micromolar por 16 horas antes de serem raspados no meio. As células suspensas são então transferidas para tubos de 15 M e as células peletizadas por centrifugação.

Essas células são então lavadas três vezes com PBS gelado antes de finalmente serem peletizadas. As células de lise celular da segunda etapa encontram-se em cinco mils de tampão de lise fria por pipetagem repetida antes de serem deixadas no gelo por cinco minutos. Para garantir uma lise eficiente, as células são então seringadas através de uma agulha de bitola estreita, romba e congelam.

O sato resultante é alocado em tubos de 1,5 mil e unli células e detritos removidos por centrifugação. É importante notar que o tamanho do pellet é significativamente reduzido após esta etapa de centrifugação. Os sobrenadantes lisados são então combinados em um tubo Falcon de 15 mil e passados por um filtro de 0,45 micrômetro para remover quaisquer detritos adicionais.

Devem ser colhidas alíquotas de 50 microlitros deste lisado para análise posterior. Esta amostra é referida como amostra um. Etapa três, ligação ao coelho IgG Aeros.

Nesta etapa do protocolo, as marcas de proteína G são imunoprecipitadas por IgG aros de coelho. Para alocar contas de aro, remova a ponta da ponta do macaco. Isso ajuda a evitar danificar os grânulos.

Ressuspenda suavemente a solução de IgG aro de coelho girando o frasco antes de remover o aros para um tubo de 15 mil. Lave o aros três vezes em tampão de lise resfriado usando centrifugação de baixa velocidade para clarificar os grânulos em cada etapa. Os grânulos de IgG de coelho peletizados devem ser visíveis após a centrifugação.

Após cada etapa, remova cuidadosamente o buffer sem perturbar os grânulos. Após a conclusão da lavagem final, adicione o lisado filtrado e clarificado às esferas embaladas e incube por três horas ou durante a noite. Preferiu a quatro graus C usando um misturador rotativo.

Após a imunoprecipitação, girar os grânulos de agros e remover o sobrenadante para análise subsequente. Se necessário, você pode usar uma ponta de construção fina para remover qualquer líquido restante deste tubo. Este sobrenadante é a amostra de clivagem de protease TEV de duas etapas quatro.

Nesta etapa, a isca é clivada das etiquetas de proteína G. Esta etapa permite a clivagem específica da proteína da isca efetivamente uma etapa de eluição da imunoprecipitação de IgG aros de coelhos. Prepare a mistura de clivagem TEV e adicione-a aos grânulos aros usando a ponta do macaco com a extremidade removida, transfira esta mistura para um tubo de microcentrífuga siliconizado e inverta para misturar o aros em suspensão antes da incubação noturna a quatro graus C, remova um alico desta reação de clivagem TEV para análise.

Esta é a amostra três. A incubação durante a noite no misturador rotativo deve permitir que a reação do TEV progrida até quase a conclusão. Etapa cinco, ligação para imobilizar grânulos de adin strept.

Nesta etapa, a isca Cleve e quaisquer potenciais parceiros de ligação são purificados por afinidade da solução. Em primeiro lugar, centrifugue a reação de clivagem TEV contendo as esferas de IgG aros de coelho. Para peletar o aros, remova um OTT do sobrenadante clarificado para análise.

Esta é a amostra quatro. Remova cuidadosamente todo o sobrenadante restante, que contém a proteína da isca para um tubo novo. Novamente, use bem.

Construa pontas peppe para remover todos os sobrenadantes possíveis. Guarde as esferas de IgG aros de coelho para análise subsequente. Esta é a amostra cinco.

Para evitar danos aos grânulos de estreptococos, remova a extremidade de uma ponta de animal de estimação. Ressuspenda suavemente as contas e remova um alico para um tubo siliconizado. Lave o estreptococo com tampo S, clarificando por centrifugação de baixa velocidade.

Após cada lavagem. Após cada lavagem, remova cuidadosamente o tampão. Os grânulos de adin estreptocócico são muito pequenos e podem ser facilmente deslocados mesmo quando usados finos.

Crie dicas para animais de estimação. Depois que as contas de adin do strept foram lavadas. Adicione o sobrenadante da reação de clivagem do TEV a esses grânulos e incube a reação por três horas ou durante a noite a quatro graus C, usando um misturador rotativo.

Após a incubação, a centrífuga tem grânulos de strept havein e remove o sup natum. Esta é a amostra seis. Digno de nota.

A proteína Beit agora está associada às esferas restantes no tubo. Lave as esferas de estreptavidina contendo sua proteína de isca com tampão de lise. Para remover quaisquer proteínas contaminantes adicionais, remova a solução de lavagem restante das esferas e deixe-as no gelo.

Etapa seis, eluição de biotina. Nesta etapa, a biotina é adicionada às esferas de estreptavidina. A interação entre a biotina e as esferas de estreptavidina desloca a isca, que volta à solução.

Adicione a solução de biotina diretamente nas esferas e inverta para misturar. Incube a reação a quatro graus C por três horas ou durante a noite usando uma centrífuga misturadora rotativa, a mistura de biotina aeros e colete cuidadosamente a mistura em um tubo novo. Este é o seu EIT final, referido como amostra sete.

Os grânulos restantes do havein do strept são amostra oito. Devido à sua baixa concentração de proteína, este eluato final precisa ser concentrado antes da análise. Isso é conseguido usando baixos pesos moleculares, corte colunas de rotação, reduza o volume por centrifugação monitorando o processo regularmente.

Esta amostra concentrada pode ser dividida e analisada em géis de página SDS por kumasi e silver stain. Se as amostras forem analisadas por especificação de massa, aconselhamos o uso de géis comerciais pré-moldados. Bandas individuais podem então ser extraídas e as proteínas identificadas por espectrometria de massa.

Neste caso, a isca foi murina, EIF para proteína E. A vantagem do sistema tap é que você tem a capacidade de expressar sua proteína de interesse em uma determinada linhagem celular e, dependendo da linhagem celular em que está interessado, também oferece a capacidade de expressar a proteína em níveis relativamente baixos. Você decide, e todas as modificações pós-traducionais e localização mantidas, para que você possa purificar frequentemente o complexo nativo.