Estabilização hepatocelular Fenótipo Usando superfícies sintéticas otimizados

O objetivo geral deste procedimento é otimizar as superfícies revestidas com polímero para preservar a cultura estável a longo prazo de hepatócitos humanos derivados de células-tronco. Isso é feito sintetizando primeiro poliuretano 1 3 4 ou PU 1 3 4. O segundo passo é escolher o solvente certo para solubilizar PU 1 34.

Em seguida, o processo de revestimento giratório com o PU 1 3 4 na lamínula de cobertura de vidro é otimizado. A etapa final é a otimização do procedimento de esterilização das lamínulas de vidro revestidas com polímero P 1 34, em última análise, microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica e metabolismo de drogas. Os ensaios são usados para mostrar a influência do revestimento de polímero PU 1 34 na função dos hepatócitos derivados de células-tronco.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o uso de al Metrices em cultura na manutenção de células-tronco potentes de URI que possuem hepatócitos, é que esses materiais sintéticos podem ser ajustados para fins e uma escala de acordo com os padrões de qualidade garantida. Além disso, eles exibem a consistência do barramento do lote dois. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças hepáticas porque representa um exemplo de como a superfície de um polímero sintético pode ser otimizada para preservar o fenótipo celular.

Demonstrando o procedimento estará o Dr. Jeffrey Walton, um pós-doutorado do meu laboratório antes de iniciar este procedimento. Aplique tratamento térmico no mono seis hexano dial di etilenoglicol e neo PenTile glicol a 40 graus Celsius por 48 horas em um forno a vácuo. Para remover qualquer água residual, adicione 22 milimoles de cada monômero e 55 milimoles de ácido dpic a um frasco de fundo redondo de dois gargalos conectado a um aparelho dean stark e equipado com uma barra de agitação magnética.

Em seguida, coloque todo o conjunto sob vácuo e aqueça suavemente a vidraria a 40 graus Celsius por seis horas para evitar qualquer absorção de umidade durante a adição do produto químico ao frasco. Depois de remover o conjunto do forno e colocar o sistema sob nitrogênio, adicione 0,0055 moles do catalisador titânio quatro, mas óxido gota a gota por uma seringa ao frasco. Agite a mistura de reação a 180 graus Celsius por 24 horas, coletando água residual na armadilha dean stark.

Deixe o produto esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, misture 3,2 milimoles, ou um equivalente do poliol P-H-N-G-A-G com 6,4 milimolares ou dois equivalentes de quatro quatro metil e um isocianato de bisfenol. Em 12 mililitros de DML anidro para um frasco de fundo redondo de dois pescoços conectado a um aparelho dean stark e equipado com uma barra estrela magnética.

Agite a mistura de reação a 70 graus Celsius sob uma atmosfera de nitrogênio. Em seguida, adicione o catalisador de titânio quatro óxidos gota a gota via seringa a uma concentração final de 0,8% Após uma hora, adicione um equivalente do extensor de cadeia um mostrador de quatro butano para dar o produto de copolímero. Aumente a temperatura para 90 graus Celsius e morra de fome por 24 horas sob uma atmosfera de nitrogênio.

Uma vez que a mistura de reação tenha atingido a temperatura ambiente, um éter dal gota a gota para a mistura de reação até que a precipitação do produto de poliuretano seja observada. Depois de transferir a mistura de reação para um tubo de centrífuga, centrifugue a solução a 5.300 vezes G por cinco minutos. Após a decantação, o supinato seca à temperatura ambiente até que o solvente evapore.

Em seguida, pesa 200 miligramas de PU 1 34 em uma garrafa de vidro. Diluir a amostra até uma concentração final de 2% em clorofórmio ou clorofórmio e tolueno na proporção de um para um ou tetra roran ou uma combinação de tetra roran anticlorometano. Na proporção de um para um, agitar vigorosamente a solução durante 20 minutos à temperatura ambiente, utilizando um agitador, a uma velocidade de 200 movimentos por minuto, até que a solução se torne homogénea e não se observe precipitado.

Quando terminar, coloque cerca de 15 milímetros de lamínula de vidro quadrada no coter de rotação. Aplique 50 microlitros da solução de PU de um a quatro na lamínula usando uma pipeta, gire cada lamínula por sete segundos a 23 vezes G.Em seguida, seque a lamínula ao ar livre em temperatura ambiente por pelo menos 24 horas antes da esterilização. Neste ponto, irradie gama cada lamínula revestida com polímero aplicando uma dose de 10 cinzas usando um radiador de laboratório por 12 minutos.

Alternativamente, irradie UV cada lamínula revestida com polímero usando uma lâmpada UV de 30 watts por 16 minutos de cada lado. Quando terminar, coloque a lamínula revestida com polímero em uma placa de cultura de tecidos adequada de acordo com o tamanho da lamínula. Depois de cultivar e diferenciar as células-tronco embrionárias humanas, as células destacadas da linha usando reagente de dissociação e reproduzi-las nas lamínulas revestidas com PU 1 34 no nono dia do processo de diferenciação na presença de microscopia eletrônica de varredura de meio livre sérico.

Imagens das diferentes lamínulas de vidro revestidas mostram que o revestimento com tolueno ou clorofórmio não era homogêneo, demonstrando um revestimento irregular com precipitação PE 1 34. Em contraste, o tetraedro permitiu o revestimento giratório de uma superfície muito mais uniforme. Além disso, a análise de microscopia de força atômica dos diferentes revestimentos poliméricos mostra uma redução de 40% na rugosidade de P 1 34 solubilizado em tetra hidro furina em comparação com outros solventes, demonstrando um revestimento de PU 1 34 mais uniforme uma aplicação biológica A diferenciação do endoderma hepático foi induzida e, no nono dia, células semelhantes a hepato blastos foram aparentes com a maioria das células expressando citoqueratina 19 alfa feta e fator nuclear de hepatócitos para alfa e baixos níveis de albumina como medida da função metabólica.

A função do citocromo P quatro 50 foi avaliada quatro dias após a replaqueagem em diferentes superfícies revestidas com polímero. Foi observado um aumento de duas vezes na atividade metabólica nas células replaqueadas em superfícies revestidas com tetra hydro fure mpu 1 3 4. Esses resultados demonstram que a atividade metabólica de hepatócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas é melhorada com uma face de revestimento P 1 34 mais uniforme A imagem de contraste não mostrou diferenças grosseiras após a irradiação UV ou gama, o que foi confirmado pela análise de microscopia eletrônica de varredura.

Hepatócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas replaqueados em lamínulas de vidro revestidas com PU 1 34 irradiadas por gama exibiram um aumento de três vezes na atividade do CYP três a em relação às células replaqueadas em lamínulas de vidro revestidas com PU 1 34 irradiadas por UV. Essas observações demonstram que a radiação gama é a técnica de esterilização ideal. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar a homogeneidade do revestimento entre diferentes CLOs de revestimento giratório, e não se esqueça de que trabalhar com instrumentação de solventes químicos pode ser extremamente perigoso.

Aplicações como o uso de óculos de segurança devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.