Name: Estabilização hepatocelular Fenótipo Usando superfícies sintéticas otimizados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a otimizar superfícies revestidas com polímero para cultura estável de hepatócitos derivados de células-tronco humanas. Este método utiliza síntese de poliuretano e técnicas de spin coating para preservar o fenótipo celular.

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DCH, MB e FK foram apoiados por uma Siga EPSRC no Fundo. BL-V e DS foram todos suportados pela MRC studentships doutoramento. KC foi apoiado pelo financiamento da Plataforma Medicina Regenerativa Reino Unido.

1. Síntese de PHNGAD (Poli [1,6-hexanodiol / neopentilglicol / di (etileno-glicol) de ácido adípico--alt] diol) <img alt="Esquema 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme1.jpg" width="500" /> Esquema 1: Síntese de PHNAGD Representação esquemática da síntese de PHNAGD.. PHNAGD foi preparado pela reacção de 1,6-Hexanodiol, dietilenoglicol, neoppentyl glicol e ácido adípico. PHNAGD, Poli [1,6-hexanodiol / neopentilglicol / di (etileno-glicol) de ácido adípico--alt] diol. <ol><li> Aplicar um tratamento de calor para os monómeros de 1,6-hexanodiol, di (etileno-glicol) e neopentil glicol a 40 ° C durante 48 horas num forno de vácuo para remover qualquer água residual. Deixa-se a frio até a temperatura ambiente sob vácuo. </li><li> Adicionar 22 mmoles de cada monómero e ácido adípico (55 mmol) a um balão de fundo redondo de duas tubuladuras equipado com uma barra de agitação e ligado a um aparelho de Dean-Stark. </li><li> Coloque todo o conjunto sob vácuo e aquecer lentamente a ABLssware a 40 ° C durante 6 horas, a fim de evitar qualquer possibilidade de absorção de humidade, durante a adição do produto químico para o balão. </li><li> Adicionar através de uma seringa, gota a gota, 0,0055 mole do catalisador de titânio (IV), butóxido de potássio. </li><li> Agita-se a mistura de reacção a 180 ° C, sob uma atmosfera de N 2 durante 24 h, e recolher a água residual na armadilha de Dean-Stark. Permitir que o produto a arrefecer até à temperatura ambiente. </li></ol> 2 Síntese de PU134 <img alt="Esquema 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme2.jpg" width="500" /> Esquema 2: Síntese de PU134 Representação esquemática da síntese de poliuretano PU134 134 foi preparado através da reacção de 1,0 equivalentes de um PHNGAD com 2,0 equiv de um 4,4 &#39;-metilenobis (fenil-isocianato), seguido pela adição de 1,0. equiv de um extensor de cadeia de 1,4-butanodiol. <ol><li> Misturar um equivalente do poliol PHNGAD (Mn ~ 1800 Da, 3,2 mmol) com dois equivalentes de 4&#39;4-metilenobis (fenil isocianato) (6,4 mmol) em N, N-dimetilformamida (12 ml). </li><li> Agita-se a mistura de reacção a 70 ° C, sob uma atmosfera de N 2. </li><li> Adicionar através de uma seringa, gota a gota, o catalisador de titânio (IV), butóxido de potássio (0,8% em peso). </li><li> Após 1 hora, adicionar um equivalente do extensor de cadeia de 1,4-butanodiol (3,2 mmol). Aumentar a temperatura a 90 ° C e agita-se durante 24 horas sob uma atmosfera de N 2. </li><li> Após a reacção, recolher o poliuretano por precipitação por adição de éter dietílico (hexano ou água pode também ser usado), gota a gota para a solução reaccional até a precipitação ocorre. </li><li> Centrifuga-se a solução a 5300 xg durante 5 min. </li><li> Decantar o sobrenadante e secar a 40 ° C num forno de vácuo até que o solvente se evapora. Nota: A fim de garantir que o produto final da reacção possuem os parâmetros de correcção relativos à distribuição do peso molecular, o grou funcionalps do polímero, e as temperaturas de fusão e de transição vítrea, de várias técnicas e métodos de análise pode ser utilizado, tais como a cromatografia de permeação em gel ou espectrometria de FITR. </li></ol> 3 Preparação de Soluções PU134 <ol><li> Pesar 200 mg de PU134 em uma garrafa de vidro. </li><li> Diluir PU134 para uma concentração final de 2% de uma série de solventes: clorofórmio, uma combinação de clorofórmio e de tolueno na proporção 1: 1, tetra-hidrofurano, e uma combinação de tetra-hidrofurano e diclorometano na proporção 1: 1. Nota: A escolha do solvente direita varia dependendo do polímero a ser usado. Diferentes solventes possuem diferentes pontos de ebulição, que podem afectar a solubilização do polímero. </li><li> Agitar a suspensão vigorosamente durante 20 min à temperatura ambiente usando um agitador a uma velocidade de 200 mot / min, até a solução se tornar homogénea e é observado nenhum precipitado. </li></ol> 4 Revestimento de Vidro Slides com PU134 <ol><li> Coloque uma rouDN 15 mm 2 lamela no aplicador de rotação. </li><li> Aplicar 50 ul da solução a cada PU134 usando uma pipeta. Ajustar o volume da solução em conformidade PU134 para o tamanho lamela necessário manter o volume à superfície relação proporcional. </li><li> Gire cada lamela de 7 seg a 23 x g. </li><li> Ar lamela seco à temperatura ambiente durante pelo menos 24 horas antes da esterilização. </li></ol> 5. Irradiação de Coverslip <ol><li> Gamma-irradiar polímero lamela revestida através da aplicação de uma dose de 10 Grays utilizando um irradiador de laboratório durante 12 min. </li><li> UV irradiar polímero revestido lamela usando a 30 W, lâmpada UV por 16 min cada lado. </li><li> Coloque a lamela revestida com polímero em uma placa de cultura de tecido apropriado de acordo com o tamanho do diapositivo. </li></ol> 6. Microscopia Eletrônica de Varredura <ol><li> Ouro revestimento por pulverização catódica lamela polímero para 200 segundos em uma atmosfera de 5 x 10 -1 milibares de pressão. </li><li> Capture a micrographs da lamela polímero revestido usando um microscópio eletrônico de varredura em uma tensão de aceleração de 20 kV em modo de imagem de elétrons secundários. </li></ol> 7. Observações Microscopia de Força Atômica <ol><li> Digitalizar uma área de 20 x 20 um de a superfície do polímero. </li><li> Configurar uma taxa de varredura de 1,32 Hz a 1,60 Hz. </li><li> Configure uma resolução de 512 x 512 pixels na região digitalizada. </li><li> Calcular a raiz quadrada da média (RMS ou QR) do revestimento usando a média dos desvios de altura retirados do plano médio de dados de imagem, expressa como: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq1.jpg" width="123" /> Quando Zi é o valor actual Z, e N é o número de pontos dentro da área dada. </li><li> 7.5 Calcule o desvio ou média rugosidade da superfície (Ra) da imagem, usando, <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq2.jpg" width="154" /> Quando Z (x) é a função que descreve tele superfície perfil analisados ​​em termos de altura (Z) e posições (x) da amostra ao longo do comprimento de avaliação de &quot;L&quot;. Ra representa o valor médio da superfície em relação ao plano central. </li></ol> 8 Cultura e diferenciação celular <ol><li> Cultura e diferenciar o humano linha de células-tronco embrionárias (hESC) H9, conforme descrito no Hay 17. </li><li> Separar as células utilizando um reagente de dissociação e replate los para PU134 lâminas revestidas no Dia 9 do processo de diferenciação, na presença de um meio isento de soro como descrito no Szkolnicka 18,19. Nota: O uso de uma célula de dissociação enzimática é preferido ao descolamento celular física. </li></ol> 9. citocromo P450 Ensaio Funcional <ol><li> Medir a actividade do CYP3A seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Incubar hESC hepatócitos derivados no dia 13 ou no dia 19, e meios de comunicação, sem células - como controle negativo, com o substr apropriadocomeu durante 5 horas a 37 ° C. </li><li> Colete sobrenadantes de células e meios de comunicação, realizar o ensaio de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Medir o nível de actividade de CYP e normalizada em relação à área de superfície (2 cm). </li></ol> 10. Imunocoloração <ol><li> Lavar células estaminais embrionárias humanas hepatócitos derivados com PBS, durante 1 min, repetir duas vezes. </li><li> Adicionar gelo frio 100% de metanol para fixar as células, em lugar de -20 ° C durante 10 min. </li><li> Lavar as células com PBS durante 5 minutos e repetir duas vezes. </li><li> Incubar as células com PBS / T (0,1% de tween) / 10% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar a solução de PBST e adicionar o anticorpo primário adequado diluídos em PBS / T (0,1% de tween) / BSA a 1%, incubar a 4 ° C com agitação suave S / N. </li><li> Lavar as células com PBS / T (0,1% de tween) / BSA a 1% durante 5 minutos e repetir três vezes. </li><li> Diluir o anticorpo apropriado em PBS / T (0,1% de tween) / BSA a 1%, adicionar às células e incuba-se no escuro à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação suave. </li><li> Lavar as células com PBS durante 5 minutos e repetir três vezes. </li><li> Adicionar MOWIOL 488 (contendo DAPI 1: 1000) a cada poço, adicione uma lamela suavemente para reduzir o número de bolhas de ar. Loja células fixas, a 4 ° C no escuro. Observe a coloração utilizando um microscópio com filtro apropriado e lâmpada fluorescente. Os anticorpos primários e secundários optimizados estão listadas na Tabela 1. </li></ol>

<ol><li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+of+HNF4%CE%B1+regulates+protein+stability+and+hepatocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).</li>
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<li>Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+UV+radiation+on+the+semi-interpenetrating+polymer+networks+based+on+polyurethane+and+epoxy+maleate+of+bisphenol+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobilogy+A%3A+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A.</a> Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).</li>
<li>Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blistering+and+degradation+of+polyurethane+coatings+under+different+accelerated+weathering+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests.</a> Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).</li>
</ol>

DCH é CSO, Diretor, fundador e acionista da FibromEd Products Ltd. MB e JPI são acionistas fundadores em FibromEd Products Ltd.

Muitos dos actuais métodos utilizados para gerar células estaminais a partir de hepatócitos de confiar em matrizes indefinidas de origem animal. Estes substratos podem ser caros e altamente variável, afetando a função celular e estabilidade, o que representa uma barreira significativa à aplicação. Por isso, foi realizada uma triagem dos materiais sintéticos que apoiam a cultura de células-tronco derivadas de hepatócitos. Foram identificadas, um poliuretano simples (PU134), formada por polimerização de PHNGAD, MDI e um e...

Os materiais biológicos têm sido amplamente utilizados para a manutenção e diferenciação de células estaminais pluripotentes 1. Enquanto permitindo, estes substratos biológicos, muitas vezes contêm uma infinidade de componentes indefinidos. Matrigel é um substrato comumente usado para a cultura e diferenciação de células-tronco. Infelizmente, a sua composição variável influencia a função de células e fenótipo. Apesar de uma variedade de matrizes biológicas alternativas, mais definidos foram utilizados 2-7, a sua origem animal ou pobre escalabilidade os torna candidatos inadequados para o fabrico industrial. Portanto, a identificação de alternativas sintéticas, com composição definida e desempenho de confiança, são objetivos-chave na investigação sobre células estaminais. Numa tentativa de ultrapassar as limitações dos substratos de cultura celular indefinido, a colaboração entre interdisciplinar da química e da biologia identificaram materiais sintéticos com a capacidade para suportar o fenótipo da célula. Synthsubstratos etic são escaláveis, de baixo custo, e podem ser fabricados em estruturas 3D complexas, imitando o ambiente in vivo. Devido a estas propriedades de substratos sintéticos têm sido amplamente utilizados para suportar e conduzir a diferenciação de muitos tipos de células 8-10. Ensaios avançadas e de alto rendimento têm facilitado a rápida triagem de materiais sintéticos, a partir de grandes bibliotecas, e entregues novos materiais com propriedades flexíveis com larga aplicação em pesquisa e desenvolvimento 11-13 biomédica. Utilizando alto rendimento, tecnologia de rastreio de polímero de micro-arranjo, que rapidamente identificado um poliuretano simples (PU134), adequado para a manutenção de células estaminais derivadas de hepatócitos humanos. Este polímero verificou-se ser superior a substratos derivados de animais no que diz respeito à função e diferenciação de hepatócitos 14-16. Temos posteriormente otimizado o processo de condições de revestimento, topografia e esterilização para acessar efeitossobre o desempenho do polímero de estabilização da função de hepatócitos e tempo de vida. Isto tem implicações significativas no que diz respeito à compreensão de fundamentos da biologia dos hepatócitos para modelagem baseada em células e aplicações de medicina regenerativa. A tecnologia aqui descrita representa um exemplo de como a superfície de um polímero sintético pode ser optimizado para preservar fenótipo celular. Acreditamos que a combinação desta tecnologia com um protocolo de diferenciação de hepatócitos sem soro eficiente tem o potencial de proporcionar uma produção escalável de hepatócitos para uso em modelagem in vitro e medicina regenerativa.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Síntese, preparação, revestimento e caracterização de lamínulas revestidas com polímero PU134</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Edmun B&uuml; Irradiador hler</td><td>KS-15</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CIS Biointernational</td><td>IBL 637&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Revestimento Especializado</td> <td>Spin Coater</td><td>P-6708</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Varredura&nbsp;</td><td>Microscópio</td><td>de</td> força atômica Philips XL30CPSEM <td></td></tr><tr><td></td><td>DimensionV Nanoscópio, VEECO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p4-GLO CYP3A4</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada UV</td><td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoScope software de análise</td><td>VEECO</td><td></td><td>versão 1.20</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Olympus</td><td>TH45200</td><td>Use o software Volocity 4</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos</td><td>Corning, Reino Unido&nbsp;</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de vidro</td><td>Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>MIC3308</td><td></td></tr><tr><td>Dietilenoglicol</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>93171</td><td></td></tr><tr><td>1,6-hexanodiol</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>240117</td><td></td></tr><tr><td>Neopentil glicol</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>408255</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Adípico</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>anidro N,N-Dimetilformamida</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>éter dietílico</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>676845</td><td></td></tr><tr><td>butóxido de titânio (IV)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>244112</td><td></td></tr><tr><td>1,4-butanodiol&nbsp;</td><td>Sigma&ndash; Forno</td><td>a vácuo Aldrich 493732</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4'-Metilenobis(isocianato fenil)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>101688</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Revestidor de pulverização catódica</td><td>Bal-Tec SCD 050</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><forte>Imunocoloração</forte></td></tr><tr><td>Tampão fosfato salina (-MgCl2, -CaCl2)</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Armazene à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>PBST, PBS composto com 0,1% TWEEN 20&nbsp;</td><td>&nbsp; Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>Ltda EC607&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>&nbsp; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>CHE5010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich, Reino Unido</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MOWIOL 488 DAPI</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>Feito em Tris HCl e glicerol de acordo com as instruções</td></tr><tr> do fabricante<td colspan="4">Cultura celular e ensaio funcional</td></tr><tr><td>CYP3A atividade pGLO kit</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozyme</td><td>Gibco</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>TryLE express</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12604013">12604013</a></td><td></td></tr></tbody></table>

estabilização hepatocelular fenótipo usando superfícies sintéticas otimizados

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Atualmente, uma das principais limitações da biologia celular é manter o fenótipo celular diferenciado. As matrizes biológicas são comumente usadas para cultivar e manter hepatócitos derivados de células-tronco primárias e pluripotentes. Embora as matrizes biológicas sejam úteis, elas permitem a cultura de hepatócitos a curto prazo, limitando sua aplicação generalizada. Tentamos superar as limitações usando um revestimento de polímero sintético. Os polímeros representam uma das mais amplas classes de biomateriais e possuem uma ampla gama de propriedades mecânicas, físicas e químicas, que podem ser ajustadas para o propósito. É importante ressaltar que esses materiais podem ser dimensionados para padrões de qualidade garantida e exibir consistência lote a lote. Isso é essencial para que as células sejam expandidas para triagem de alto rendimento na indústria de testes farmacêuticos ou para terapia baseada em células. Os poliuretanos (PUs) são um grupo de materiais que se mostraram promissores na cultura de células. Nosso progresso recente na otimização de uma superfície revestida de poliuretano, para cultura de longo prazo de hepatócitos humanos exibindo fenótipo estável, é apresentado e discutido.

Solvente de polímero influencia a topografia da superfície de polímero revestido Poliuretano 134 foi solubilizado em clorofórmio, quer isoladamente ou em combinação com tolueno ou tetra-hidrofurano ou diclorometano, e as lâminas de vidro de spin-revestidos com as diferentes formulações. A microscopia electrónica de varrimento (SEM) e de microscopia de força atómica (AFM), foram utilizados para caracterizar as propriedades físicas dos revestimentos de polímeros (Figur...

Este artigo irá focar no desenvolvimento de superfícies de polímeros revestido de longo prazo, estável cultura de células-tronco derivadas de hepatócitos humanos.

Estabilização hepatocelular Fenótipo Usando superfícies sintéticas otimizados

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

O objetivo geral deste procedimento é otimizar superfícies revestidas com polímero para preservar o cultivo estável de hepatócitos humanos derivados de células-tronco a longo prazo. Isso é realizado primeiramente sintetizando o poliuretano 1 3 4 ou PU 1 3 4. O segundo passo é escolher o solvente adequado para solubilizar o PU 1 34.Em seguida, otimiza-se o processo de revestimento por centrifugação com o PU 1 3 4 sobre a lamínula de vidro. O passo final é a otimização do procedimento de esterilização das lamínulas de vidro revestidas com o polímero P 1 34, seguida, por fim, por microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica e metabolismo de fármacos. Ensaios são utilizados para demonstrar a influência do revestimento com o polímero PU 1 34 na função de hepatócitos derivados de células-tronco.A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como o uso de matrizes em cultura para manter células-tronco potentes com características de hepatócitos, é que esses materiais sintéticos podem ser ajustados com precisão conforme a finalidade e produzidos em escala segundo padrões assegurados de qualidade. Além disso, apresentam consistência entre lotes. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento de doenças hepáticas, pois representam um exemplo de como a superfície de um polímero sintético pode ser otimizada para preservar o fenótipo celular.O procedimento será demonstrado pelo Dr. Jeffrey Walton, pós-doutorando do meu laboratório. Antes de iniciar este procedimento, aplique um tratamento térmico ao mono-1,6-hexanodiol, dialcoxi dietilenoglicol e neopentilglicol a 40 graus Celsius por 48 horas em uma estufa a vácuo para remover qualquer água residual. Adicione 22 milimols de cada monômero e 55 milimols de ácido dpic a um frasco redondo de duas entradas conectado a um aparato Dean-Stark e equipado com um agitador magnético.Após isso, coloque todo o conjunto sob vácuo e aqueça suavemente o material de vidro a 40 graus Celsius por seis horas para evitar qualquer absorção de umidade durante a adição do reagente ao frasco. Após remover o conjunto do forno e colocar o sistema sob nitrogênio, adicione 0,0055 mols do catalisador dióxido de titânio(IV) gota a gota por meio de uma seringa ao frasco. Agite a mistura reacional a 180 graus Celsius por 24 horas, coletando a água residual no armadilho de Dean-Stark.Deixe o produto esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, misture 3,2 milimol, ou um equivalente do poliol P-H-N-G-A-G, com 6,4 milimol, ou dois equivalentes, de 4,4'-metileno-bisfenil diisocianato em 12 mililitros de DML anidro, em um balão de fundo redondo com duas entradas conectado a um aparato de Dean-Stark e equipado com uma barra de agitação magnética.Agite a mistura de reação a 70 graus Celsius sob atmosfera de nitrogênio. Em seguida, adicione o catalisador dióxido de titânio gota a gota por meio de seringa até uma concentração final de 0,8%. Após uma hora, adicione um equivalente do extensor de cadeia 1,4-butanodiol para obter o produto do copolímero. Aumente a temperatura para 90 graus Celsius e mantenha a reação por 24 horas sob atmosfera de nitrogênio.Uma vez que a mistura de reação tenha atingido a temperatura ambiente, adicione éter dietílico gota a gota à mistura de reação até que seja observada a precipitação do produto de poliuretano. Após transferir a mistura de reação para um tubo de centrífuga, centrifugue a solução a 5.300 × g durante cinco minutos. Após a decantação, seque o sobrenadante à temperatura ambiente até que o solvente evapore.Em seguida, pese 200 miligramas de PU 1 34 em um frasco de vidro. Dilua a amostra até uma concentração final de 2% em clorofórmio ou em uma mistura de clorofórmio e tolueno na proporção de um para um, ou em tetra roran ou uma combinação de tetra roran e clorometano na proporção de um para um. Agite vigorosamente a solução por 20 minutos à temperatura ambiente, utilizando um agitador com velocidade de 200 movimentos por minuto, até que a solução fique homogênea e nenhum precipitado seja observado.Quando terminar, coloque um cubre-objeto de vidro quadrado de aproximadamente 15 milímetros no spin coter. Aplique 50 microlitros da solução PU um a quatro no cubre-objeto utilizando uma pipeta, girando cada cubre-objeto por sete segundos a 23 vezes G. Em seguida, deixe o cubre-objeto secar ao ar à temperatura ambiente por pelo menos 24 horas antes da esterilização. Neste ponto, irradie com raios gama cada cubre-objeto revestido com polímero aplicando uma dose de 10 grays usando um irradiador de laboratório durante 12 minutos.Alternativamente, irradie cada lamínula revestida com polímero utilizando uma lâmpada UV de 30 watts durante 16 minutos em cada lado. Ao finalizar, coloque a lamínula revestida com polímero em uma placa de cultura de tecidos apropriada, de acordo com o tamanho da lamínula. Após o cultivo e a diferenciação das células da linhagem de células-tronco embrionárias humanas, desprende as células com reagente de dissociação e replante-as sobre as lamínulas revestidas com PU 1 34 no nono dia do processo de diferenciação, na presença de meio livre de soro, para microscopia eletrônica de varredura.Imagens dos diferentes lamínulas de vidro revestidas mostram que o revestimento com tolueno ou clorofórmio não foi homogêneo, demonstrando uma cobertura irregular com precipitação de PE 1 34. Em contraste, o tetrahidrofurano permitiu o revestimento por centrifugação de uma superfície muito mais uniforme. Além disso, a análise por microscopia de força atômica dos diferentes revestimentos poliméricos mostra uma redução de 40% na rugosidade do P 1 34 solubilizado em tetrahidrofurano em comparação com outros solventes, demonstrando um revestimento de PU 1 34 mais uniforme. Em uma aplicação biológica, a diferenciação do endoderma hepático foi induzida e, no nono dia, células semelhantes a hepatoblastos estavam aparentes, com a maioria das células expressando citoceratina 19, alfafetoproteína e fator nuclear de hepatócito 4 alfa, além de baixos níveis de albúmina como medida da função metabólica.A função da citocromo P450 foi avaliada quatro dias após o replante em diferentes superfícies revestidas com polímeros. Foi observado um aumento de duas vezes na atividade metabólica em células replantadas em superfícies revestidas com tetrahidrofuranopoli(1,3,4). Esses resultados demonstram que a atividade metabólica de hepatócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas é melhorada com um revestimento P134 mais uniforme. A imagem de contraste não revelou diferenças grosseiras após irradiação com UV ou gama, o que foi confirmado adicionalmente por análise de microscopia eletrônica de varredura.Hepatócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas replatados em lamínulas de vidro revestidas com PU 1 34 irradiadas por raios gama exibiram um aumento de três vezes na atividade da CYP 3A em comparação com células replatadas em lamínulas de vidro revestidas com PU 1 34 irradiadas por UV. Essas observações demonstram que a irradiação gama é a técnica de esterilização ideal. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar a homogeneidade do revestimento entre diferentes CLOs submetidos ao revestimento por rotação, e não se esqueça de que trabalhar com solventes químicos e instrumentação pode ser extremamente perigoso.Aplicações como o uso de óculos de segurança devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

stabilizing-hepatocellular-phenotype-using-optimized-synthetic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

O método aqui apresentado descreve um sistema de diferenciação -Ready escalável e boas práticas de fabrico (BPF) para gerar células de hepatócitos-like humanos a partir de células-tronco pluripotentes. Ele serve como um sistema eficaz e padronizado para gerar células de hepatócitos-like humanos para a pesquisa básica e aplicada fígado humano.

Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

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Este protocolo descreve uma abordagem semi-automática para produzir células hepatócito de células-tronco pluripotentes humanas em um formato de 96 placa bem. Este processo é rápida e econômica, permitindo que a produção de qualidade assegurada lotes de hepatócitos células para pesquisa humana básica e aplicada.

Produção semi-automática do hepatócito como células de células-tronco pluripotentes

Este protocolo descreve uma aproximação para produzir hepatospheres das pilhas de haste pluripotentes humanas usando um sistema de cultura definido e um self-assembly da pilha. Este protocolo é reprodutível em um número de linhas de pilha, cost-effective e permite a produção de hepatospheres humanos estáveis para a aplicação biomédica.

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O objetivo deste artigo é fornecer uma abordagem padronizada para induzir a diferenciação de progenitor hepático humano das células-tronco pluripotentes. O desenvolvimento deste procedimento com formulações de mídia prontas para uso oferece ao usuário um sistema fácil de gerar células hepáticas humanas para pesquisa biomédica e tradução.

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Um sistema de cultura organoide 3D ex vitro de longo prazo foi estabelecido a partir de hepatócitos de camundongos. Esses organoides podem ser passagemdos e geneticamente manipulados por infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9.

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Os hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes podem ser purificados por meio da classificação celular, usando uma combinação de coloração mitocondrial e molécula de adesão de células leucocitárias ativadas (ALCAM, também conhecida como CD166).

Aplicação de coloração de mitocôndrias vivas na classificação de células para purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

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Um Sistema de Cultura Hepática Totalmente Humano para Aplicações no Desenvolvimento de Fármacos

Aprenda a otimizar superfícies revestidas com polímero para cultura estável de hepatócitos derivados de células-tronco humanas. Este método utiliza síntese de poliuretano e técnicas de spin coating para preservar o fenótipo celular.

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