Estabilização hepatocelular Fenótipo Usando superfícies sintéticas otimizados

O objetivo geral deste procedimento é otimizar superfícies revestidas com polímero para preservar o cultivo estável de hepatócitos humanos derivados de células-tronco a longo prazo. Isso é realizado primeiramente sintetizando o poliuretano 1 3 4 ou PU 1 3 4. O segundo passo é escolher o solvente adequado para solubilizar o PU 1 34.

Em seguida, otimiza-se o processo de revestimento por centrifugação com o PU 1 3 4 sobre a lamínula de vidro. O passo final é a otimização do procedimento de esterilização das lamínulas de vidro revestidas com o polímero P 1 34, seguida, por fim, por microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica e metabolismo de fármacos. Ensaios são utilizados para demonstrar a influência do revestimento com o polímero PU 1 34 na função de hepatócitos derivados de células-tronco.

A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como o uso de matrizes em cultura para manter células-tronco potentes com características de hepatócitos, é que esses materiais sintéticos podem ser ajustados com precisão conforme a finalidade e produzidos em escala segundo padrões assegurados de qualidade. Além disso, apresentam consistência entre lotes. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento de doenças hepáticas, pois representam um exemplo de como a superfície de um polímero sintético pode ser otimizada para preservar o fenótipo celular.

O procedimento será demonstrado pelo Dr. Jeffrey Walton, pós-doutorando do meu laboratório. Antes de iniciar este procedimento, aplique um tratamento térmico ao mono-1,6-hexanodiol, dialcoxi dietilenoglicol e neopentilglicol a 40 graus Celsius por 48 horas em uma estufa a vácuo para remover qualquer água residual. Adicione 22 milimols de cada monômero e 55 milimols de ácido dpic a um frasco redondo de duas entradas conectado a um aparato Dean-Stark e equipado com um agitador magnético.

Após isso, coloque todo o conjunto sob vácuo e aqueça suavemente o material de vidro a 40 graus Celsius por seis horas para evitar qualquer absorção de umidade durante a adição do reagente ao frasco. Após remover o conjunto do forno e colocar o sistema sob nitrogênio, adicione 0,0055 mols do catalisador dióxido de titânio(IV) gota a gota por meio de uma seringa ao frasco. Agite a mistura reacional a 180 graus Celsius por 24 horas, coletando a água residual no armadilho de Dean-Stark.

Deixe o produto esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, misture 3,2 milimol, ou um equivalente do poliol P-H-N-G-A-G, com 6,4 milimol, ou dois equivalentes, de 4,4'-metileno-bisfenil diisocianato em 12 mililitros de DML anidro, em um balão de fundo redondo com duas entradas conectado a um aparato de Dean-Stark e equipado com uma barra de agitação magnética.

Agite a mistura de reação a 70 graus Celsius sob atmosfera de nitrogênio. Em seguida, adicione o catalisador dióxido de titânio gota a gota por meio de seringa até uma concentração final de 0,8%. Após uma hora, adicione um equivalente do extensor de cadeia 1,4-butanodiol para obter o produto do copolímero. Aumente a temperatura para 90 graus Celsius e mantenha a reação por 24 horas sob atmosfera de nitrogênio.

Uma vez que a mistura de reação tenha atingido a temperatura ambiente, adicione éter dietílico gota a gota à mistura de reação até que seja observada a precipitação do produto de poliuretano. Após transferir a mistura de reação para um tubo de centrífuga, centrifugue a solução a 5.300 × g durante cinco minutos. Após a decantação, seque o sobrenadante à temperatura ambiente até que o solvente evapore.

Em seguida, pese 200 miligramas de PU 1 34 em um frasco de vidro. Dilua a amostra até uma concentração final de 2% em clorofórmio ou em uma mistura de clorofórmio e tolueno na proporção de um para um, ou em tetra roran ou uma combinação de tetra roran e clorometano na proporção de um para um. Agite vigorosamente a solução por 20 minutos à temperatura ambiente, utilizando um agitador com velocidade de 200 movimentos por minuto, até que a solução fique homogênea e nenhum precipitado seja observado.

Quando terminar, coloque um cubre-objeto de vidro quadrado de aproximadamente 15 milímetros no spin coter. Aplique 50 microlitros da solução PU um a quatro no cubre-objeto utilizando uma pipeta, girando cada cubre-objeto por sete segundos a 23 vezes G. Em seguida, deixe o cubre-objeto secar ao ar à temperatura ambiente por pelo menos 24 horas antes da esterilização. Neste ponto, irradie com raios gama cada cubre-objeto revestido com polímero aplicando uma dose de 10 grays usando um irradiador de laboratório durante 12 minutos.

Alternativamente, irradie cada lamínula revestida com polímero utilizando uma lâmpada UV de 30 watts durante 16 minutos em cada lado. Ao finalizar, coloque a lamínula revestida com polímero em uma placa de cultura de tecidos apropriada, de acordo com o tamanho da lamínula. Após o cultivo e a diferenciação das células da linhagem de células-tronco embrionárias humanas, desprende as células com reagente de dissociação e replante-as sobre as lamínulas revestidas com PU 1 34 no nono dia do processo de diferenciação, na presença de meio livre de soro, para microscopia eletrônica de varredura.

Imagens dos diferentes lamínulas de vidro revestidas mostram que o revestimento com tolueno ou clorofórmio não foi homogêneo, demonstrando uma cobertura irregular com precipitação de PE 1 34. Em contraste, o tetrahidrofurano permitiu o revestimento por centrifugação de uma superfície muito mais uniforme. Além disso, a análise por microscopia de força atômica dos diferentes revestimentos poliméricos mostra uma redução de 40% na rugosidade do P 1 34 solubilizado em tetrahidrofurano em comparação com outros solventes, demonstrando um revestimento de PU 1 34 mais uniforme. Em uma aplicação biológica, a diferenciação do endoderma hepático foi induzida e, no nono dia, células semelhantes a hepatoblastos estavam aparentes, com a maioria das células expressando citoceratina 19, alfafetoproteína e fator nuclear de hepatócito 4 alfa, além de baixos níveis de albúmina como medida da função metabólica.

A função da citocromo P450 foi avaliada quatro dias após o replante em diferentes superfícies revestidas com polímeros. Foi observado um aumento de duas vezes na atividade metabólica em células replantadas em superfícies revestidas com tetrahidrofuranopoli(1,3,4). Esses resultados demonstram que a atividade metabólica de hepatócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas é melhorada com um revestimento P134 mais uniforme. A imagem de contraste não revelou diferenças grosseiras após irradiação com UV ou gama, o que foi confirmado adicionalmente por análise de microscopia eletrônica de varredura.

Hepatócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas replatados em lamínulas de vidro revestidas com PU 1 34 irradiadas por raios gama exibiram um aumento de três vezes na atividade da CYP 3A em comparação com células replatadas em lamínulas de vidro revestidas com PU 1 34 irradiadas por UV. Essas observações demonstram que a irradiação gama é a técnica de esterilização ideal. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar a homogeneidade do revestimento entre diferentes CLOs submetidos ao revestimento por rotação, e não se esqueça de que trabalhar com solventes químicos e instrumentação pode ser extremamente perigoso.

Aplicações como o uso de óculos de segurança devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.