Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar a instabilidade genômica em linfócitos B de camundongos. Isso é conseguido isolando primeiro as células B para cultura de células primárias. Em seguida, as células são fixadas facilitando a preparação dos spreads metafásicos.

Finalmente, os telômeros PNA fish são realizados para visualização dos telômeros marcados com fluorescência. Em última análise, o nível de vários tipos de aberrações cromossômicas pode ser quantificado por microscopia fluorescente. As implicações dessa técnica podem ampliar nossa compreensão das vias de reparo do DNA, pois podem ajudar a identificar genes que promovem a estabilidade genômica em nossos modelos de camundongos direcionados.

Embora esse método possa fornecer informações sobre quebras cromossômicas e outros grandes rearranjos cromossômicos, ele também pode ser adaptado para medir outras formas de instabilidade genômica, como translocações. Para isolar as células B, comece colocando um baço recém-isolado em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo dois mililitros de tampão de lavagem em uma capela de fluxo laminar. Em seguida, use a extremidade traseira do êmbolo de uma seringa de cinco mililitros para macerar suavemente o baço.

Em seguida, filtre a pasta de tecido através de um filtro de malha de náilon de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros usando o êmbolo para pressionar suavemente os pedaços maiores de tecido através do filtro. Enxágue a placa e a seringa com oito mililitros de tampão de lavagem e filtre a lavagem pelo filtro. Então, depois de girar as células, pipete o pellet para cima e para baixo algumas vezes em três mililitros de um tampão de lise CK.

Após cinco minutos, pare a reação com 10 mililitros de tampão de lavagem. Então, depois de girar as células novamente, bata no fundo do tubo para ressuspender o pellet e adicione um mililitro de tampão de lavagem às células. Em seguida, incube as células com 50 microlitros de microesferas anti CD 43 max no gelo.

Após 30 minutos, lave suavemente as células em 10 mililitros de tampão de lavagem. Durante a centrifugação, coloque uma coluna minimax no ímã e um tubo cônico de 15 mililitros rotulado abaixo da coluna. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem à coluna, coletando o EIT no tubo.

Ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de lavagem e, em seguida, carregue as células na coluna Depois que a amostra passar, lave a coluna com um mililitro de tampão de lavagem e adicione sete mililitros de tampão de lavagem diretamente à amostra coletada. Depois de contar as células coletadas, transfira-as para um tubo de 50 mililitros para centrifugação. Em seguida, para ativar as células B, ressuspenda o pellet de uma vez 10 das seis células por mililitro em meio de células B suplementado e incube as células em seis placas de poços a cinco mililitros de células por poço em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para fixar as células B.

Em seguida, a 50 microlitros de smid para cada um dos poços. Após uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius, transfira as células B para um tubo de 15 mililitros marcado. Cubra a etiqueta com fita adesiva e gire as células.

Em seguida, aspire tudo, exceto cerca de um mililitro de sobrenadante e ressuspenda o pellet por pipetagem. Adicione cinco mililitros de 37 graus Celsius, cloreto de potássio, gota a gota, enquanto pulsa em um vórtice. Em seguida, adicione mais 10 mililitros de cloreto de potássio e misture a solução celular por inversão.

Em seguida, incube as células em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, adicione cinco gotas de fixador fresco misturando mais uma vez invertendo. Em seguida, gire as células após suspender o pellet em um mililitro de sobrenadante, adicione cinco mililitros de fixador fresco, gota a gota enquanto pulsa em um vórtice e incube as células e mais 10 mililitros de fixador à temperatura ambiente.

Após 30 minutos, retire as células e remova todos, exceto um mililitro do fixador. Em seguida, após lavar as células, mais duas vezes em 15 mililitros de fixador, suspenda novamente o pellet nos 70 microlitros finais do sobrenadante. Agora coloque as lâminas rotuladas em um ângulo de 35 graus em uma câmara de umidade ajustada para 22.9 graus Celsius e 52% de umidade.

Coloque 35 microlitros das células B ressuspensas em cada lâmina, preparando duas lâminas por amostra. Depois de deixar as lâminas secarem na câmara de umidade por 30 minutos, armazene-as em uma caixa de lâminas a 37 graus Celsius até que estejam totalmente secas. Depois de seco, use uma caneta de diamante para marcar uma área de 18 por 18 milímetros para hibridização na parte de trás de cada lâmina para desnaturar as lâminas para peixes.

Em seguida, aplique 120 microlitros de amida de forma 70% deionizada em lamínulas de 24 milímetros por 60 milímetros e, em seguida, toque cada lâmina em uma lamínula. Desnature as lâminas em uma placa quente de 80 graus Celsius por 90 segundos e, em seguida, deslize rápida e cuidadosamente as lamínulas e consecutivamente. Coloque as lâminas em 70, 90 e 100% de etanol geladas cada uma por três minutos Depois que as lâminas secarem, coloque-as em uma câmara úmida e aplique a sonda de pré-necessidade Misture nas áreas marcadas nas lâminas.

Cubra a mistura da sonda com uma lamínula de 18 por 18 milímetros e incube as lâminas a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, lave as lâminas em dois XSSC pré-avisados com agitação. Após cinco minutos, aplique 35 microlitros de meio de montagem moyal nas lâminas.

Cubra o meio com lamínulas de 24 milímetros por 60 milímetros e armazene as lâminas a quatro graus Celsius. Finalmente, analise as lâminas metafásicas usando um microscópio de epifluorescência padrão. Os cromossomos metafásicos derivados de uma célula de camundongo devem formar um agrupamento discreto contendo 40 cromossomos.

Cada cromossomo tem um centrômero em uma extremidade, próximo a dois sinais de telômeros, bem como dois sinais de telômeros adicionais na outra extremidade do cromossomo. Quebras de cromátides são quebras em uma das duas cromátides irmãs que compõem cada cromossomo metafásico. Em alguns casos, a extremidade quebrada do cromossomo pode ser observada como um fragmento com sinais de telômeros na mesma propagação metafásica.

Os cromossomos de rádio são rearranjos complexos envolvendo dois cromossomos. Os cromossomos também podem se unir para formar cromossomos dicêntricos, que aparecem como fusões de ponta a ponta de cromossomos com centrômeros em ambas as extremidades. As translocações robertsonianas são um tipo de translocação entre os centrômeros de dois cromossomos, que aparecem como quatro braços cromáticos irmãos ligados a um único centrômero.

Nesta última imagem, é mostrada uma metáfase que não possui sinais de telômeros presentes. A ausência de sinais de telômeros pode ocorrer devido a erros na preparação da sonda ou a bolhas de ar sob a lamínula durante a hibridização. Após esse procedimento, outros métodos, como análise do ciclo celular e informações do cólon, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se o aumento da instabilidade genômica afeta a viabilidade celular.