Name: Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprenda a quantificar instabilidade genômica em linfócitos B de camundongo usando PNA-FISH para visualização de telômeros. Este método permite analisar aberrações cromossômicas por microscopia de fluorescência.

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Este trabalho é apoiado pelo NIH conceder R00 CA160574 (SFB) e por uma bolsa do Programa de Formação Biotecnologia Rutgers (a SMM).

Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional da Universidade Rutgers, a Universidade Estadual de Nova Jersey. Ratos foram tratados de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os cientistas devem consultar as suas organizações nacionais de animais, e institucionais para as diretrizes estabelecidas e aprovadas. Antes de começar, preparar as soluções listadas na Tabela 1. 1. B Isolamento e Ativação Celular Eutanásia um rato usando CO 2, seguida por deslocação cervical. Posicione o mouse para o lado esquerdo do corpo é para cima e pulverizar o mouse com etanol a 70% até a pele está úmida. Dissecar o baço e coloque em um 35 milímetros de cultura de tecidos prato com tampão de lavagem 2 ml. Em uma câmara de fluxo laminar, quebrar-se suavemente o baço em placas de cultura de tecidos utilizando a extremidade plana de uma seringa de 5 ml. <ol><li> Insira uma malha de nylon 70 um em um 50tubo ml e transferir a amostra de baço em 2 ml de tampão de lavagem para a malha de nylon. Suavemente perturbar o baço na malha usando a extremidade plana da seringa. </li><li> Lavar a parte de trás da seringa e a placa 35 mm, com 8 ml de tampão de lavagem e filtrar através de malha de nylon de 70 ^ m. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 ml de tampão de lise ACK. Pipeta-se para baixo e para interromper momentaneamente aglomerados e incubar durante 5 min. Adicionar 10 ml de tampão de lavagem e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet tocando no fundo do tubo, em seguida por pipetagem em 1 ml de tampão de lavagem. Adicionar 50 ul de microesferas anti-CD43 MACS e incubar em gelo durante 30 min. Adicionar 10 ml de tampão de lavagem, agitar suavemente, e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Adicionar 10 ml de tampão de lavagem, agitar suavemente, e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Configurar umaColuna Mini-MACS, colocando uma coluna sobre o ímã MACS. Posicionar um tubo de 15 ml rotulados cónica inferior da coluna. Adicionar 1 ml de tampão de lavagem a coluna e permitir que a atravessam para o tubo de 15 ml. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de tampão de lavagem. Carregar a amostra na coluna depois de o tampão de lavagem foi executado por meio de. </li><li> Depois a amostra foi executado através da coluna, adicionar 1 ml de tampão de lavagem para lavar a coluna. Adicionar 7 ml de tampão de lavagem diretamente para a amostra coletada no tubo de 15 ml. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro. Transferir o volume necessário de células necessárias para a 5000000 células / cavidade em um tubo de 50 ml. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. O suplemento de meio de células B com LPS a 1: 500 e IL4 1: 1000. </li><li> Aspirar o sobrenadante e adicionar o volume apropriado de meio de células B suplementado necessário para a concentração final de um milhão de células / ml. </li><li> Células da placa em placas de 6 poços com 5 ml de células em um milhão de células / ml, e em lugar de um humidified cultura de células incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 2. B Fixação celular <ol><li> Adicionar 50 ul de colcemide a cavidade contendo 5 ml de células B (para uma concentração final de 100 ng / ml) e incubar 1 h a 37 ° C. Pré-aquecer uma solução de KCl 75 mM num banho de água a 37 ° C. Transferir as células B a um tubo de 15 ml marcado. Cobrir a etiqueta com fita e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante deixando 1 ml no tubo e ressuspender o sedimento por pipetagem. Adicionar 5 ml de KCl a queda pré-aquecido a gota ao bater ou pulsando em um vórtice. </li><li> Adicionar 10 ml de KCl e misture invertendo. Incubar em C do banho de água 37 ° C durante 15 min. Adicione 5 gotas de fixador fresco e misture invertendo. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante deixando 1 ml no tubo e ressuspender pellet pipetando para cima e para baixo. </li><li> Adicionar 5 ml de fixador fresco gota a gota, ao bater ou pulsando em um vortex. Adicionar mais 10 ml de fixador e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante deixando 1 ml em tubos e ressuspender por pipetagem. Adicionar 14 ml de fixador fresco e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Repita o passo 2.7 mais duas vezes. </li><li> Adicionar 14 ml de fixador fresco. Selar as tampas com Parafilm e armazenar durante a noite a -20 ° C. </li></ol> 3 Preparação de Metaphase Spreads cromossômicas <ol><li> Definir uma câmara ambiental regulada a 22,9 ° C e 52% de umidade. </li><li> Centrifugar a células B fixa a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar fixador deixando 70 mL no tubo e ressuspender por pipetagem. </li><li> Colocar as lâminas marcadas na câmara de humidade a um ângulo de 35 °. Queda de 35 mL de células B em ressuspensão numa lâmina e soltar duas lâminas por amostra. Permitir que os slides para secar na câmara de umidade por 30 min, em seguida, armazenar os slidesem uma caixa de lâminas a 37 ° C. </li></ol> 4. Telomere PNA FISH <ol><li> Preparação de Sonda <ol><li> Formamida desionizada pré-aquecer a 37 ° C. Misturar 2 uL de sonda ANP telómero com 7 ul de formamida desionizada pré-aquecida e incubar a 37 ° C com agitação durante 1 hora. </li><li> Pré-quente mistura principal FISH para 37 ° C. Adicionar 7 ul de pré-mistura principal aquecido FISH para a mistura a partir do passo 4.1.1 e incubar a 37 ° C durante 1-3 horas. </li><li> Desnaturar a mistura de sonda de 8 min a 80 ° C. Pré-hibridar a sonda durante 1 hora a 37 ° C. </li></ol></li><li> Pré-tratamento de Slides cromossômicas <ol><li> Pré-aquecer um frasco de deslizamento de coloração de vidro contendo 50 ml de HCl 0,01 M a 37 ° C em um banho de água. </li><li> Colocar as lâminas em um frasco de vidro para coloração de deslizamento diferentes contendo 2 x SSC durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2 mL de estoque pepsina ao vidro pré-aquecido slide-coloração frasco e misturar invertendo. Transferir as lâminas para esta sl vidrojar ide-coloração e incubar 90 segundos a 37 ° C. </li><li> Lavam-se as lâminas 2x em um frasco de vidro deslizante coloração diferente contendo 1x PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente, sob agitação. Em seguida, lave as lâminas por 5 min em 1x PBS / MgCl2 à temperatura ambiente, agitando. </li><li> Transferir as lâminas para um frasco de vidro para coloração deslizante contendo recém-preparado formaldeído a 1% / PBS 1x / MgCl2 durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas por 5 min em um frasco de vidro deslizante coloração diferente contendo 1x PBS à temperatura ambiente, agitando. </li><li> Prepara-se uma série de etanol, tendo a desidratação de vidro separada frascos corrediça de coloração que contêm 70%, 90%, e 100% de etanol. </li><li> Transferir as lâminas para cada frasco durante 3 min, começando com 70% de etanol, em seguida etanol a 90%, e em seguida de etanol a 100%. Coloque frascos de etanol a -20 ° C quando terminar. </li><li> Permitir que as lâminas para o ar seco tocando excesso de etanol em uma toalha de papel e apoiando os slides em um ângulo de 35 °. Depois de seco, mark uma área de 18 x 18 mm para a hibridação na parte de trás das lâminas através de uma caneta de diamante. </li></ol></li><li> A desnaturação de Slides para FISH <ol><li> Aplicar formamida 120 mL de 70% deionizada / 2X SSC para uma lamela de 24 x 60 mm. Toque no slide para a lamela. Desnaturar o slide a 80 ° C sobre uma placa quente durante 90 segundos. </li><li> De forma rápida e cuidadosamente deslizar para fora da lamela e colocar a corrediça em gelo frio de etanol a 70% durante 3 min, seguido de etanol a 90%, e 100% de etanol durante 3 minutos cada. Permitir que as lâminas para o ar seco. </li><li> Prepare uma câmara úmida, alinhando uma caixa de plástico com tampa e papel de seda molhado. O papel deve ser úmido, mas não saturado com água. </li><li> Numa câmara húmida, aplicam-se a mistura de sonda de pré-recozido do passo 4.1.3 para a área marcada sobre a lâmina, coberta com uma tampa 18 x 18 mm de deslizamento e incubar a 37 ° C durante 1 hora. </li></ol></li><li> Lavagens de pós-incubação <ol><li> Pré-aquecer a 50% de formamida / 2x SSC, 1x SSC, e 4x SSC / 0,1% de Tween-20 a 45 ° em; C num banho de água. </li><li> Retire cuidadosamente as lamelas e lavar as lâminas em pré-aquecido a 50% formamida / 2x SSC 3xfor 5 min cada, no escuro e tremendo. Lavar as lâminas em pré-aquecido 1x SSC 3xfor 5 min cada, tremendo. Finalmente, lava as lâminas em pré-aquecido 4x SSC / 0,1% de Tween-20 3xfor 5 min cada. </li><li> Coloração das lâminas por 3 min em DAPI em uma luz protegida vidro slide-coloração jar. </li><li> Lavar as lâminas por 5 min em 2x SSC, tremendo. Aplicar 35 l de Mowiol meio de montagem, cubra com 24 x 60 mm lamelas e armazenar os slides a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5 Análise microscópica dos cromossomas <ol><li> Analisar os slides metafase utilizando um microscópio de epi-fluorescência padrão. Use uma plataforma de imagem com uma fase automatizada, como a plataforma MetaSystems Metafer para obter melhores resultados. Para cada metafase, recolher uma imagem de fluorescência para visualizar DAPI cromossomas, e uma imagem com o sinal fluorescente do telómero probe. (Por exemplo, outros Cy3- Fluors estão disponíveis e funcionam igualmente bem.) </li><li> Sobreponha as imagens com um programa de análise de imagem e analisar. </li></ol>

<ol><li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li>
<li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells%2C+ageing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li>
<li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+IgH-TCRalpha%2Fdelta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).</li>
<li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li>
<li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoon%2C+SS+%22Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%22">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH)</a>. Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).</li>
<li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li>
<li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses conflitantes.

Considerando que os linfócitos B activados são particularmente adequados para a preparação de barrar cromossómicas mitóticas, outros tipos de células podem também ser utilizados. Linfócitos T partilhar muitas das vantagens de células B, uma vez que podem ser purificadas a partir dos gânglios linfáticos ou do baço, e têm um elevado índice mitótico, quando estimulada por crescimento em meio contendo mitogénios adequadas 8. As células-tronco embrionárias (células ES) também são adequados para a análise de cromos...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

O cancro é causado pela acumulação de mutações que afectam os genes que regulam o crescimento de células normais. A mutação é uma conseqüência de alterações na estrutura e seqüência do genoma causada por danos ao DNA. Danos do ADN pode ocorrer através de uma variedade de processos, incluindo agentes exógenos, tais como radiação ionizante e, como um subproduto do metabolismo celular normal, tal como a desaminação espontânea de bases de nucleótidos que ocorram danos ou por contacto com espécies de oxigénio reactivas 1. Embora as células de mamíferos possuem uma gama de actividades de reparação, que pode reverter danos ao DNA ou restaurar a seqüência em locais de quebra, no entanto, mutações se acumulam ao longo do tempo de vida de uma célula. Danos de DNA pode, além disso, contribuir para a senescência e a perda de potência de células-tronco, dois processos que estão associados com a doença associada ao envelhecimento 2. Compreender a reparação de danos ao DNA é, portanto, de importância central na abordagem de dois sinalquestões ificant em saúde pública. Uma evidência crescente sugere que as vias de reparação do ADN de mamíferos pode contribuir para a evolução do genoma de células de cancro de 3,4, o que torna ainda mais fundamental para compreender os processos envolvidos na supressão da mutação a nível molecular. A visualização direta de aberrações cromossômicas é um meio poderoso e quantitativos de determinar a extensão da instabilidade genômica em um tipo particular de célula. Cromossomos condensados ​​de células em metáfase pode ser isolado e inspecionados utilizando luz ou microscopia fluorescente. Tais abordagens citogenéticas têm sido, na prática há várias décadas e pode ser utilizado para demonstrar a aparência de translocação ou de determinados tipos de aberrações cromossómicas relacionadas com a perda de actividade de reparação de ADN. O protocolo presta-se a várias extensões possíveis: os cromossomas podem ser marcadas com sondas para cariotipagem espectral (CÉU) ou multicolor hibridização in situ fluorescente(MFISH) para identificar translocações 5,6. Essas técnicas também permitem a frequência de translocações cromossômicas ea estrutura de translocações cromossômicas complexas para ser determinada, que fornece informações adicionais para além do que é possível com este protocolo. Alternativamente, as sondas específicas para a sequência pode ser gerada e utilizada para testar a frequência de quebra de ADN em locais genómicos seleccionados 7. Neste protocolo, descrevemos a preparação do cromossomo metaphase espalha a partir de linfócitos B. Um ácido nucleico (PNA) péptido sonda fluorescente marcada por repetições teloméricas é utilizado, de forma eficiente, que marca telómeros em cromossomas da metafase espalha Este protocolo tem várias vantagens. As células B podem ser induzidas a crescer em alto índice mitótico de modo que os diferenciais de alta qualidade pode ser produzido de forma consistente. Células B de camundongos geneticamente modificados também são muito menos propensos a conter mutações genéticas secundárias que podem confundir a análise da contribuiçãode genes específicos para a integridade genómica. A abordagem PNA-FISH pode ser concluído em um dia, e permite marcar mais precisa de quebras cromossômicas. Usando essa abordagem, particularmente em combinação com equipamento específico descrito no presente protocolo, é possível produzir muito consistentes, spreads de alta qualidade e analisar rapidamente a taxa eo tipo de instabilidade genômica.

<table><tbody><tr><td>50% Sulfato de Dextrano</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>Formamida Deionizada</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &mu; g)</td> <td>Sonda de</td> telômero Sigma <td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td> <td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr> <tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) microesferas</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr> câmara <tr><td>de secagem citogenética</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr> do <tr><td>eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr> CDS-5 de <tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos b mouse por pna-fish

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Reparo do DNA defeituoso leva ao aumento da instabilidade genômica, que é a causa de mutações que levam à tumorigênese. A análise da frequência e tipo de aberrações cromossômicas em diferentes tipos de células permite defeitos nas vias de reparo de DNA a ser elucidado. Biologia de reparo do DNA em mamíferos Entendimento foi muito ajudado pela produção de camundongos com nocautes em genes específicos. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica em linfócitos B de ratinho. Rotulagem dos telômeros, utilizando sondas PNA-FISH (ácido nucleico peptídico - hibridização in situ fluorescente) facilita a análise rápida de instabilidade genômica dos spreads metáfase de cromossomos. As células B têm vantagens específicas em relação a fibroblastos, porque eles têm ploidia normal e um índice mitótico elevado. Cultura de curto prazo das células B, portanto, permite a medição precisa da instabilidade genômica em uma população celular primária que é susceptível de ter menos mutação genética secundários do que o que é normalmente encontrado em fibroblastos transformados ou linhas celulares de doentes.

Cromossomos metafásicos derivadas de uma célula devem formar um conjunto discreto contendo 40 cromossomos (se estiver usando células de camundongo) (Figura 1A). Cada cromossoma tem um centrómero em uma extremidade, que é visível como uma esfera de luz azul. Em cromossomos normais, dois sinais dos telômeros são vistos no fim das cromátides e dois sinais de cada centrômero. Os núcleos interfásicos vai estar presente na lâmina bem. Estes serão visíveis como esferas azuis, com os sinais dos telômeros vermel...

Vias de reparo de DNA são essenciais para a manutenção da integridade genômica e mutação prevenção e câncer. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica por observação direta de aberrações cromossômicas em metáfase se espalha a partir de células de rato B usando hibridização in situ fluorescente (FISH) para repetições de DNA telomérico.

Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar a instabilidade genômica em linfócitos B de camundongos. Isso é conseguido isolando primeiro as células B para cultura de células primárias. Em seguida, as células são fixadas facilitando a preparação dos spreads metafásicos.Finalmente, os telômeros PNA fish são realizados para visualização dos telômeros marcados com fluorescência. Em última análise, o nível de vários tipos de aberrações cromossômicas pode ser quantificado por microscopia fluorescente. As implicações dessa técnica podem ampliar nossa compreensão das vias de reparo do DNA, pois podem ajudar a identificar genes que promovem a estabilidade genômica em nossos modelos de camundongos direcionados.Embora esse método possa fornecer informações sobre quebras cromossômicas e outros grandes rearranjos cromossômicos, ele também pode ser adaptado para medir outras formas de instabilidade genômica, como translocações. Para isolar as células B, comece colocando um baço recém-isolado em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo dois mililitros de tampão de lavagem em uma capela de fluxo laminar. Em seguida, use a extremidade traseira do êmbolo de uma seringa de

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo descreve a seleção de sondas adequadas para uma única célula FISH, técnicas de espalhamento de núcleos de blastômeros, e hibridização in situ e marcando sinal, aplicada ao diagnóstico genético pré-implantação (PGD) em um ambiente clínico.

FISH para diagnóstico pré-implantação Genética

Chromosomics: Detecção de alterações numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos ao mesmo tempo usando um ensaio de FISH Novel OctoChrome

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células vivas, tais como linfócitos ou fibroblastos de pele, e a partir de organismos, incluindo seres humanos ou ratinhos. Estas preparações cromossômicas pode ser ainda utilizado para a rotina de bandamento G e procedimentos de citogenética molecular, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), hibridização genômica comparativa (CGH), e cariotipagem espectral (SKY).

Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

Hibridização in situ fluorescente (FISH), permite a detecção de ácidos nucleicos no seu ambiente nativo dentro das células. Nós aqui descrever um protocolo para o combinado, a detecção simultânea de RNA e DNA, por meio de FISH, que pode ser usado para estudar inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias.

DNA-RNA combinado fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias

Este protocolo descreve técnicas para a quantificação e caracterização de aberrações cromossómicas in vitro em macrófagos de camundongos RAW264.7 após o tratamento com partículas do ar ambiente.

Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

O presente protocolo descreve a utilidade da hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH) e do cariótipo espectral (SKY) na identificação de aberrações estáveis intercromossômicas nas células da medula óssea de camundongos após exposição à irradiação total do corpo.

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

O objetivo desta técnica de abóbora do túbulo é rapidamente avaliar características citológicas de desenvolver espermatócitos de rato, preservando a integridade celular. Esse método permite o estudo de todas as fases da espermatogênese e pode ser facilmente implementado juntamente com outras abordagens biológicas bioquímicas e moleculares para o estudo da meiose rato.

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

Os spreads de superfície nuclear são uma ferramenta indispensável para estudar eventos cromossomos durante a meiose. Aqui demonstramos um método para preparar e visualizar cromossomos meioóticos durante a profase I de espermatotatocitos de zebrafish.

Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish

Apresentado aqui é um ensaio para quantificar a hipermutação somática dentro do lócus genético da cadeia pesada da imunoglobulina usando células germinais do centro B das manchas do rato Peyer.

Análise da Hipermutação Somática no JH4 intron de células do Centro Germinal B das Patches de Mouse Peyer

O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Erros meióticos nas sinapses e recombinação são comuns aos oócitos de mamíferos. A análise rigorosa das proteínas envolvidas nesses processos é essencial para entender como e por que a oogênese geralmente dá errado. As técnicas apresentadas aqui permitem o monitoramento abrangente da recombinação e sinapses para avaliar a qualidade do oócito em camundongos.

Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

Aprenda a quantificar instabilidade genômica em linfócitos B de camundongo usando PNA-FISH para visualização de telômeros. Este método permite analisar aberrações cromossômicas por microscopia de fluorescência.

Rápida análise de aberrações cromossômicas em linfócitos B mouse por PNA-FISH

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