Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla In Situ Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

O objetivo geral deste método citogênico molecular é observar aberrações estáveis intercromossômicas nas células da medula óssea de camundongos expostos à irradiação total do corpo. Este método pode ajudar a responder à questão-chave no campo da biologia da radiação, como o risco de induzir aberrações cromossômicas estáveis nas células da medula óssea de camundongos expostos à radiação corporal total. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização guiada de danos genéticos estáveis induzidos por radiação nas células da medula óssea de camundongos que podem ser propagados por muitas gerações de células.

Depois de isolar a medula óssea dos ossos do fêmur e da tíbia do camundongo e fazer uma suspensão de célula única de acordo com o protocolo de texto, sobreponha cuidadosamente a suspensão celular em um volume igual de meio de separação de células mononucleares da medula óssea. Centrifugar o gradiente a 400 vezes G à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, recolha cuidadosamente a camada leucocitária sem perturbar as camadas restantes e transfira a solução para um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Para preparar spreads celulares metafásicos, adicione 10 mililitros de PBS ao tubo que contém o revestimento buffy. Em seguida, centrifugue o tubo a 400 vezes G à temperatura ambiente durante cinco minutos. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante e bata suavemente no tubo para quebrar o pellet celular.

Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS e centrifugue a suspensão novamente. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Quebre o pellet e adicione, gota a gota, quatro mililitros de solução hipotônica pré-aquecida de cloreto de potássio 0,075 molar com agitação suave e constante.

Incubar a suspensão celular a 37 graus Celsius por 20 minutos em banho-maria. Em seguida, adicione um volume igual de fixador ao tubo e misture delicadamente invertendo o tubo. Centrifugue o tubo e remova o sobrenadante.

Em seguida, quebre o pellet celular e adicione um novo fixador. Repita a rotação e a adição de fixador mais cinco vezes. Depois de ressuspender as células em 400 a 600 microlitros de fixador, coloque 30 microlitros de células fixas em lâminas pré-limpas e úmidas inclinadas em um ângulo de 45 graus e deixe as lâminas secarem completamente ao ar durante a noite.

Para realizar a pintura do cromossomo do camundongo por mFISH, coloque a lâmina contendo as células metafásicas espalhadas em 2X SSC por dois minutos em temperatura ambiente. Em seguida, desidrate a lâmina por lavagem seriada com etanol em 70% 80% e 100% de etanol por dois minutos em cada lavagem. Pré-aqueça 40 mililitros de solução de desnaturação em um frasco de vidro a 70 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, transfira a lâmina para a solução pré-aquecida e incube a amostra por um a 1 1/2 minutos para desnaturar os cromossomos. Use imediatamente etanol 70% gelado para extinguir a lâmina por dois minutos para interromper o processo de desnaturação e evitar que os cromossomos desnaturados sejam recozidos. Em seguida, desidrate a lâmina usando uma série de etanol começando com etanol a 80% por dois minutos.

Em seguida, coloque a lâmina em etanol 100% por dois minutos. Em seguida, seque completamente a lâmina à temperatura ambiente. Para desnaturar a sonda, centrifugue brevemente a mistura da sonda fornecida pelo fabricante, depois transfira 10 microlitros para um tubo de centrífuga de 500 microlitros e incube o tubo em banho-maria a 80 graus Celsius por sete minutos.

Agora coloque o tubo contendo a sonda desnaturada em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, aplique a mistura da sonda em uma lâmina com cromossomos desnaturados. Cubra cuidadosamente a área com uma lamínula de vidro de 18 milímetros por 18 milímetros e elimine quaisquer bolhas de ar visíveis pressionando suavemente a lamínula na lâmina.

Use cimento de borracha para selar todos os quatro lados da lamínula. E incube a lâmina no escuro em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Após a hibridização, remova cuidadosamente o cimento de borracha e a lamínula e coloque a lâmina em SSC 0.4X pré-aquecido a 74 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, transfira a lâmina para a solução de lavagem três por dois minutos. Adicione 20 microlitros de meio de montagem antidesbotamento com contrastain DAPI no slide e cubra-o com uma lamínula de vidro. Use papel de seda de laboratório para pressionar suavemente a lamínula para remover quaisquer bolhas de ar e excesso de solução de montagem.

Em seguida, use esmalte para selar as bordas da lamínula. View as lâminas usando um microscópio fluorescente equipado com os filtros apropriados. Para cariotipagem espectral de cromossomos de camundongos, depois que as sondas são hibridizadas nos cromossomos desnaturados e as amostras são lavadas de acordo com o protocolo de texto, aplique 80 microlitros de reagente de coloração SY5 na lâmina.

Coloque uma lamínula de plástico de 24 por 60 milímetros em cima da amostra e incube-a no escuro em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por 40 minutos. Mergulhe a lâmina em um frasco de vidro contendo a solução de lavagem pré-aquecida três e incube-a em banho-maria a 45 graus Celsius agitando por dois minutos. Repita a lavagem três vezes.

Aplique 80 microlitros de reagente de coloração SY5.5 na amostra, cubra-a com uma lamínula de plástico de 24 por 60 milímetros e incube-a no escuro em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius por 40 minutos. Use a solução de lavagem pré-aquecida três para lavar a lâmina três vezes e, em seguida, segure a lâmina em uma posição inclinada contra uma toalha de papel para drenar o excesso de fluido. Adicione 20 microlitros de reagente DAPI antidesbotamento à amostra e coloque cuidadosamente uma lamínula de vidro por cima sem introduzir bolhas de ar.

Use esmalte para selar as bordas e observe a amostra com um microscópio de epifluorescência equipado para capturar imagens do céu. Esta figura mostra spreads de células metafásicas representativas com pares de cromossomos de camundongos normais e aberrantes um, dois e três. Aqui está uma aberração estável envolvendo o cromossomo um, onde uma parte do cromossomo um foi integrada a um cromossomo DAPI não pintado, enquanto outra parte formou um fragmento acêntrico.

Neste exemplo, uma parte do cromossomo dois foi integrada em um cromossomo não pintado. Essa aberração estável envolve o cromossomo três. Aberrações estáveis envolvendo todos os três cromossomos pintados são vistas nesta disseminação metafásica.

Aqui é mostrado um exemplo de cariótipo de espectro de um camundongo fêmea normal. Este painel representa uma aberração estável envolvendo os cromossomos quatro e 12. Finalmente, a aberração cromossômica estável neste painel envolve os cromossomos sete e 10.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita dentro de 48 a 72 horas se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que apenas células em proliferação devem ser usadas. Seguir este procedimento e outros métodos, como em banda, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como se aberrações estáveis intercromossômicas estão presentes nas células irradiadas.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que os pesquisadores da área de citogenética molecular explorassem a associação entre aberrações genéticas com as várias doenças. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma ideia mais clara de como determinar as aberrações estáveis intercromossômicas. Não se esqueça de que trabalhar com colchicina pode ser extremamente perigoso porque é cancerígeno e precauções como o uso de luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste experimento.