Name: Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis por fluorescência múltipla In Situ Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda a detectar aberrações cromossômicas estáveis em células de medula óssea de camundongos irradiados usando mFISH e SKY. Esta técnica permite visualizar danos genéticos induzidos por radiação.

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Este estudo foi apoiado por Arkansas Espaço Grant Consortium e do Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais biomédica através de National Aeronautics and Space Administration, concede NNX15AK32A (RP) e RE03701 (MH-J), e P20 GM109005 (MH-J), e da Administração de Veteranos dos EUA ( MH-J). Agradecemos a Christopher Fettes, Coordenador do Programa para o Departamento de Saúde Ambiental e Ocupacional da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas, pela assistência editorial na preparação do manuscrito.

Todos os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Arkansas para Ciências Médicas. Todos os animais foram alojados em instalações para animais com ar condicionado padrão a 20 ± 2 ° C com 10 - 15 ciclos de uma hora de ar fresco e livre acesso à alimentação padrão para roedores e água. Após a chegada, os ratos foram mantidos em quarentena por uma semana e desde ração para roedores certificado. Exposição 1.Radiation e In Vivo Detenção de células em metafase <ol><li> ratos expor un-anestesiados com 2 Gy de radiação de corpo inteiro em uma câmara de irradiação. Durante a irradiação, colocar ratos em uma câmara de retenção bem ventilado para garantir que eles não se movem livremente e receber uma dose uniforme. </li><li> Injectar 100 ul de solução de colchicina a 0,05% (Cpó olchicine dissolvido em cálcio e magnésio livre PBS) por via intraperitoneal usando uma agulha 25 G anexo com 1 mL seringa descartável. Evitar a injeção diretamente em qualquer órgão. </li><li> Deixar o animal na gaiola durante 2 h antes da colheita de células de medula óssea. Observar o animal para detectar quaisquer sinais de dor ou sofrimento. </li></ol> 2. Colheita da medula celular e Isolamento de células mononucleares de medula óssea por centrifugação em gradiente de densidade <ol><li> Euthanize o mouse por asfixia com CO2. </li><li> Spray de etanol a 70% sobre o lado ventral e dorsal. </li><li> Adicione de 2 cm da incisão na pele abdominal com uma tesoura afiada. Segure a pele em ambos os lados da incisão com uma pinça sem corte e puxe abrir os músculos abdominais. </li><li> Cortar ambas as patas traseiras com uma tesoura e coloque-os imediatamente na pré-refrigerados PBS com 4% de FBS. </li><li> Limpe cuidadosamente todos os músculos ligados à pata traseira com uma lâmina de barbear e gaze de algodão bandage afiada. </li><li> Separe a tíbia do fêmur. Apare as duas pontas de cada osso com uma lâmina de barbear. </li><li> Lavar o conteúdo da medula óssea com 3 mL de PBS (com 4% de FBS), utilizando uma agulha de 23 G ligada a uma seringa de 3 ml e recolher o conteúdo num tubo de centrífuga de 15 mL. Passar a suspensão de células, pelo menos, 10 vezes, através da agulha para fazer uma suspensão de células individuais. </li><li> Cuidadosamente sobrepor a suspensão de células em um volume igual de meio de separação de linfócitos (3 mL), sem perturbar a interface entre a suspensão de células e meio de separação de linfócitos. Centrifugar a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Recolher o creme leucocitário cuidadosamente, sem perturbar as outras camadas e transferência em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. </li></ol> 3. Preparação de Spreads celular Metaphase <ol><li> Adicionar 10 ml de PBS ao tubo contendo o buffy coat. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, quebrar-se tele célula pellet com toque suave e adicionar 10 mL PBS. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular, quebrar-se o sedimento, e adicionar 4 ml de solução de cloreto de potássio 0,075 M hipotónica pré-aquecido. Adicionar gota solução hipotônica a gota, com agitação constante suave. </li><li> Incubar as células durante 20 min a 37 ° C num banho de água. </li><li> Após o tratamento hipotónico, adicionar um volume igual (4 ml) do fixador (metanol: ácido acético glacial, 3: 1 v / v) no tubo de 15 mL e misturar suavemente por inversão do tubo. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. </li><li> Quebra-se o agregado de células com batimento seguido de vortex suave durante alguns segundos e adicionar 3 mL de gota solução fixadora a gota, com agitação constante. </li><li> Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente e depois centrifugar a 400 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante, romper o pellet celular com gentle tocando, e adicionar 3 ml de fixador fresco. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante. Quebra-se o pellet celular com toque suave, e adicionar fresco 3 ml de fixador. </li><li> Repita o passo 3.12 mais duas vezes. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Em seguida, adicione 400 a 600 mL fixador e misturar completamente com pipetagem. </li><li> Queda de 30 mL células fixadas em lâminas pré-limpas e molhadas inclinado em um ângulo de 45 ° e permitir que as lâminas para o ar seco completamente durante a noite. </li></ol> 4. mouse pintura cromossômica por mFISH <ol><li> A desnaturação cromossomo <ol><li> Colocar a lâmina contendo diferenciais de células em metafase 2x SSC durante 2 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Desidratar a corrediça por lavagem etanol série durante 2 minutos cada em 70%, 80%, e 100%. Incubar durante 60 minutos a 65 ° C. </li><li> Pré-aqueça solução de desnaturação de 40 mL (70% de formamida / 2x SSC; pH 7,0) a 70 ° C (± 2 ° C) num frasco Coplin vidro durante 30 min. Desnaturar cromossomos incubando o slide na solução de desnaturação pré-aquecido para 1-1,5 min. </li><li> Extingue-se deslizar imediatamente em gelo-etanol frio a 70% durante 2 minutos para interromper o processo de desnaturação, bem como para prevenir os cromossomas desnaturadas a partir de re-hibridação. Em seguida, desidrata por lavagem com etanol a 80% durante 2 min. Repetir a lavagem de etanol com 100% de etanol por 2 min. Completamente secar o slide à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Desnaturação e Hibridação da sonda Mistura <ol><li> Resumidamente, centrifugar a mistura de sonda fornecido pelo fabricante, transferir 10 ul de mistura de sonda para um encaixe 500 uL tampão tubo de centrífuga, e desnaturadas por incubação a 80 ° C (± 2 ° C) em banho de água durante 7 minutos. </li><li> Colocar o tubo de centrifugação com a mistura de sonda num banho de água a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Aplique a mistura sonda desnaturada para o slide com chromoso desnaturadomes. </li><li> cobrir cuidadosamente a área com um x 18 mm lamela de vidro 18 mm e eliminar as bolhas de ar visíveis, pressionando muito suavemente a lamínula a deslizar. Selar todos os quatro lados da lamela de cobertura com cimento de borracha e incubar durante 12 h a 16 h no escuro a 37 ° C numa câmara humidificada para hibridação. </li></ol></li><li> Pós Hibridização de lavar roupa e Detecção <ol><li> Retire cuidadosamente o cimento de borracha ea lamela. </li><li> Colocar a lâmina em SSC 0,4x pré-aquecido a 74 ° C (± 2 ° C) durante 5 min. </li><li> Lavar corrediça na solução de lavagem II (4x SSC / 0,1% de Tween-20) durante 2 min. </li><li> Coloque 20 mL de anti-fade meio de montagem com DAPI contracoloração (1,5 mg / mL) e cobrir com uma lamela de vidro. Pressione suavemente lamela com o tecido laboratório para remover as bolhas de ar e solução de montagem excesso. Selar as bordas da lamela com unha polonês. </li><li> Visualização de slides usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros adequados. </li></ol></li&gt; </ol> 5. Spectral Cariotipagem (SKY) do mouse Cromossomos <ol><li> Cromossomos e Probe desnaturação <ol><li> Equilibrar corrediça em 2x SSC à temperatura ambiente durante 2 minutos, sem agitação. </li><li> Desidratar diapositivos numa série de etanol (70%, 80%, e 100% de etanol) durante 2 minutos cada, à temperatura ambiente. Ar seco a corrediça para remover o etanol completamente. </li><li> solução quente de 40 ml de desnaturação (70% formamida / 2x SSC; pH 7,0) em um frasco Coplin vidro durante 30 min. </li><li> Incubar corrediça na solução de desnaturação pré-aquecido durante 1 a 1,5 minutos. </li><li> mergulhar imediatamente a deslizar para gelada etanol a 70% durante 2 minutos para interromper o processo de desnaturação, bem como para prevenir os cromossomas desnaturadas a partir de re-hibridação. </li><li> Desidratar a corrediça, colocando-o em etanol a 80% durante 2 min e em seguida em etanol a 100% durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Desnaturar a sonda CÉU (frasco n ° 1 fornecido pelo fabricante) num banho de água regulado para 80 ° C (± 2 ° C)durante 7 minutos, e, em seguida, colocar imediatamente em um banho de água diferente definido como 37 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> sonda de hibridação <ol><li> Adicionar 10 ul de sonda desnaturada CÉU para os cromossomas desnaturadas. </li><li> Com cuidado, coloque um x 18 mm lamela de vidro 18 mm sobre a sonda SKY modo que não há bolhas de ar presas sob a lamela. </li><li> Selar as bordas da lamela com cimento de borracha. </li><li> Colocar a lâmina numa câmara humidificada à prova de luz e incubar no escuro a 37 ° C durante 24 h a 36 h. </li></ol></li><li> Lavagem pós-hibridação e detecção de fluorescência <ol><li> Remover o cimento de borracha com muito cuidado, sem perturbar a lamela. </li><li> Colocar a lâmina em pré-aquecido a solução de lavagem rápida (SSC 0,4x) a 72 ° C (± 2 ° C) durante 5 min com agitação constante. Imergir corrediça em solução de lavagem III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) e incubar durante 1 minuto, agitando. </li><li> Opcional: adicionar 80 ul de reagente de bloqueio(Frasco n ° 2 fornecido pelo fabricante) para a área de hibridação, coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se no escuro a 37 ° C durante 30 minutos numa câmara humidificada. </li><li> Suavemente remover a lamela de plástico e lava-se a corrediça com pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III durante 5 min. </li><li> Aplicar 80? L de reagente de coloração com Cy5 (frasco n ° 3 fornecido pelo fabricante), coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se a 37 ° C no escuro durante 40 minutos numa câmara humidificada. </li><li> Dip slide num frasco Coplin contendo vidro pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III (4x SSC / 0,1% de Tween 20) e incubar a 45 ° C num banho de água durante 2 min com agitação. Repita este passo de lavagem 3 vezes. </li><li> Aplicar 80? L de reagente de coloração Cy5.5 (frasco n ° 4 fornecido pelo fabricante), coloque um x 60 milímetros lamela de plástico 24 mm, e incuba-se a 37 ° C no escuro durante 40 minutos numa câmara humidificada. </li><li> Lave o slide 3 vezes com pré-aquecido (45 ° C) uma solução de lavagem III. </li><li> Segure o slide em uma posição inclinada contra uma toalha de papel para drenar o excesso de líquido. Adicionar 20 ul anti-fade reagente DAPI (frasco # 5 fornecido pelo fabricante) e coloque cuidadosamente um x 60 milímetros lamela de vidro 24 mm sem introduzir quaisquer bolhas de ar. Selar as bordas da lamela com unha polonês e observar com um microscópio de epifluorescência equipado para capturar imagens do céu. </li></ol></li></ol>

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<li>Braselmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKY+and+FISH+analysis+of+radiation-induced+chromosome+aberrations%3A+a+comparison+of+whole+and+partial+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis.</a> Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).</li>
<li>Sokolova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+multitarget%2C+multicolor+fluorescence+in+situ+hybridization+assay+for+the+detection+of+urothelial+carcinoma+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine.</a> J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).</li>
<li>Lindholm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodosimetry+after+accidental+radiation+exposure+by+conventional+chromosome+analysis+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH.</a> Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Vários passos críticos determinar o sucesso de mFISH e SKY. O primeiro e mais importante passo é para optimizar o tratamento com colchicina para paragem da mitose in vivo das células mononucleares de medula óssea. A concentração de colchicina e tempo de tratamento individual ou em concertação determinar o índice mitótico, bem como de cromossomos de condensação de dois pré-requisitos importantes para a pintura cromossomo eficaz. Uma alta concentração de colchicina ou um tempo mais longo de tratamento conduz a cr...

Os dois métodos mais confiáveis de identificação de aberrações estáveis intercromossômicas induzidas por radiação são a hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH), que permite a pintura de dois ou mais cromossomos simultaneamente, e o cariótipo espectral (SKY), que confere uma cor distinta a cada par de cromossomos homólogos no genoma. Ao contrário das aberrações instáveis, as aberrações estáveis são de natureza persistente e podem ser propagadas por várias gerações em populações irradiadas1, e são consideradas "assinaturas" moleculares críticas de lesões citogenéticas induzidas por radiação2. Estudos de vários grupos têm mostrado que aberrações estáveis estão associadas à patogênese e ao desenvolvimento de uma série de doenças, incluindo o câncer3. Antes da era da pintura cromossômica (também conhecida como citogenética molecular), a técnica convencional de banda G era o único método para detectar aberrações cromossômicas estáveis. No entanto, o bandeamento cromossômico é um desafio para os citogeneticistas porque a resolução é limitada, a reprodutibilidade é incerta, é um procedimento trabalhoso e requer citogeneticistas altamente qualificados e experientes para uma interpretação confiável dos dados4. Além disso, a técnica clássica de bandagem não permite a detecção de rearranjos cromossômicos complexos, que envolvem a interação de três ou mais quebras distribuídas entre dois ou mais cromossomos, um resultado comum de danos por radiação. Aberrações complexas podem persistir em indivíduos muitos anos após a exposição à radiação, tornando-as úteis para biodosimetria retrospectiva5. Portanto, uma abordagem alternativa foi necessária para superar as limitações das técnicas convencionais de bandas para detectar rearranjos cromossômicos estáveis. 
No final da década de 1960, o trabalho pioneiro de Gall e Pardue (1969) sobre hibridização molecular usando sondas de ácido nucleico marcadas com material radioativo deu início a uma nova era no campo da citogenética, que permitiu a detecção de uma sequência específica de DNA nos cromossomos6. No entanto, o uso de sondas radioativas para hibridização molecular teve várias desvantagens: as sondas radioativas são relativamente instáveis, a atividade da sonda depende do decaimento radioativo do isótopo usado, a hibridização leva mais tempo, a resolução é limitada, as sondas são relativamente caras e os materiais radioativos são perigosos para a saúde. Assim, tornou-se necessário desenvolver e projetar sondas não radioativas. A introdução de sondas de ácido nucleico marcadas com fluorescência nas décadas de 1980 e 1990 superou as limitações das sondas radioativas e aumentou muito a segurança, sensibilidade e especificidade da técnica de hibridização7-10. As sondas fluorescentes dão origem a sinais extremamente brilhantes quando observadas em microscópios de fluorescência equipados com os filtros de excitação e emissão apropriados. Qualquer perda, ganho ou rearranjo de cromossomos marcados com fluorescência ou parte do cromossomo é facilmente identificável com esta técnica FISH.
A análise de aberrações cromossômicas pela pintura FISH levou a um progresso acentuado na pesquisa citogenética ao longo dos anos. O projeto de sondas marcadas com fluorescência para aplicações específicas, desde sondas específicas de locus até sondas de pintura de cromossomos inteiros, avançou significativamente o campo; Isso também facilitou a detecção de rearranjo submicroscópico ("críptico"), o que não era possível por bandas cromossômicas convencionais. A pintura cromossômica por mFISH e SKY provou ser ferramentas valiosas para a identificação de rearranjos intercromossômicos simples e complexos. Os princípios básicos para ambas as técnicas são semelhantes, mas o método de detecção e discriminação do sinal fluorescente após hibridização in situ e o processo de aquisição de imagens são diferentes. No mFISH, imagens separadas de cada um dos quatro fluorocromos são capturadas usando filtros de microscópio passa-banda estreitos; O software dedicado é então usado para combinar as imagens. Enquanto no SKY, a aquisição de imagens é baseada em uma combinação de microscopia de epifluorescência, imagem de dispositivo acoplado a carga e espectroscopia de Fourier, que permite a medição de todo o espectro de emissão com uma única exposição em todos os pontos da imagem. Tanto no mFISH quanto no SKY, as imagens monocromáticas são capturadas de forma independente, depois mescladas e, finalmente, pseudocores exclusivas são atribuídas aos cromossomos em imagens monocromáticas com base no corante específico anexado a cada sonda de fluorocromo.
A contribuição da análise mFISH e SKY no campo da biologia da radiação é notável, particularmente para estimativa retrospectiva da dose de exposição humana à IR (biodosimetria por radiação)11-14, avaliação do risco de carcinogênese por radiação15, bem como detecção e estimativa de risco de câncer secundário relacionado à radioterapia16. Um estudo recente em camundongos mostrou que uma técnica de pintura cromossômica baseada em FISH também é uma ferramenta importante para avaliar a eficácia da contramedida de radiação17. No presente estudo, o efeito da exposição total à radiação corporal na indução de aberrações cromossômicas estáveis nas células da medula óssea de camundongos foi demonstrado usando as técnicas mFISH e SKY.

<table><tbody><tr><td>Formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221198-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20&times; Reagente de laboratório concentrado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>SKY para</td><td>imagem espectral aplicada</td><td>em camundongo FPRPR0030/M40</td><td></td></tr><tr><td>CAD - Kit de detecção de anticorpos concentrado</td><td>Imagem espectral aplicada</td><td>FPRPR0033</td><td></td></tr><tr><td>tintas simples personalizadas - 3 cores; Cromossomo 1 de camundongo: Vermelho, Cromossomo 2 de camundongo: Verde, Cromossomo 3 de camundongo: Aqua</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>FPRPR0182/10</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545B</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico, 37%, Acros Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45055-0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de Mancha de Vidro Fisherbrand com Tampa de Rosca</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX Solução de Cloreto de Potássio&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10575-090</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Superfrost Plus da Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Pó Colcemid</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-464-757&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1083&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd Mark I, modelo 25 irradiador 137Cs J</td><td>. L. Shepherd & Seringa</td><td>Modelo 484B</td><td></td>da Associates</tr><tr><td>1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>647911</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Etílico, 200 Provas</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEX02761</td><td></td></tr><tr><td>PBS, (1x PBS Liq.), sem Cálcio e Magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-437-010</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>científico glacial</td> de <td>Fisher AC295320010</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss</td><td></td><td>Imager.Z2</td><td></td></tr> de Fisher AXIO</tbody></table>

detecção de inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; in situ</em&gt; hibridização (mfish) e spectral cariotipagem (sky) em ratos irradiados

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

A radiação ionizante (IR) induz numerosas aberrações cromossômicas estáveis e instáveis. Aberrações instáveis, onde a morfologia cromossômica está substancialmente comprometida, podem ser facilmente identificadas por técnicas convencionais de coloração cromossômica. No entanto, a detecção de aberrações estáveis, que envolvem troca ou translocação de materiais genéticos sem modificação considerável na morfologia cromossômica, requer técnicas sofisticadas de pintura cromossômica que dependem da hibridização in situ de sondas de DNA marcadas com fluorescência, uma técnica de pintura cromossômica popularmente conhecida como fluorescência in situ hibridização (FISH). As sondas FISH podem ser específicas para cromossomos inteiros ou sub-regiões precisas em cromossomos O método não só permite a visualização de aberrações estáveis, mas também pode permitir a detecção do(s) cromossomo(s) ou sequência(s) específica(s) de DNA envolvida(s) em uma formação de aberração específica. Uma variedade de técnicas de pintura cromossômica está disponível em citogenética; aqui, dois métodos altamente sensíveis, hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH) e cariótipo espectral (SKY), são discutidos para identificar aberrações estáveis intercromossômicas que se formam nas células da medula óssea de camundongos após a exposição à irradiação total do corpo. Embora ambas as técnicas dependam de sondas de DNA marcadas com fluorescência, o método de detecção e o processo de aquisição de imagens dos sinais fluorescentes são diferentes. Essas duas técnicas têm sido utilizadas em diversas áreas de pesquisa, como biologia da radiação, citogenética do câncer, biodosimetria retrospectiva por radiação, citogenética clínica, citogenética evolutiva e citogenética comparativa.

irradiação total do corpo induz inúmeras aberrações cromossómicas em células da medula óssea de ratos irradiados. O actual protocolo foi optimizado para a paragem da mitose in vivo de células de medula óssea após a exposição à radiação, a colheita de células de medula óssea a partir das patas traseiras de ratos irradiados, o isolamento de células mononucleares de medula óssea por centrifugação em gradiente de densidade, a preparação dos diferenciais de células da metafase, e sub...

O presente protocolo descreve a utilidade da hibridização in situ de fluorescência múltipla (mFISH) e do cariótipo espectral (SKY) na identificação de aberrações estáveis intercromossômicas nas células da medula óssea de camundongos após exposição à irradiação total do corpo.

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

O objetivo geral deste método citogenético molecular é observar aberrações cromossômicas estáveis entre cromossomos nas células da medula óssea de camundongos expostos à irradiação corporal total. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de biologia da radiação, como o risco de induzir aberrações cromossômicas estáveis nas células da medula óssea de camundongos submetidos à radiação corporal total. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a visualização direcionada de danos genéticos estáveis induzidos por radiação nas células da medula óssea de camundongos, os quais podem ser propagados por muitas gerações celulares.Após isolar a medula óssea dos ossos fêmur e tíbia de camundongo e preparar uma suspensão de células únicas de acordo com o protocolo descrito no texto, sobreponha cuidadosamente a suspensão celular a um volume igual de meio de separação de células mononucleares da medula óssea. Centrifugue o gradiente a 400 vezes G, à temperatura ambiente, por 30 minutos. Em seguida, colete cuidadosamente a camada de buffy coat sem perturbar as camadas restantes e transfira a solução para um novo tubo cônico de 15 mililitros.Para preparar lâminas com células em metáfase, adicione 10 mililitros de PBS ao tubo contendo o buffy coat. Em seguida, centrifugue o tubo a 400 × g, em temperatura ambiente, por cinco minutos. A seguir, remova cuidadosamente o sobrenadante e bata suavemente no tubo para desagregar o pellet celular.Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS e centrifugue a suspensão novamente. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Desagregue o pellet e adicione, gota a gota, quatro mililitros de solução hipotônica de cloreto de potássio 0,075 molar pré-aquecida, com agitação suave e constante.Incube a suspensão celular a 37 graus Celsius por 20 minutos em banho-maria. Em seguida, adicione um volume igual de fixador ao tubo e misture suavemente invertendo o tubo. Centrifugue o tubo e remova o sobrenadante.Em seguida, desagregar o pellet celular e adicionar fixador fresco. Repetir a centrifugação e a adição de fixador mais cinco vezes. Após a ressuspensão das células em 400 a 600 microlitros de fixador, colocar 30 microlitros das células fixadas sobre lâminas previamente limpas e úmidas, inclinadas em um ângulo de 45 graus, e deixar as lâminas secarem ao ar completamente durante a noite.Para realizar a pintura cromossômica em camundongos por mFISH, coloque a lâmina contendo os cromossomos em metáfase em 2X SSC por dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, desidrate a lâmina por meio de lavagem em série com etanol a 70%, 80% e 100%, por dois minutos em cada lavagem. Aqueça previamente 40 mililitros de solução de desnaturação em um frasco de vidro tipo Coplin a 70 graus Celsius por 30 minutos.Em seguida, transfira a lâmina para a solução pré-aquecida e incube a amostra por um a 1 1/2 minuto para desnaturar os cromossomos. Imediatamente, use etanol a 70% gelado para interromper a lâmina por dois minutos, cessando o processo de desnaturação e impedindo que os cromossomos desnaturados se reanilhem. Em seguida, desidrate a lâmina usando uma série de etanol, começando com etanol a 80% por dois minutos.Em seguida, coloque a lâmina em etanol a 100% por dois minutos. Depois, seque completamente a lâmina à temperatura ambiente. Para desnaturar a sonda, centrifugue brevemente a mistura de sonda fornecida pelo fabricante, transfira 10 microlitros para um tubo de centrífuga com tampa de encaixe de 500 microlitros e incube o tubo em banho-maria a 80 graus Celsius por sete minutos.Agora, coloque o tubo contendo a sonda desnaturada em um banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, aplique a mistura da sonda sobre uma lâmina com cromossomos desnaturados. Cubra cuidadosamente a área com uma lamínula de vidro de 18 milímetros por 18 milímetros e remova quaisquer bolhas de ar visíveis pressionando suavemente a lamínula contra a lâmina.Use cimento de borracha para selar todos os quatro lados da lamínula. Incube a lâmina no escuro, em uma câmara umidificada, a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Após a hibridização, remova cuidadosamente o cimento de borracha e a lamínula e coloque a lâmina em SSC 0,4X pré-aquecido a 74 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, transfira a lâmina para a solução de lavagem três por dois minutos. Adicione 20 microlitros de meio de montagem antidesbotamento com contracoloração por DAPI sobre a lâmina e cubra com uma lamínula de vidro. Utilize papel-toalha de laboratório para pressionar suavemente a lamínula, removendo bolhas de ar e excesso de meio de montagem.Em seguida, use esmalte para unhas para selar as bordas da lamínula. Visualize as lâminas utilizando um microscópio de fluorescência equipado com os filtros apropriados. Para a cariotipagem espectral de cromossomos de camundongo, após as sondas serem hibridizadas nos cromossomos desnaturados e as amostras serem lavadas de acordo com o protocolo descrito, aplique 80 microlitros do reagente corante SY5 sobre a lâmina.Coloque uma lamínula de plástico de 24 por 60 milímetros sobre a amostra e incube-a no escuro, em uma câmara umidificada, a 37 graus Celsius por 40 minutos. Mergulhe a lâmina em um frasco de Coplin de vidro contendo solução de lavagem pré-aquecida por três vezes e incube-a em banho-maria a 45 graus Celsius com agitação por dois minutos. Repita a lavagem três vezes.Adicione 80 microlitros do reagente corante SY5.5 à amostra, cubra-a com uma lamínula plástica de 24 por 60 milímetros e incube no escuro, em câmara umidificada, a 37 graus Celsius por 40 minutos. Use a solução de lavagem pré-aquecida três para lavar a lâmina três vezes, em seguida segure a lâmina em posição inclinada contra uma toalha de papel para drenar o excesso de fluido. Adicione 20 microlitros do reagente antifade DAPI à amostra e coloque cuidadosamente uma lamínula de vidro por cima, sem introduzir bolhas de ar.Use esmalte para unhas para selar as bordas e observe a amostra com um microscópio de epifluorescência equipado para capturar imagens do céu. Esta figura mostra extensões representativas de células em metáfase com pares normais e aberrantes de cromossomos de camundongo um, dois e três. Abaixo, há uma aberração estável envolvendo o cromossomo um, onde uma parte do cromossomo um foi integrada em um cromossomo DAPI não corado, enquanto outra parte formou um fragmento acêntrico.Neste exemplo, uma parte do cromossomo dois foi integrada em um cromossomo não marcado. Essa aberra&ccedil;&atilde;o est&aacute;vel envolve o cromossomo tr&ecirc;s. Aberra&ccedil;&otilde;es est&aacute;veis; que envolvem os tr&ecirc;s cromossomos marcados s&atilde;o observadas nesta prepara&ccedil;&atilde;o de met&aacute;fase.É mostrado aqui um exemplo de cariotipagem por espectroscopia de um camundongo fêmea normal. Este painel representa uma aberração estável envolvendo os cromossomos quatro e doze. Por fim, a aberração cromossômica estável neste painel envolve os cromossomos sete e dez.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 48 a 72 horas, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que apenas células em proliferação devem ser utilizadas. Após este procedimento e outros métodos como em faixa, podem ser usados para responder perguntas adicionais, como a presença de aberrações estáveis intercromossômicas nas células irradiadas.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área da citogenética molecular explorassem a associação entre aberrações genéticas e diversas doenças. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma ideia mais clara de como determinar aberrações estáveis intercromossômicas. Não se esqueça de que trabalhar com colchicina pode ser extremamente perigoso, pois ela é carcinogênica, e precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este experimento.

detection-inter-chromosomal-stable-aberrations-multiple-fluorescence

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este artigo descreve a seleção de sondas adequadas para uma única célula FISH, técnicas de espalhamento de núcleos de blastômeros, e hibridização in situ e marcando sinal, aplicada ao diagnóstico genético pré-implantação (PGD) em um ambiente clínico.

FISH para diagnóstico pré-implantação Genética

Chromosomics: Detecção de alterações numéricas e estruturais em todos os 24 cromossomos humanos ao mesmo tempo usando um ensaio de FISH Novel OctoChrome

Cariotipagem espectral (SKY) é uma técnica avançada citogenética para identificar as aberrações cromossômicas e cromossômicas. Essa técnica leva vantagem das sondas cromossômicas de pintura, que permitem a classificação de todos os cromossomos. SKY também pode identificar aberrações cromossômicas e defeitos complexos de segregação em camundongos e humanos, com várias doenças, incluindo doença renal policística.

Cariotipagem espectral para o Estudo de Anomalias cromossômicas em humanos e camundongos com doença renal policística

Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

Hibridização in situ fluorescente (FISH), permite a detecção de ácidos nucleicos no seu ambiente nativo dentro das células. Nós aqui descrever um protocolo para o combinado, a detecção simultânea de RNA e DNA, por meio de FISH, que pode ser usado para estudar inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias.

DNA-RNA combinado fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias

Vias de reparo de DNA são essenciais para a manutenção da integridade genômica e mutação prevenção e câncer. O objetivo deste protocolo é quantificar instabilidade genômica por observação direta de aberrações cromossômicas em metáfase se espalha a partir de células de rato B usando hibridização in situ fluorescente (FISH) para repetições de DNA telomérico.

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Surgimento de resistência genética a terapia com inibidor da quinase poses desafio significativo para a terapia do cancro eficaz. Identificação e caracterização de mutações resistentes contra uma droga recém-desenvolvido ajuda na melhor gestão clínica e concepção de medicamentos próxima geração. Aqui, descrevemos o nosso protocolo de rastreio in vitro e validação das mutações resistentes.

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Preparação de Spreads Cromossômicos Meióticos de Oócitos de Camundongos para Avaliação de Sinapse e Recombinação

Aprenda a detectar aberrações cromossômicas estáveis em células de medula óssea de camundongos irradiados usando mFISH e SKY. Esta técnica permite visualizar danos genéticos induzidos por radiação.

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla In Situ Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados (Vídeo) | JoVE Journal

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