Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla

O objetivo geral deste método citogenético molecular é observar aberrações cromossômicas estáveis entre cromossomos nas células da medula óssea de camundongos expostos à irradiação corporal total. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de biologia da radiação, como o risco de induzir aberrações cromossômicas estáveis nas células da medula óssea de camundongos submetidos à radiação corporal total. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a visualização direcionada de danos genéticos estáveis induzidos por radiação nas células da medula óssea de camundongos, os quais podem ser propagados por muitas gerações celulares.

Após isolar a medula óssea dos ossos fêmur e tíbia de camundongo e preparar uma suspensão de células únicas de acordo com o protocolo descrito no texto, sobreponha cuidadosamente a suspensão celular a um volume igual de meio de separação de células mononucleares da medula óssea. Centrifugue o gradiente a 400 vezes G, à temperatura ambiente, por 30 minutos. Em seguida, colete cuidadosamente a camada de buffy coat sem perturbar as camadas restantes e transfira a solução para um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Para preparar lâminas com células em metáfase, adicione 10 mililitros de PBS ao tubo contendo o buffy coat. Em seguida, centrifugue o tubo a 400 × g, em temperatura ambiente, por cinco minutos. A seguir, remova cuidadosamente o sobrenadante e bata suavemente no tubo para desagregar o pellet celular.

Em seguida, adicione 10 mililitros de PBS e centrifugue a suspensão novamente. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Desagregue o pellet e adicione, gota a gota, quatro mililitros de solução hipotônica de cloreto de potássio 0,075 molar pré-aquecida, com agitação suave e constante.

Incube a suspensão celular a 37 graus Celsius por 20 minutos em banho-maria. Em seguida, adicione um volume igual de fixador ao tubo e misture suavemente invertendo o tubo. Centrifugue o tubo e remova o sobrenadante.

Em seguida, desagregar o pellet celular e adicionar fixador fresco. Repetir a centrifugação e a adição de fixador mais cinco vezes. Após a ressuspensão das células em 400 a 600 microlitros de fixador, colocar 30 microlitros das células fixadas sobre lâminas previamente limpas e úmidas, inclinadas em um ângulo de 45 graus, e deixar as lâminas secarem ao ar completamente durante a noite.

Para realizar a pintura cromossômica em camundongos por mFISH, coloque a lâmina contendo os cromossomos em metáfase em 2X SSC por dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, desidrate a lâmina por meio de lavagem em série com etanol a 70%, 80% e 100%, por dois minutos em cada lavagem. Aqueça previamente 40 mililitros de solução de desnaturação em um frasco de vidro tipo Coplin a 70 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, transfira a lâmina para a solução pré-aquecida e incube a amostra por um a 1 1/2 minuto para desnaturar os cromossomos. Imediatamente, use etanol a 70% gelado para interromper a lâmina por dois minutos, cessando o processo de desnaturação e impedindo que os cromossomos desnaturados se reanilhem. Em seguida, desidrate a lâmina usando uma série de etanol, começando com etanol a 80% por dois minutos.

Em seguida, coloque a lâmina em etanol a 100% por dois minutos. Depois, seque completamente a lâmina à temperatura ambiente. Para desnaturar a sonda, centrifugue brevemente a mistura de sonda fornecida pelo fabricante, transfira 10 microlitros para um tubo de centrífuga com tampa de encaixe de 500 microlitros e incube o tubo em banho-maria a 80 graus Celsius por sete minutos.

Agora, coloque o tubo contendo a sonda desnaturada em um banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, aplique a mistura da sonda sobre uma lâmina com cromossomos desnaturados. Cubra cuidadosamente a área com uma lamínula de vidro de 18 milímetros por 18 milímetros e remova quaisquer bolhas de ar visíveis pressionando suavemente a lamínula contra a lâmina.

Use cimento de borracha para selar todos os quatro lados da lamínula. Incube a lâmina no escuro, em uma câmara umidificada, a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Após a hibridização, remova cuidadosamente o cimento de borracha e a lamínula e coloque a lâmina em SSC 0,4X pré-aquecido a 74 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, transfira a lâmina para a solução de lavagem três por dois minutos. Adicione 20 microlitros de meio de montagem antidesbotamento com contracoloração por DAPI sobre a lâmina e cubra com uma lamínula de vidro. Utilize papel-toalha de laboratório para pressionar suavemente a lamínula, removendo bolhas de ar e excesso de meio de montagem.

Em seguida, use esmalte para unhas para selar as bordas da lamínula. Visualize as lâminas utilizando um microscópio de fluorescência equipado com os filtros apropriados. Para a cariotipagem espectral de cromossomos de camundongo, após as sondas serem hibridizadas nos cromossomos desnaturados e as amostras serem lavadas de acordo com o protocolo descrito, aplique 80 microlitros do reagente corante SY5 sobre a lâmina.

Coloque uma lamínula de plástico de 24 por 60 milímetros sobre a amostra e incube-a no escuro, em uma câmara umidificada, a 37 graus Celsius por 40 minutos. Mergulhe a lâmina em um frasco de Coplin de vidro contendo solução de lavagem pré-aquecida por três vezes e incube-a em banho-maria a 45 graus Celsius com agitação por dois minutos. Repita a lavagem três vezes.

Adicione 80 microlitros do reagente corante SY5.5 à amostra, cubra-a com uma lamínula plástica de 24 por 60 milímetros e incube no escuro, em câmara umidificada, a 37 graus Celsius por 40 minutos. Use a solução de lavagem pré-aquecida três para lavar a lâmina três vezes, em seguida segure a lâmina em posição inclinada contra uma toalha de papel para drenar o excesso de fluido. Adicione 20 microlitros do reagente antifade DAPI à amostra e coloque cuidadosamente uma lamínula de vidro por cima, sem introduzir bolhas de ar.

Use esmalte para unhas para selar as bordas e observe a amostra com um microscópio de epifluorescência equipado para capturar imagens do céu. Esta figura mostra extensões representativas de células em metáfase com pares normais e aberrantes de cromossomos de camundongo um, dois e três. Abaixo, há uma aberração estável envolvendo o cromossomo um, onde uma parte do cromossomo um foi integrada em um cromossomo DAPI não corado, enquanto outra parte formou um fragmento acêntrico.

Neste exemplo, uma parte do cromossomo dois foi integrada em um cromossomo não marcado. Essa aberração estável envolve o cromossomo três. Aberrações estáveis; que envolvem os três cromossomos marcados são observadas nesta preparação de metáfase.

É mostrado aqui um exemplo de cariotipagem por espectroscopia de um camundongo fêmea normal. Este painel representa uma aberração estável envolvendo os cromossomos quatro e doze. Por fim, a aberração cromossômica estável neste painel envolve os cromossomos sete e dez.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 48 a 72 horas, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que apenas células em proliferação devem ser utilizadas. Após este procedimento e outros métodos como em faixa, podem ser usados para responder perguntas adicionais, como a presença de aberrações estáveis intercromossômicas nas células irradiadas.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área da citogenética molecular explorassem a associação entre aberrações genéticas e diversas doenças. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma ideia mais clara de como determinar aberrações estáveis intercromossômicas. Não se esqueça de que trabalhar com colchicina pode ser extremamente perigoso, pois ela é carcinogênica, e precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este experimento.