Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

O objetivo geral deste procedimento é colher e preparar cromossomos para bandas GB e testes citogenéticos moleculares. Primeiro, cultive as células até a fase logarítmica. Em seguida, colha os cromossomos com smid, um hipotônico e um fixador.

Solte a suspensão da célula em slides. Manchar um slide. Como monitor da preparação cromossômica, prossiga para GB banding ou técnicas moleculares das lâminas restantes.

Como etapa final na bandagem GB, analise os cromossomos por microscopia de luz e cariótipo. Em última análise, os cromossomos e núcleos estarão disponíveis para cariótipo ou peixe. Tive a ideia de publicar esse método pela primeira vez devido à alta demanda de outros pesquisadores solicitando assistência na detecção de instabilidade cromossômica em diferentes tipos de células de vários organismos e para testes citogenéticos moleculares subsequentes.

Essa técnica é essencial no diagnóstico e, em última análise, no prognóstico de muitas doenças genéticas congênitas, incluindo o câncer, porque permite a visualização de rearranjos cromossômicos, que são diagnósticos. Para esses distúrbios, embora esse método possa fornecer informações sobre os rearranjos cromossômicos encontrados em vários tipos de células humanas. Também pode ser aplicado a células de outros organismos, como Resus Maca, ratos e camundongos Cultura.

2 milhões de células aderentes a 80% de fluência e adicionar 10 microlitros de 10 microgramas por mililitro. Col por mililitro de células. Incube as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de CO2 por 45 minutos.

Em seguida, usando uma pipeta estéril, transfira o meio da cultura para um tubo cônico de 15 mililitros e reserve para mais tarde Para lavar as células, adicione dois mililitros de HBSS no frasco, agite e remova o tampão. Em seguida, adicione um mililitro de tripsina, certificando-se de que cubra toda a superfície do frasco. Uma vez que a maioria das células tenha se desprendido, pipete o meio no tubo cônico de volta para as células.

Alíquota de 10 mililitros da suspensão celular em tubos cônicos de 15 mililitros. Centrifugue a 200 Gs por 10 minutos. Remova o sobrenat.

Suspenda novamente o pellet em 10 mililitros de cloreto de potássio 75 milimolares, que será pré-aquecido a 37 graus Celsius após uma incubação de 10 minutos de 37 graus Celsius. Centrifugar a 200 Gs durante cinco minutos. A 25 graus Celsius, remova tudo, exceto 0,5 mililitros do sobrenadante e ressuspenda o pellet com cuidado.

Adicione cinco mililitros de fixador de ruído de carro novo às células. Em seguida, adicione cinco mililitros, mais fixador e centrífuga de vórtice a 200 Gs por cinco minutos. Resus, suspenda cada pellet celular em cinco mililitros de fixador.

Armazene as células a quatro graus por até um ano. Centrifugar as células a 200 Gs durante cinco minutos. A 25 graus Celsius.

Remova o sufocante até que restem apenas 0.3 a 0.5 mililitros após suspender suavemente o pellet. Pipete três gotas da suspensão celular a uma distância de cerca de cinco centímetros em uma lâmina inclinada em um ângulo de cerca de 45 graus. E permita que a suspensão role pelo slide.

Adicione uma grande gota de ruído fresco do carro, fixador ao slide. Passe a parte de trás da lâmina em uma toalha de papel e, em seguida, coloque-a para secar completamente. Prepare uma solução de sustentação de gim fresca.

Coloque as lâminas em uma grade de coloração. Cubra toda a lâmina com a solução de sustentação gim. Após cinco minutos, enxágue as lâminas com água destilada e deixe secar ao ar.

Adicione quatro gotas de suporte permanente ao slide e coloque uma lamínula garantindo que não haja bolhas sob a lamínula. Remova o excesso por montagem com uma toalha de papel. Analise as células com um microscópio óptico com ampliação de 10 x e 100 x.

Se as células metafásicas forem abundantes e bem espalhadas, as lâminas restantes podem ser usadas para outros procedimentos experimentais. Adicione 50 mililitros das soluções de tratamento a quatro frascos Copeland. Mergulhe cada lâmina no frasco número um por cinco segundos depois.

Enxágue rapidamente a lâmina no frasco número dois. Deixe-o no frasco número três por pelo menos 30 segundos. Enxágüe no frasco número quatro e deixe as lâminas secarem.

Prepare uma solução de sustentação GIM fresca. Coloque as lâminas em uma grade de coloração. Cubra toda a lâmina com a solução de sustentação gim por cinco minutos.

Enxágue as lâminas e a água destilada na mesma ordem em que foram manchadas. Em seguida, seque por pelo menos 10 minutos. Coloque uma lamínula usando o suporte permanente, conforme mostrado anteriormente.

Em seguida, analise as células em um microscópio óptico para as lâminas restantes. Ajuste o tempo de incubação do tripsin. Com base nos resultados do primeiro slide.

Um ensaio bem-sucedido produz cromossomos bem espalhados e com morfologia cromossômica adequada. Devidamente. Os cromossomos com bandas GB contêm os padrões característicos de bandas claras e escuras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como colher cromossomos para bandas GB e outros testes citogenéticos moleculares na elucidação da instabilidade cromossômica.

Uma vez dominada, esta técnica de colheita pode ser feita em cerca de três horas se for realizada corretamente. Para o procedimento de cintagem GB, é importante testar inicialmente o tempo de incubação de tripsina em uma lâmina antes de prosseguir para a banda GB. O resto dos slides.