Aplicação de nanopartículas fluorescentes para estudar Reformas do Sistema Endo-lysosomal por bactérias intracelulares

O objetivo geral deste procedimento é estudar a remodelação do sistema lisossômico terminal por bactérias intracelulares usando nanopartículas fluorescentes como traçadores. Isso é feito primeiro semeando células de heela em uma lâmina de câmara de oito poços e incubando-as durante a noite. O segundo passo é infectar as células com salmonela e tarica.

Em seguida, uma marcação de perseguição de pulso de células hospedeiras infectadas é realizada por incubação com nanopartículas de ouro BSA Rumine. A etapa final é observar alterações do sistema endossômico da célula hospedeira por microscopia confocal. Por fim, a quantificação da distribuição intracelular das nanopartículas é realizada usando o pacote de software MRS.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como imunomicroscópicos, é que n células infectadas são analisadas com método, pode fornecer informações sobre o estilo de vida intracelular de terica. No entanto, também pode ser aplicado a outros patógenos intracelulares, como espécies de Gaia, Ella Palia ou Mycobacterium tuberculosis. Também pode ser aplicado a outros tipos de células hospedeiras, como micro feh, linhagens celulares ou células primárias.

A síntese de nanopartículas de ouro de 10 nanômetros ou NPS requer duas soluções solução A e solução B.To preparar a solução A, adicione dois mililitros de cloreto de ouro aquoso a 1% em 160 mililitros de água mili Q. Prepare a solução B adicionando oito mililitros de citrato trissódico a 1% di-hidratado e 160 microlitros de ácido tânico a 1% em 32 mililitros de água mili Q. Aqueça as soluções A e B a 60 graus Celsius e misture-as enquanto mexe.

Uma cor azul escura deve ser observada imediatamente após cerca de 15 minutos. A solução deve ficar vermelha neste momento. Aqueça a solução a 95 graus Celsius.

Mantenha-o a 95 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, resfrie a solução à temperatura ambiente. Prepare a peça dourada para revestimento e rotulagem adicionando 900 microlitros de ouro MPS em um tubo einor de 1,5 mililitro e centrifugando a 15.000 Gs por 30 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 900 microlitros de água MQ esterilizada.

Adicione 100 microlitros de solução A BSA e misture em um vórtice a 800 RPM por 30 minutos. Remova o excesso de BSA centrifugando a preparação a 15.000 Gs por 60 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o ouro BSA NPS e 125 microlitros de PBS.

Adicione 12,5 microlitros de bicarbonato molar. A solução de éster R domina n hidroxi CIN ou NHS é preparada em DMSO imediatamente antes. Use a 15 microlitros de solução R DOMINE N-H-S-D-M-S-O para 0,5 mililitros da suspensão dourada BSA NP.

Incubar a reação por duas horas em temperatura ambiente, misturando a 800 RPM e evitando a exposição à luz. Em seguida, purifique o NPS de rubi BSA de ouro através de diálise contra PBS a quatro graus Celsius com cinco trocas de tampão durante um período de 36 a 48 horas após a purificação, estabilize o NPS adicionando 10 microlitros de BSAP NPS em cada mililitro de ouro BSA RUMINE NPS para remover a centrífuga de Rumina BSA livre ou liberada a 15, 000 GS por 16 minutos a quatro graus Celsius. Resus suspende o pellet em dois miligramas por mililitro de B-S-A-P-B-S após medir a densidade óptica em 520 nanômetros ou OD cinco 20.

Armazene o ouro BSA Rod Domine NPS a quatro graus Celsius, evitando a exposição à luz, as células he a para este experimento expressam permanentemente uma proteína fluorescente verde marcada com lâmpada de glicoproteína lisossômica uma GFP e são cultivadas em DMEM com 10% de soro de bezerro fetal a 37 graus Celsius em uma atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono semeiam as células a uma densidade de 50, 000 por poço em uma lâmina de câmara de oito poços e incubar durante a noite. A bactéria que infecta as células hela é o patógeno gastrointestinal humano, salmonela e tarica. Para comparação, duas cepas mutantes são usadas.

Todas as três cepas abrigam um plasmídeo para expressão constitutiva de GFP aumentada e são cultivadas em caldo LB com os antibióticos apropriados para manter os plasmídeos para cada cepa. Inocule uma única colônia de bactérias em três mililitros de caldo LB com o antibiótico apropriado e cresça durante a noite a 37 graus Celsius. Em condições de agitação para aeração no dia seguinte, diluir cada cultura de um a 31 em caldo LB fresco e continuar crescendo por três horas e meia.

Para iniciar este procedimento, meça o OD 600 da bactéria da subcultura e dilua para um OD 600 de 0,2. Em um mililitro de PBS, adicione quantidades apropriadas de bactérias às células hela na lâmina da câmara A 12 para obter uma multiplicidade de infecção de 100. Incubar por 30 minutos na incubadora de células.

Lave as células hela três vezes com PBS para remover bactérias não internalizadas. Este ponto de tempo é definido como zero hora pós-infecção ou zero hora pi. Adicione 300 microlitros de meio de cultura fresco contendo 100 microgramas por mililitro de gentamicina às células e mantenha por uma hora.

Depois de uma hora. Substituir o meio por um meio de imagiologia que contenha 10 microgramas por mililitro de gentamicina. Adicione ouro BSA rumina NPS às células hela para obter uma concentração final de OD cinco 20 de 0,1.

Incube por uma hora após uma hora. Remova o meio e lave três vezes com PBS. Por fim, adicione 300 microlitros de meio de imagem fresco contendo 10% FCS e 10 microgramas por mililitro de gentamicina.

Durante o resto do tempo de incubação, a imagem de alta resolução das células em diferentes pontos de tempo é realizada usando um sistema de imagem confocal, como um microscópio confocal de varredura a laser ou de disco giratório com uma câmara de ambiente umidificado, ligue o sistema de controle de temperatura e espere até que esteja estável. Otimize as configurações de imagem, como varredura de ampliação, resolução de velocidade e tamanho do passo Z. Use as configurações de emissão de excitação apropriadas para GFP e ouro BSA rumine NPS nos pontos de tempo indicados após a infecção.

Monte a lâmina de 12 câmaras contendo células infectadas no estágio do microscópio e registre as imagens para analisar as imagens e estudar a remodelação do sistema endossômico por salmonela intracelular. Use um software de análise de imagem. Abra os dados clicando em abrir e escolhendo o arquivo na barra de ferramentas de objetos da visualização de superação.

Clique no ícone para adicionar um novo item de superfície. Para analisar uma região de interesse ou ROI, selecione segmentar apenas uma região de interesse e clique em Avançar como um canal de origem. Selecione o canal três.

Marque a opção de suavização para configurar a suavidade da área resultante. Defina um valor manualmente ou aceite o valor gerado automaticamente. Para limiar.

Selecione a opção de intensidade absoluta para o ajuste do limite. Selecione a opção manual e defina um valor na área de visualização. Uma visualização do limite de superfície é exibida em cinza.

Clique em Avançar na guia Classifica superfícies. A superfície resultante pode ser filtrada por vários critérios. Um filtro padrão é o número de furos em V maior que 10, outros filtros também podem ser incluídos clicando em adicionar.

Neste exemplo, o filtro padrão é usado para concluir a criação da superfície. Clique em concluir na lista de objetos. Desmarque a caixa do volume do item.

Uma nova superfície criada agora é exibida na área de visualização. Em vermelho, exporte as estatísticas para um arquivo do Excel clicando em salvar. O NPS de ouro sintetizado por este protocolo era quase esférico em forma e aproximadamente 10 nanômetros de tamanho.

O revestimento BSA e a marcação rho domine não influenciaram sua morfologia ou tamanho. Estudar a remodelação do sistema endossômico celular hospedeiro por salmonela intracelular. As células Hela foram infectadas simuladamente ou infectadas com salmonela do tipo selvagem ou duas cepas mutantes e pulsadas com ouro de 10 nanômetros.

BSA rod domine n ervilhas em células não infectadas, o NPS uniformemente distribuído em endossomos tardios ou lisossomos. Em contraste, o NPS em células infectadas por salmonela do tipo selvagem foi amplamente reorganizado oito horas após a infecção. Uma rede estabilizada de filamentos ou peneiras induzidos por salmonela foi formada, e a maioria dos mps foi encontrada acumulada dentro das estruturas tubulares.

As cepas mutantes exibiram comportamentos distintos oito horas após a infecção. A cepa mutante SSAV foi confinada dentro da salmonela contendo VAE ou SCV. Embora nenhuma peneira tenha sido formada, a maioria dos mps ainda estava localizada em endossomos tardios livres ou lisossomos para a peneira.

Ocorreu uma fuga de cepa mutante de salmonela para o citoplasma e nenhuma associação entre NPS e bactérias foi observada. Quando a acessibilidade do sistema lisossômico terminal em várias fases da infecção por salmonela foi examinada, os resultados mostram que, em todos os casos, a maior parte do NPS internalizado se acumulou no SCV ou SIFs após este procedimento. Outros métodos, a transmissão microscópica do pescoço pode ser realizada.

Isso pode responder a perguntas adicionais, como ultraestrutura ou compartimentos de membrana em algumas células hospedeiras nanoinfectadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar nanopartículas fluorescentes. Estes podem ser usados para rotular compartimentos de hoster modificados por salmonela intracelular.