Name: Fluorescência Baseado Técnica Extensão Primer para determinar Transcriptional pontos de partida e de clivagem Sites de RNases In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a técnica de extensão de primer baseada em fluorescência para mapear pontos de início transcricional e sítios de clivagem de RNA em bactérias in vivo. Este método utiliza sequenciador automatizado de gel para detecção de alta resolução.

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Agradecemos a Anne Wochele por sua assistência no laboratório e a Vera Augsburger pela ajuda com o sequenciador de gel automatizado. Agradecemos à Deutsche Forschungsgemeinschaft pelo financiamento através das subvenções BE4038/2 e BE4038/5 no âmbito dos "programas prioritários" SPP1316 e SPP1617.

<ol><li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+extension+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension%3A+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li>
<li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li>
<li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li>
<li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li>
<li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+interferases%2C+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+molecular+biology+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li>
<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar que apresente um conflito de interesses.

Extensão do iniciador fluorescente é um método simples e rápido para a determinação extremidades 5 &#39;dos ​​RNAs, quer para identificação TSP- ou processamento de RNA secundário. Devido ao uso de iniciadores fluorescentes, as reacções podem ser configurar e executar, sem precauções de segurança adicionais (ao contrário do caso de iniciadores marcados radioactivamente). Como as amostras são detectadas por fluorescência, que pode ser convertido em imagem, enquanto a electroforese está em progresso que permite a análise ...

A extensão do iniciador 1 é um método molecular para determinar as extremidades 5 'de moléculas de RNA específicas até uma resolução de uma base. A vantagem de outros métodos, tais como 5'-RACE (amplificação rápida de extremidades de ADNc) é o tempo de resposta rápido e a capacidade de analisar facilmente uma mistura de diferentes comprimentos de moléculas de RNA. Este método funciona por sujeição de moléculas de ARN para reacções de transcrição reversa, utilizando iniciadores fluorescentes específicos, gerando fragmentos de cDNA de determinados comprimentos. Estas moléculas de cDNA são executados juntamente com as reacções de sequenciação de Sanger tradicional 2 em géis desnaturantes de poliacrilamida e podem ser detectadas pela sua fluorescência devida à utilização de iniciadores marcados com fluorescência. Os comprimentos dos fragmentos de cDNA são então avaliadas por comparação com a escada de sequenciação, permitindo que o mapeamento dos terminais 5 'de RNA. Tradicionalmente, as reacções de extensão de iniciadores são utilizados em conjuntocom isótopos radioactivos para detectar moléculas de cDNA em películas de raios-X. Devido aos riscos de saúde, problemas de eliminação de resíduos e facilidade de manuseamento, os protocolos mais recentes utilizam fluorescência para a detecção da extensão do iniciador com sequenciadores automatizados, embora a sua sensibilidade é ligeiramente inferior. Usando primers marcados com fluorescência, o procedimento da marcação recorrentes podem ser omitidos, como iniciadores fluorescentes são estáveis ​​por um longo tempo (mais de um ano em nossas mãos). O método aqui descrito utiliza um sequenciador automatizado de gel, mas com ligeiras modificações, sequenciadores capilares podem também ser utilizados para a separação e detecção de cDNA 3. A natureza paralela de análise de gel faz com que seja possível detectar mesmo uma pequena quantidade de clivagem ou processamento de RNA. Outra vantagem é a elevada resolução deste método, como clivagem ou mesmo um tratamento de base terminal pode ser detectado. No que diz respeito à detecção de clivagem de RNA ou de transformação, typically dois diferentes tipos de extensões de primer são distinguidos. Em um caso, o tratamento enzimático é realizado in vitro utilizando ARN purificado e enzima purificada, enquanto que no outro caso, o processamento é realizado in vivo, e o ARN resultante é purificado. Em ambos os casos, o ARN é sujeito a uma extensão de primer efectuada in vitro, no entanto, dependendo da fonte de RNA, o método é chamado tanto uma extensão do iniciador in vivo, in vitro ou in. No protocolo apresentamos aqui, nos concentrarmos apenas na extensão do iniciador in vivo, por causa da facilidade de utilização (não há proteínas purificadas necessário) e a possibilidade de determinar pontos de partida da transcrição e processamento ao mesmo tempo. No entanto, in vitro extensões de primer são, em princípio, criado da mesma maneira e este protocolo pode servir como um ponto de partida. O método ilustrado aqui pode ser aplicado a muitas espécies de bactérias, desde que eles são passíveis de altapureza e elevado rendimento de preparação de ácidos nucleicos. A pesquisa em nosso laboratório centra-se no âmbito regulatório da toxina-antitoxina (TA) Sistemas de 4,5, um campo em que o método de extensão do primer é usado extensivamente. TA-sistemas são pequenos elementos genéticos presentes nos genomas procarióticos que consistem de uma proteína tóxica e estável endogenamente activa e uma proteína ou RNA antitoxina na maior parte instável, que neutraliza a toxicidade 6,7. A actividade da toxina é por vezes exercida pela inibição da replicação, síntese da parede celular ou outros mecanismos, mas na maioria das vezes pela actividade de ARNase 8,9. Tipicamente, a RNase especificidade é determinada através da realização de testes diferentes, um dos quais é o método de extensão do primer. Reacções de extensão de iniciadores são adequados para esta aplicação, como uma mistura de fragmentos de comprimento completo e clivados podem ser simultaneamente analisadas para determinar suas extremidades 5 '. Usando uma mistura de in vitro e in vivo em extensões de iniciadores, otoxina de clivagem específico de RNase, por exemplo, a especificidade de sequência pode ser determinada 10-13. <img alt="Extensão do primer, isolamento de RNA, síntese de cDNA, sequenciamento de Sanger, diagrama de eletroforese em gel." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="A Figura 1"> Figura 1. Visão geral do procedimento de extensão do primer. As culturas bacterianas são incubados e tratados de acordo com as necessidades experimentais. O RNA total é extraído das células, tratadas com ADNase I para remover os vestígios de ADN e submetidos a uma reacção de transcrição inversa utilizando iniciadores fluorescentes específicos de ADN alvo produzindo cDNA. O ADN genómico ou plasmídeos são extraídos e subsequentemente utilizada para a fluorescentes reacções de sequenciação de Sanger para comparação do tamanho com fragmentos de cDNA. Produtos de extensão dos iniciadores são executados juntamente com os produtos de sequenciação de Sanger sobre um gel de poliacrilamida desnaturante de ureia e analisadas com um microscópio a laser e automatizado. A base de seqüenciamento que se alinha com a banda de cDNA é a last base da extremidade 5 'de cDNA (seta azul). Mais informações em Fekete, et al. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Uma visão geral de todo o processo de extensão do primer pode ser encontrada na Figura 1. Resumidamente, as células bacterianas são cultivadas, colhidas, o sedimento de células lisadas e o RNA extraído. RNA purificado é então tratado com ADNase I para remover vestígios de moléculas de ADN, que possam actuar como modelos para a transcriptase reversa. Iniciadores fluorescentes específicos são adicionados ao ARN, hibridados com a região de interesse e subsequentemente objecto de transcrição reversa, resultando numa única cadeia de ADN complementar (cDNA). Uma escada de sequenciação é criado por sequenciação de Sanger tradicional utilizando iniciadores fluorescentes e separados num gel de poliacrilamida desnaturante a par dos fragmentos de cDNA de extensão de iniciadores. A resultantegel é analisado por comparação das bandas fluorescentes, permitindo a identificação de terminais 5 'de interesse. Pontos de partida de transcrição e locais de processamento são, então, avaliados individualmente pela comparação de seqüências.

<table><tbody><tr><td>A transcriptase reversa AMV (20-25 U/&micro; l)</td> <td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (livre de RNase)</td> <td>Ambion (tecnologias de vida)</td> <td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento FastPrep-24</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Primers marcados com fluorescência</td><td>Biômeros</td><td>n/a</td><td>5' DY-681 modificação de " comum" Oligonucleotídeos de DNA. Corantes compatíveis, como o LICOR IRDye 700/800, também estão disponíveis em outros fornecedores, como IDTdna.</td></tr><tr><td>Li-Cor 4200 Sequenciador incl. ImagIR Software de coleta de dados</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>Produto descontinuado</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Ambion (tecnologias de vida)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de preparação de plasmídeo mini</td><td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40% Concentrado</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>BUFFER DE ARMAZENAMENTO DE RNA</td><td>Ambion (tecnologias de vida)</td> <td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P / C / I</td><td>Carl Roth</td><td>X985.3</td><td>Alternativa: " Ácido-fenol: clorofórmio, pH 4,5 (com IAA, 125: 24: 1) " de Ambion (AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&bull; Em Inibidor de RNase</td><td>Ambion (life technologies)</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sequenase kit de sequenciamento de ciclo de primer marcado com fluorescência com 7-deaza-dGTP</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagente</td><td>life technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia/Silica Beads 0.1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescência baseado técnica extensão primer para determinar transcriptional pontos de partida e de clivagem sites de rnases in vivo

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

A fluorescência baseada extensão do iniciador (FPE) é um método molecular para determinar pontos de partida da transcrição ou locais de processamento de moléculas de RNA. Isto é conseguido através de transcrição reversa do ARN de interesse, utilizando iniciadores marcados com fluorescência específicos e análise subsequente dos fragmentos de ADNc resultantes por electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida. Simultaneamente, uma reacção de sequenciação de Sanger tradicional é executado sobre o gel para mapear as extremidades dos fragmentos de ADNc correspondentes às suas bases exactas. Em contraste com 5&#39;-RACE (Amplificação Rápida de Extremidades de ADNc), no qual o produto deve ser clonados e sequenciados vários candidatos, a maior parte dos fragmentos de ADNc gerados por extensão do iniciador pode ser detectado em simultâneo uma corrida de gel. Além disso, todo o procedimento (a partir de transcrição reversa para análise final dos resultados) pode ser completada em um dia de trabalho. Ao utilizar os iniciadores marcados com fluorescência, a utilização de reagentes perigosos isótopo radioactivo marcadopode ser evitada e os tempos de processamento são reduzidos como produtos podem ser detectadas durante o processo de electroforese. No protocolo seguinte, nós descrevemos um método de extensão do iniciador fluorescente in vivo para detectar de forma fiável e rápida extremidades 5 &#39;dos RNAs para deduzir pontos de partida da transcrição e locais de processamento de RNA (por exemplo, por componentes do sistema de toxina-antitoxina) em S. aureus, E. coli e outras bactérias.

Como representado na Figura 6, uma reacção de extensão do iniciador pode ser utilizado para determinar os pontos de partida da transcrição de transcritos de interesse e pode ajudar a deduzir regiões promotoras (tipicamente identificados por elementos de -10 e -35). O nível superior (mais longa) fragmento de cDNA representa o "fim do ARNm 5 e, portanto, pode ser facilmente mapeada quando comparada com a escada de sequenciação. <img alt="início da transcrição ompA, clivagem de ...

Descrevemos aqui um método de extensão de primer baseado em fluorescência para determinar os pontos de partida transcricionais de transcritos bacterianos e processamento de RNA in vivo usando um sequenciador de gel automatizado.

Fluorescência Baseado Técnica Extensão Primer para determinar Transcriptional pontos de partida e de clivagem Sites de RNases In Vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar pontos de partida transcricionais e locais de clivagem de RNAs in vivo de bactérias usando uma reação de extensão de primer fluorescente. Isso é feito primeiro cultivando bactérias como E coli ou S aria, e isolando as moléculas de RNA. Em seguida, o RNA é transcrito reversamente usando primers fluorescentes específicos e transcriptase reversa, resultando em fragmentos de CD NA.Em seguida, o DNA ou plasmídeos são isolados das células bacterianas e uma escada de sequenciamento Sanger fluorescente é criada a partir do modelo de DNA usando um kit de sequenciamento. Finalmente, os fragmentos de CDNA e escadas de sequenciamento são separados e detectados simultaneamente em um gel de poliacrilamida usando um sequenciador de gel automatizado e comparados entre si. Em última análise, a extensão do primer fluorescente é usada para mapear as cinco extremidades principais das moléculas de RNA até uma resolução de uma base.A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos, como extensão primária baseada em raça ou radioatividade, é a identificação rápida das cinco extremidades das moléculas de RNA, pois a detecção ocorre simultaneamente durante a eletroforese. A sensibilidade é semelhante às extensões primárias baseadas em atividade vermelha, mas permite que o pessoal do laboratório use esse método sem a necessidade de treinamento de segurança de radiação de atividade de taxa. Usamos com sucesso esta técnica de extensão primária fluorescente para investigar os componentes de RNAs de sistemas de toxina antitoxina.Os estafilococos que demonstrarão o procedimento serão Christopher Schuster, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Depois de preparar um alto rendimento de RNA e projetar primers de acordo com o protocolo de texto, realize a reação de extensão do primer pré-aquecendo primeiro o termociclador a 95 graus Celsius. Para cada amostra de RNA, misture os seguintes compostos em um tubo de PCR, desnature as amostras por um minuto a 95 graus Celsius.Em seguida, coloque os tubos no gelo por cinco minutos para hibridizar os primers e o RNA. Em seguida, defina a máquina de PCR para 47 graus Celsius. Em seguida, prepare a mixagem master de transcrição reversa conforme descrito aqui.Adicione quatro microlitros, uma mistura mestre de transcrição reversa a cada amostra de RNA hibridizado e incube os tubos por uma hora a 47 graus Celsius. Para interromper a reação, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por dois minutos. Em seguida, adicione seis microlitros de corante de carga de amida e armazene durante a noite ou até duas semanas no escuro a menos 20 graus Celsius.Depois de preparar o DNA genômico ou plasmídeos, de acordo com o protocolo de texto, monte a reação de sequenciamento de Sanger misturando 12 microlitros de cerca de 10 a 15 microgramas de DNA genômico ou 100 a 500 nanogramas de DNA plasmídico com um microlitro de primer marcado com fluorescência e um microlitro de pipeta DMSO. Um microlitro de cada mistura de sequenciamento em tubos de PCR pré-marcados separados. Em seguida, adicione três microlitros da mistura de primer D-N-A-D-M-S-O a cada tubo.Defina a máquina de PCR para o seguinte programa e execute-a depois de colocar as amostras na máquina. Após a execução, adicione seis microlitros de corante de carga às amostras e depois no gelo. Se estiver usando imediatamente ou a menos 20 graus Celsius a longo prazo usando placas limpas de 25 centímetros sem poeira, coloque espaçadores de 0.25 milímetros na placa de vidro traseira e abaixe a placa de vidro entalhada na parte superior com a extremidade entalhada das placas de vidro e os pilotos de entrada do trilho voltados para cima.Prenda os trilhos de gel em ambos os lados das placas de vidro e aperte levemente os botões Para fundir o gel. Combine os compostos listados aqui em um béquer com uma barra de agitação e coloque em uma placa de agitação magnética. Imediatamente após adicionar um PS e agrupado, use uma seringa de 50 mililitros para pegar a solução de acrilamida e coloque um filtro de 0,45 nanômetro na ponta.Coloque as placas imprensadas em um ângulo de 10 a 20 graus e distribua lentamente a solução de gel entre as placas de vidro enquanto move continuamente a ponta da seringa de um lado para o outro. Pare de dispensar a solução de gel assim que ela encontrar a extremidade inferior das placas de vidro. Usando um gancho de bolha, remova quaisquer bolhas que possam ter se formado.Em seguida, deslize o espaçador de bolso de gel entre as placas de vidro na extremidade entalhada, submergindo-o na solução de gel e fixando-o prendendo a placa de fundição, aperte levemente os parafusos do trilho superior e deixe o gel endurecer por uma a duas horas. Antes de remover a placa de fundição e o espaçador de bolso, use água destilada deionizada para limpar o bolso de resíduos de sal e gel para passar o gel. Deslize o suporte do tanque tampão nos trilhos de gel nas placas de vidro frontais e aperte os botões.Coloque o gel no tanque de gel inferior do gerador de imagens de gel automatizado contra a placa de aquecimento e fixe deslizando o piloto de entrada do trilho nos suportes do aparelho. Use um tampão XTBE para encher as câmaras tampão de gel superior e inferior. Em seguida, feche a câmara tampão inferior e use o cabo de alimentação para conectar a câmara tampão superior à energia.Se houver sal na bolsa de gel, use tampão para pipetar repetidamente na bolsa para limpá-la. Em seguida, use a tampa superior do buffer para fechar a câmara superior do tanque buffer. Depois de ligar o gerador de imagens e o computador e iniciar o software de coleta de dados IR da imagem base de acordo com o protocolo de texto, use as configurações listadas aqui para configurar o controle do scanner.Em seguida, pré-execute o gel vazio por 20 minutos selecionando voltage ligado e pressionando enter. Enquanto isso, usando uma máquina de PCR, aqueça a escada de sequenciamento e os produtos de extensão do primer a 90 graus Celsius por dois minutos Antes de resfriar no gelo, pare a eletroforese, abra o sequenciador de gel automatizado e remova a tampa superior do tanque tampão. Em seguida, insira o pente dente de tubarão entre as placas de vidro e com os dentes de tubarão.Perfure levemente a pipeta de gel de um a dois microlitros dos produtos de extensão do primer ou sequenciando reações em escada em cada bolsa de gel. Para quaisquer bolsos vazios. Use corante de carregamento para preenchê-los para evitar comportamento de funcionamento inconsistente, feche o tanque tampão e a porta do sequenciador de gel.Em seguida, inicie a eletroforese selecionando voltage ligado para o laser, selecione o status de varredura ativado e pressione enter. Uma vez que a região de interesse tenha passado pelo laser, pare a eletroforese como mostrado aqui. Uma reação de extensão do primer pode ser usada para determinar os pontos de partida transcricionais ou TSP de transcritos de interesse e pode ajudar a deduzir regiões promotoras.Neste exemplo, o TSP do mRNA do MPE foi identificado como G consistente com dados publicados anteriormente. Os elementos promotores menos 35 e menos 10 foram deduzidos como T-T-G-T-A-A e T-A-G-A-C-T, e esses motivos diferem apenas para bases de cada uma de suas sequências de consenso usando extensão de primer para identificar produtos de clivagem de mRNA. O mapeamento de RNA de clivagem próximo ao CO START pelo RNA Ybi SEC dois é mostrado aqui quando os RNAs não estão presentes ou inativos, nenhum produto de extensão de primer é formado próximo ao CO START como resultado da atividade dos RNAs.No entanto, duas bandas fortes aparecem logo a jusante da camada inicial nesta figura mostra um experimento de extensão de primer com falha devido ao excesso de RNA na reação de transcrição reversa que impede a identificação de bandas individuais. Isso demonstra que a quantidade total de RNA modelo deve ser ajustada à abundância do RNA de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como elucidar pontos de partida transcricionais e locais de clivagem de RNAs in vivo usando primers fluorescentes e um sequenciador de gel automatizado com alguma prática.Este método é rápido e fácil de executar. Boa sorte com seus experimentos.

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Biology

Biologia

Descrevemos os métodos fotobranqueamento inclusive Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em Fotodegradação (FLIP) para monitorar a dinâmica de proteínas da cromatina no tronco embrionárias (ES) células. Proteínas da cromatina dinâmica, que é considerado um dos meios para estudar a plasticidade da cromatina, é reforçada em células pluripotentes.

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

As exonucleases desempenham papéis críticos na garantia da estabilidade do genoma. A perda da função da exonuclease WRN resulta em envelhecimento prematuro. O estudo de substratos e outros requisitos da nuclease in vitro pode ajudar a elucidar seu papel in vivo. Aqui demonstramos um ensaio rápido e reprodutível baseado em fluorescência para medir sua atividade de nuclease.

Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

Neste trabalho, fornecemos um fluxo de trabalho experimental de como os intensificadores ativos podem ser identificados e validados experimentalmente.

Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

Aqui, nós descrevemos o conjunto de complexos do alongamento do polymerase II (pol II) do RNA que exigem somente o ADN sintético curto e oligonucleotídeos do RNA e o pol purificado II. Esses complexos são úteis para estudar mecanismos subjacentes ao processamento cotranscricional de transcrições associadas ao complexo de alongamento pol II.

Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

Fluorescência de RNA de molécula única in situ hibridização (smFISH) é um método para quantificar com precisão os níveis e a localização de RNAs específicos no nível único celular. Aqui, relatamos nossos protocolos de laboratório validados para processamento de banco molhado, imagem e análise de imagens para quantificação de células únicas de RNAs específicas.

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Este estudo apresenta um ensaio FRET raciométrico simples e fácil de usar para a detecção e avaliação quantitativa da atividade da DNase e demonstra sua aplicação na análise de uma nuclease fraca.

Avaliação da atividade da DNase por transferência de energia de ressonância de fluorescência raciométrica

Este protocolo mede quantitativamente a estabilidade e a meia-vida de RNAs potenciadores intergênicos e intragênicos em células-tronco embrionárias de camundongo, utilizando tratamento com Actinomicina D, RT-qPCR e análise de regressão não linear. Estratégias de normalização específicas de posição são incorporadas para modelar com precisão a dinâmica do decaimento do eRNA de forma dependente do contexto.

Avaliação Quantitativa Otimizada da Estabilidade do RNA Potenciador em Células-Tronco Embrionárias de Camundongos

Aprenda a técnica de extensão de primer baseada em fluorescência para mapear pontos de início transcricional e sítios de clivagem de RNA em bactérias in vivo. Este método utiliza sequenciador automatizado de gel para detecção de alta resolução.

Fluorescência Baseado Técnica Extensão Primer para determinar Transcriptional pontos de partida e de clivagem Sites de RNases In Vivo (Vídeo) | JoVE Journal

Fluorescência Baseado Técnica Extensão Primer para determinar Transcriptional pontos de partida e de clivagem Sites de RNases In Vivo

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