Fluorescência Baseado Técnica Extensão Primer para determinar Transcriptional pontos de partida e de clivagem Sites de RNases In Vivo

O objetivo geral deste procedimento é identificar pontos de partida transcricionais e locais de clivagem de RNAs in vivo de bactérias usando uma reação de extensão de primer fluorescente. Isso é feito primeiro cultivando bactérias como E coli ou S aria, e isolando as moléculas de RNA. Em seguida, o RNA é transcrito reversamente usando primers fluorescentes específicos e transcriptase reversa, resultando em fragmentos de CD NA.

Em seguida, o DNA ou plasmídeos são isolados das células bacterianas e uma escada de sequenciamento Sanger fluorescente é criada a partir do modelo de DNA usando um kit de sequenciamento. Finalmente, os fragmentos de CDNA e escadas de sequenciamento são separados e detectados simultaneamente em um gel de poliacrilamida usando um sequenciador de gel automatizado e comparados entre si. Em última análise, a extensão do primer fluorescente é usada para mapear as cinco extremidades principais das moléculas de RNA até uma resolução de uma base.

A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos, como extensão primária baseada em raça ou radioatividade, é a identificação rápida das cinco extremidades das moléculas de RNA, pois a detecção ocorre simultaneamente durante a eletroforese. A sensibilidade é semelhante às extensões primárias baseadas em atividade vermelha, mas permite que o pessoal do laboratório use esse método sem a necessidade de treinamento de segurança de radiação de atividade de taxa. Usamos com sucesso esta técnica de extensão primária fluorescente para investigar os componentes de RNAs de sistemas de toxina antitoxina.

Os estafilococos que demonstrarão o procedimento serão Christopher Schuster, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Depois de preparar um alto rendimento de RNA e projetar primers de acordo com o protocolo de texto, realize a reação de extensão do primer pré-aquecendo primeiro o termociclador a 95 graus Celsius. Para cada amostra de RNA, misture os seguintes compostos em um tubo de PCR, desnature as amostras por um minuto a 95 graus Celsius.

Em seguida, coloque os tubos no gelo por cinco minutos para hibridizar os primers e o RNA. Em seguida, defina a máquina de PCR para 47 graus Celsius. Em seguida, prepare a mixagem master de transcrição reversa conforme descrito aqui.

Adicione quatro microlitros, uma mistura mestre de transcrição reversa a cada amostra de RNA hibridizado e incube os tubos por uma hora a 47 graus Celsius. Para interromper a reação, aqueça as amostras a 95 graus Celsius por dois minutos. Em seguida, adicione seis microlitros de corante de carga de amida e armazene durante a noite ou até duas semanas no escuro a menos 20 graus Celsius.

Depois de preparar o DNA genômico ou plasmídeos, de acordo com o protocolo de texto, monte a reação de sequenciamento de Sanger misturando 12 microlitros de cerca de 10 a 15 microgramas de DNA genômico ou 100 a 500 nanogramas de DNA plasmídico com um microlitro de primer marcado com fluorescência e um microlitro de pipeta DMSO. Um microlitro de cada mistura de sequenciamento em tubos de PCR pré-marcados separados. Em seguida, adicione três microlitros da mistura de primer D-N-A-D-M-S-O a cada tubo.

Defina a máquina de PCR para o seguinte programa e execute-a depois de colocar as amostras na máquina. Após a execução, adicione seis microlitros de corante de carga às amostras e depois no gelo. Se estiver usando imediatamente ou a menos 20 graus Celsius a longo prazo usando placas limpas de 25 centímetros sem poeira, coloque espaçadores de 0.25 milímetros na placa de vidro traseira e abaixe a placa de vidro entalhada na parte superior com a extremidade entalhada das placas de vidro e os pilotos de entrada do trilho voltados para cima.

Prenda os trilhos de gel em ambos os lados das placas de vidro e aperte levemente os botões Para fundir o gel. Combine os compostos listados aqui em um béquer com uma barra de agitação e coloque em uma placa de agitação magnética. Imediatamente após adicionar um PS e agrupado, use uma seringa de 50 mililitros para pegar a solução de acrilamida e coloque um filtro de 0,45 nanômetro na ponta.

Coloque as placas imprensadas em um ângulo de 10 a 20 graus e distribua lentamente a solução de gel entre as placas de vidro enquanto move continuamente a ponta da seringa de um lado para o outro. Pare de dispensar a solução de gel assim que ela encontrar a extremidade inferior das placas de vidro. Usando um gancho de bolha, remova quaisquer bolhas que possam ter se formado.

Em seguida, deslize o espaçador de bolso de gel entre as placas de vidro na extremidade entalhada, submergindo-o na solução de gel e fixando-o prendendo a placa de fundição, aperte levemente os parafusos do trilho superior e deixe o gel endurecer por uma a duas horas. Antes de remover a placa de fundição e o espaçador de bolso, use água destilada deionizada para limpar o bolso de resíduos de sal e gel para passar o gel. Deslize o suporte do tanque tampão nos trilhos de gel nas placas de vidro frontais e aperte os botões.

Coloque o gel no tanque de gel inferior do gerador de imagens de gel automatizado contra a placa de aquecimento e fixe deslizando o piloto de entrada do trilho nos suportes do aparelho. Use um tampão XTBE para encher as câmaras tampão de gel superior e inferior. Em seguida, feche a câmara tampão inferior e use o cabo de alimentação para conectar a câmara tampão superior à energia.

Se houver sal na bolsa de gel, use tampão para pipetar repetidamente na bolsa para limpá-la. Em seguida, use a tampa superior do buffer para fechar a câmara superior do tanque buffer. Depois de ligar o gerador de imagens e o computador e iniciar o software de coleta de dados IR da imagem base de acordo com o protocolo de texto, use as configurações listadas aqui para configurar o controle do scanner.

Em seguida, pré-execute o gel vazio por 20 minutos selecionando voltage ligado e pressionando enter. Enquanto isso, usando uma máquina de PCR, aqueça a escada de sequenciamento e os produtos de extensão do primer a 90 graus Celsius por dois minutos Antes de resfriar no gelo, pare a eletroforese, abra o sequenciador de gel automatizado e remova a tampa superior do tanque tampão. Em seguida, insira o pente dente de tubarão entre as placas de vidro e com os dentes de tubarão.

Perfure levemente a pipeta de gel de um a dois microlitros dos produtos de extensão do primer ou sequenciando reações em escada em cada bolsa de gel. Para quaisquer bolsos vazios. Use corante de carregamento para preenchê-los para evitar comportamento de funcionamento inconsistente, feche o tanque tampão e a porta do sequenciador de gel.

Em seguida, inicie a eletroforese selecionando voltage ligado para o laser, selecione o status de varredura ativado e pressione enter. Uma vez que a região de interesse tenha passado pelo laser, pare a eletroforese como mostrado aqui. Uma reação de extensão do primer pode ser usada para determinar os pontos de partida transcricionais ou TSP de transcritos de interesse e pode ajudar a deduzir regiões promotoras.

Neste exemplo, o TSP do mRNA do MPE foi identificado como G consistente com dados publicados anteriormente. Os elementos promotores menos 35 e menos 10 foram deduzidos como T-T-G-T-A-A e T-A-G-A-C-T, e esses motivos diferem apenas para bases de cada uma de suas sequências de consenso usando extensão de primer para identificar produtos de clivagem de mRNA. O mapeamento de RNA de clivagem próximo ao CO START pelo RNA Ybi SEC dois é mostrado aqui quando os RNAs não estão presentes ou inativos, nenhum produto de extensão de primer é formado próximo ao CO START como resultado da atividade dos RNAs.

No entanto, duas bandas fortes aparecem logo a jusante da camada inicial nesta figura mostra um experimento de extensão de primer com falha devido ao excesso de RNA na reação de transcrição reversa que impede a identificação de bandas individuais. Isso demonstra que a quantidade total de RNA modelo deve ser ajustada à abundância do RNA de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como elucidar pontos de partida transcricionais e locais de clivagem de RNAs in vivo usando primers fluorescentes e um sequenciador de gel automatizado com alguma prática.

Este método é rápido e fácil de executar. Boa sorte com seus experimentos.