Name: Método simples para DNA de Fluorescência In Situ A hibridação com Cromossomos Squashed (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprenda hibridização in situ de DNA fluorescente para mapear sequências heterocromáticas em cromossomos de Drosophila. Este método simples utiliza microscopia de fluorescência e requer poucos reagentes.

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Agradecemos a Zhaohua Irene Tang, do Departamento de Ciências da WM Keck, pelo uso de seu microscópio de epifluorescência e ao laboratório Werren por doar Nasonia para dissecações. Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa NIH-NRSA (5F32GM105317-02) para AML.

1. Dissecção de tecido e fixação (60 min) <ol><li> Para cérebros de Drosophila, colocar larvas 3rdin uma gota de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato). Escolha grande larvas 3º que estão rastreando ativamente de frascos ou garrafas que não estão superlotadas. <ol><li> Use um par ultrafine pinça para agarrar os ganchos na boca e outro par de pinça para agarrar 2/3 para baixo o comprimento do corpo (Figura 1A, B). Puxe delicadamente sobre os ganchos na boca para expor o cérebro, os gânglios ventral, glândulas salivares e parte do trato digestivo das larvas. Use as pinças para separar o cérebro e gânglios ventral (Figura 1A, B) a partir de outros tecidos e introduzi-lo numa gotícula de 1x PBT (salino tamponado com fosfato com Tween) numa placa de Petri de plástico. </li></ol></li><li> Para Nasonia dissecções testículo, escolha do sexo masculino pupas 3 dias de idade (corpos amarelos com olhos vermelhos). Masculino Nasonia têm comprimentos pequenos almofada asa em relação à females durante a fase de pupa (Figura 1C). <ol><li> Segure a pupa, na parte superior do abdômen, perto da região torácica, com um par de pinça, e usando o outro par de pinça, pegue a ponta muito distal do abdômen e retirar os testículos lágrima em forma de gota (que será cercado por gordura corpo que pode ser abalado suavemente; Figura 1D). Retire qualquer parte do corpo exteriores dos testículos, o que evitará esmagamento adequada, e coloque em uma gota de 1x PBT em uma placa de Petri de plástico. </li></ol></li><li> Para cada slide, dissecar um total de quatro ou cinco amostras de tecido (ie., Drosophila cérebros larval ou testículos Nasonia). NOTA: Mais de cinco amostras levará a núcleos superlotadas e cromossomos. </li><li> Opcionalmente, para conseguir alguma separação de cromátides irmãs em regiões eucromáticos de cromossomos mitóticos, tratar o tecido com uma solução hipotônica: transferir cérebros de 1x PBT para uma gota de citrato de sódio a 0,5% para 5-10 (não mais do que 10) min. NOTA: A colchicina (um inibidor da mitose) pode ser útil para aumentar o número de figuras de mitose na metáfase 11. No entanto, o seu uso é desnecessário se muito grande larvas saudáveis ​​são usados, e até mesmo indesejável, pois pode afetar negativamente a resolução cromossomo, espalhando e morfologia. </li><li> Coloque uma gota (~ 20 ul) de solução fixadora (2,5% de paraformaldeído em ácido acético 45%) sobre a superfície de uma lamela de cobertura tratadas com Sigmacote limpo. NOTA: Certifique solução fixadora nova para cada dia de uso. Soluções fixadoras que variam 1,8-3,7% de paraformaldeído em ácido acético 45% produzir os melhores resultados para os peixes. Usando diferentes do cérebro ou testículos tecidos, ou adaptar este protocolo de imuno-FISH pode exigir experimentando com diferentes fixadores (para uma lista de diferentes fixadores, ver 12). </li><li> Transferir cuidadosamente cada amostra de tecido a partir do tampão de dissecação (1x PBT) na gotícula fixador com pinças ultrafinas, minimizing a transferência de tampão de dissecação para a solução fixadora. Colocar as amostras de tecido de modo a que eles estão uniformemente espaçados uns dos outros no interior da gotícula de fixador. Incubar os tecidos em fixador durante 4 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Com cuidado, coloque um slide rosto poli-revestido de lisina para baixo para o deslizamento de tecido e tampa. Não pressione a este ponto, mas sim permitir que os dois entrar em contato com levemente para que a lamínula varas para o lado de baixo do slide. Inverter o slide para que o deslizamento tampa está no topo. </li><li> Sanduíche do deslizamento slide / tecido / cobertura dentro de um pedaço dobrado de papel de filtro. Em uma superfície estável, usando o polegar, pressione muito firmemente em linha reta para baixo para a posição diretamente acima da lamela. Tenha cuidado para evitar deslizamento lateral da lamela (isso irá provocar manchas do tecido). </li><li> Mergulhe o slide / tecido / tampa de deslizamento em nitrogênio líquido (ver aparelho na Figura 1E, F), e deixe descansar até que o nitrogênio pára fervente (não é fINE). Remover o slide e encaixe imediatamente a lamínula com uma lâmina de barbear fresco sacudindo um canto da lamínula em um sentido ascendente (evitar riscar o tecido fixado com a lâmina de barbear). <ol><li> O pré-resfriamento do slide / tecido / lamela em um bloco de gelo seco, tampa escorregar, por 1-2 min antes de submergir em nitrogênio líquido vai ajudar a prevenir os slides de rachar. </li></ol></li><li> Colocar imediatamente o diapositivo com o tecido em um frasco Coplin preenchido com etanol a 100% à temperatura ambiente e deixar em repouso durante pelo menos 5 minutos (este tempo pode ser mais longo, se necessário). NOTA: etanol a 100% frio também poderia ser utilizado. </li><li> Remover o slide com o tecido, pavio fora excesso de etanol com uma Kimwipe (sem tocar no tecido fixo), e deixar o slide ao ar seco por 1 hora. <ol><li> Prossiga diretamente para a etapa 2 ou manter lâminas secas em baixa umidade do ar ou em uma câmara de dessecação por semanas a até meses antes de realizar a hibridação. </li></ol></li></ol> Figura 1: (A) A 3 rd instar Drosophila larva (à direita), com posições indicadas por onde pegar os ganchos na boca (indicado com *) e 2/3 do caminho para baixo as larvas para dissecar cérebros; (À esquerda) uma vista esquemática de uma larva de uma mesma fase de desenvolvimento, que descreve a posição relativa do cérebro no interior da cabeça de larvas. (B) O cérebro e gânglios dissecados a partir de uma ventral 3 Drosophila larva de terceiro instar (direita) e uma representação esquemática do presente tecido (à esquerda). pupa Nasonia (C) 3 dias de idade, em fase de olhos vermelhos corpo-amarelo. (D) Um par testis dissecado a partir de um velho pupa macho Nasonia 3 dia (à direita) com posições indicando onde pegar a pupa no posterior do abdómen (denotado com *) e a meio caminho no corpo; (À esquerda) esquemático masculino que descreve e feminino foip pupas; pupas macho pode ser distinguido pelas asas que não se estendem passado o perfil sagital (seta preta), em contraste com as fêmeas, que têm asas que se estendem para além do perfil; a posição relativa do par de testículo é mostrado na pupa de macho. (E) O aparelho de uma sequência de clipes-e método (F) utilizadas para mergulhar as lâminas em um vaso de azoto líquido. Várias cordas paperclip pode ser utilizado para a imersão simultânea de múltiplas lâminas. 2. A hibridação in situ (30 minutos no dia 1; 1 hr-2,5 h para sondas longas-no dia 2) <ol><li> Adicionar 1 ul (100 ng) de cada sonda de 20 ul de tampão de hibridação de 1,1x. Pipetar sonda / tampão de hibridação sobre a superfície do tecido fixado (evitar tocar no tecido). </li><li> Com cuidado, coloque uma lamela diretamente sobre o tampão sonda / hibridação, certificando-se de que a tampa de deslizamento é centrado diretamente sobre o tecido. O tampão deve migrar para poenviar um e borda externa da tampa de deslizamento, sem deixar bolhas de ar. Nota: Pequenas bolhas que não contactam tecido não colocam quaisquer problemas para o procedimento. Remover grandes bolhas com cuidado levantando um canto da lamela e cuidadosamente soltando-o de volta para o slide. </li><li> Coloque o deslizamento slide / tecido / cobertura sobre a superfície de um bloco pré-aquecido a 95 ° C (cover escorregar). Cubra com um pedaço grande de papel alumínio para evitar a exposição à luz. Com o deslizar incubar a 95 ° C durante 5 min. NOTA: Um bloco de calor típico com furos para tubos podem ser viradas para proporcionar uma superfície plana para colocar o slide / tecido / lamela. </li><li> Retire o slide, deixando-a esfriar um pouco até que esteja quente ao toque. Cuidadosamente enrole um pedaço de Parafilm esticada ao redor da lamínula para selar o líquido abaixo dela. </li><li> Colocar a lâmina selada dentro de uma câmara de humidade e colocar a câmara numa incubadora com uma pré-aquecido a 30 ° C. Incubar a 30 ° C durante 4 h até durante a noite.<ol><li> Criar uma câmara de umidade a partir de uma caixa de ponta vazio ou recipiente Tupperware pálpebras com Kimwipes umedecidas ou toalhas de papel colocadas na parte inferior. NOTA: As sondas de oligo de ADN de cadeia simples foram concebidos para ser 28-33 bases para alcançar uma temperatura de fusão teórica (T m) dos 45-47 ° C. Estes m varia de comprimento e T refletir o fato de que muitas seqüências repetitivas que estudamos são AT-ricos e, portanto, têm baixo teor de GC. Sondas maiores, provavelmente, têm valores maiores M T; isto pode resultar em maior fundo de hibridação à temperatura de hibridação padrão de 30 ° C. Assim, resolução de alguns problemas com as temperaturas de hibridação podem ser necessários para obter os melhores resultados. Para encontrar a melhor temperatura de hibridização, aumento (ou redução) a temperatura de 5 ° C, de forma incremental. </li></ol></li><li> Retire cuidadosamente o Parafilm do slide e, em seguida, retire cuidadosamente a cobertura de vidro, levantando lentamente um canto. Wash o slide três vezes para 15 min cada lavagem em tampão SSC 0,1x. Cubra o recipiente Coplin com folha de alumínio durante as lavagens para minimizar a exposição à luz. </li><li> Se não estiver usando uma sonda biotinilado longa, vá para o passo 2.8. <ol><li> Se estiver usando uma sonda longa biotinilado, secar a área em volta do tecido com um Kimwipe, tomando cuidado para não tocar no próprio tecido. Coloque 100 ml de solução sobre o tecido bloqueio e cobrir suavemente com uma lamela, tomando cuidado para evitar bolhas de armadilhagem. Enrole a deslizar sobre a lamela com Parafilm e lugar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Remova cuidadosamente a lamela e secar ao redor do tecido com um Kimwipe. Pipet 100 l de rhodamine-avidina diluído 1: 1.000 em cuidados SBT sobre o tecido e cubra delicadamente com uma lamela, tomando para evitar a captura de bolhas. Enrole a deslizar sobre a lamela com Parafilm e lugar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Remova cuidadosamente a lamela e lavar o slide 3 vezes por 5 minutos cada em 4x SSCT e depois3 vezes por 5 minutos cada em 0,1x SSC. NOTA: As lâminas podem ser lavadas por longos períodos de tempo. </li></ol></li><li> Remover o slide e secar ao redor do tecido com um Kimwipe seco para remover o excesso de tampão (evite tocar no tecido). Coloque o lado do tecido slide-up em um local escuro durante 10-15 minutos ou até que a umidade se dissipa completamente. </li><li> Pipetar 11 ul de meio de montagem Vectashield (com 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole-DAPI) sobre o tecido. Com cuidado, coloque uma lamela limpa (não tratados com Sigmacote) diretamente sobre o centro do meio de montagem e tecido. O meio de montagem deve migrar lentamente para fora, para as bordas da lamínula. NOTA: Se o meio de montagem não conseguir atingir a extremidade da lamela em todos os lados, em seguida, um adicional de 1-2 uL de meio de montagem pode ser aplicada a uma posição na borda da lâmina de cobertura para preencher o volume necessário. Neste caso, certifique-se de limpar qualquer excesso médio da superfície do slide antesvedação. </li><li> Selar as bordas da lamínula com unha polonês. Evite pintar a unha polonês sobre a amostra de tecido. </li><li> Coloque o slide na posição vertical em um local escuro e deixar a unha seca polonês até que esteja completamente rígido (normalmente, 30 min ou mais). Neste ponto, a imagem do tecido ou armazenar a -20 ° C durante até 1 semana mais tarde para a imagiologia. </li></ol> Buffer / Receitas Solution 10x PBS <ul><li> 80 g de NaCl </li><li> 2,0 g de KCl </li><li> 14,4 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g de KH 2 PO 4 </li><li> pH para 7,4, H2O a 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml de PBS 10x </li><li> 45 ml de H2O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g de NaCl </li><li> 88,2 g de Na Citrato </li><li> em 800 ml de H2O </li><li> pH a 7, H2O a 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml de 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 0,1x SSC <ul><li> 5 ml de 20x SSC </li><li> 995 ml de H2O </li></ul> Mistura de hibridação (20 ul; modificado a partir do 11) <ul><li> 10 ul de formamida </li><li> 4 ul de 50% de sulfato de dextrano </li><li> 2 ul de 20x SSC </li><li> 4 ul de H2O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml de 20x SSC </li><li> 0,01 g de Albumina de Soro Bovino (BSA) </li><li> 10 ul de Tween 20 </li><li> 7,9 ml de H2O </li></ul> A solução de bloqueio 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g de BSA </li><li> 10 ul de Tween 20 </li><li> 2 ml de 20x SSC </li><li> 8 ml de H2O </li></ul> Solução fixadora com paraformaldeído (1 ml) <ul><li> 393,75 ul H 2 O (adicione água primeiro) </li><li> 450 ácido acético glacial ul </li><li> 156,25 ul 16% de paraformaldeído </li></ul>

<ol><li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
<li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li>
<li>Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+polytene+chromosomes+in+Drosophila+using+digoxigenin-labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).</li>
<li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatic+sequences+in+a+Drosophila+whole-genome+shotgun+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly.</a> Genome Biology. 3 (12), (2002).</li>
<li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+finishing+and+mapping+of+Drosophila+melanogaster+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin.</a> Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).</li>
<li>Treangen, T. J., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+DNA+and+next-generation+sequencing%3A+computational+challenges+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+pericentric+heterochromatin+by+comparative+genomic+hybridization+analysis+and+chromosome+deletions+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).</li>
<li>Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+of+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+larval+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li>
<li>Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+Y-linked+genes+to+the+dot+chromosome+in+Drosophila+pseudoobscura%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura.</a> Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).</li>
<li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234(2009).</li>
<li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+l%281%29zw10+gene+product%2C+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation%2C+is+redistributed+at+anaphase+onset%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li>
<li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li>
<li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSR+%28paternal+sex+ratio%29+chromosomes%3A+the+ultimate+selfish+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse financeiros ou de qualquer outro tipo de interesse.

DNA ISH é freqüentemente usado para mapear sequências específicas para os cromossomas. Nós descrevemos um método simples para o ADN ISH optimizado para elevado número de cópias, sequências de heterocromatina. Em vez de utilizar lavagens numa solução de formamida, que é um requisito em outros protocolos ISH ADN existentes, colocamos lâminas montadas-tecido directamente sobre um bloco de pré-aquecida para desnaturar o ADN. Este método evita o uso de grandes quantidades de formamida. Um passo fundamental para a produção de...

ADN de hibridação in situ (ISH ADN) é um método vulgarmente utilizado para mapeamento de sequências para as regiões cromossómicas específicas. Sondas para regiões de cópia única dentro euchromatin pode ser gerado através de um punhado de abordagens, incluindo nick-tradução ou de fim-de rotulagem dos produtos de ADN longas 1,2 ea incorporação de deoxygenin (DIG) nucleotídeos -attached e seu reconhecimento através de uma ampla variedade de anticorpos conjugados do grupo 1-3. Visualização das sequências eucromáticos em poucos ou número único de cópia requer a utilização quer de sondas individuais grandes, com uma actividade específica elevada ou um cocktail de sondas múltiplas mais pequenas, que aumentam colectivamente sinal. Em contraste, as sequências altamente repetitivas encontradas na heterocromatina, tais como DNAs satélite, são alvos mais fáceis para DNA ISH porque normalmente existe como dezenas de milhares de repetições agrupados em regiões cromossômicas únicos conhecidos como blocos. Elementos de transposição também pode serencontrado em altos números de cópia na distinta loci cromossômica 2. Nestes casos, as sondas individuais com baixa actividade específica pode rotular eficazmente sequências de heterocromatina, devido à sua hibridação em múltiplos locais. Sondas para seqüências repetitivas podem ser sintetizados oligonucleotídeos comercialmente como curtos (30-50 pb) e quimicamente conjugado com qualquer um dos vários grupos fluorescentes diferentes. Mapeando seqüências repetitivas dentro heterochromatin por meio de tecnologias de sequenciamento do genoma-se difícil devido aos desafios enfrentados em andaimes de construção dentro de blocos de satélite altamente repetitivas 4-6,7. Atualmente, ISH se destaca como a forma mais eficaz de mapear essas seqüências ao nível sub-cromossomo. Essa estratégia é importante para o mapeamento de um grande número de sequências repetitivas que estão sendo descobertos por estudos de genoma e transcriptoma de sequenciamento em curso. A eficiência e facilidade de mapeamento de seqüências repetitivas nos cromossomos-montado slides seria greatly reforçada por um protocolo simplificado de DNA ISH. Por exemplo, os protocolos existentes para ADN ISH envolver múltiplas lavagens de tecidos hibridados em solução de formamida a 2,8, adicionando assim substancialmente para o tempo requerido para as sequências de mapeamento e também a produção de grandes quantidades de resíduos químicos para este reagente dispendioso. Aqui nós descrevemos um método DNA ISH revista que contorna a necessidade de lavagens formamida e utiliza equipamentos básicos de laboratório e reagentes. Este método foi originalmente projetado para o rápido mapeamento de seqüências de DNA altamente repetitivos em regiões heterocromáticas de neuroblastos de larvas de Drosophila usando oligos sintetizados no mercado que são conjugados com corantes fluorescentes. No entanto, este método também funciona para o mapeamento de seqüências repetitivas usando sondas maiores sintetizados através de outros meios 9,10 e em vários tipos de tecidos e de cromossomos diferentes. Além disso, este método pode ser utilizado para mapear sequências eucromáticos utilizando mais ou multiple, sondas curtas dentro da sequência euchromatic de interesse.

<table><tbody><tr><td>Lâminas revestidas de poli-L-lisina (lâminas regulares também podem ser usadas)</td> <td>Pinças ultrafinas Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(calibre 5)</td> <td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm lamínulas de cobertura</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote tratadas por imersão por 15 segundos, secando e limpando todos os vestígios de Sigmacote para que a lamínula fique clara</td></tr><tr>Papel de filtro<td>Sigmacote Sigma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr>Papel <td></td><td></td><td></td><td>de cera de parafina</td></tr><tr><td>Bloco de calor com termômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td></td>seca</tr><tr><td>Lâminas de</td><td></td><td></td><td></td>barbear</tr><tr><td>Câmara de umidade</td><td></td><td></td><td>caixa de ponta de pipeta vazia ou Tupperware, forrada com toalhas de papel umedecidas ou</td>potes</tr><tr><td></td> Kimwipes<td>Coplin</td><td></td><td>com ranhuras deslizantes</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur de folha</td><td></td><td></td><td></td>de alumínio</tr><tr><td>Tubos</td><td></td><td></td><td></td>de microfuga de 1,5 ml</tr><tr><td>Esmalte</td><td></td><td></td> de unhas <td></td></tr><tr><td>Micropipeta P20 transparente ou colorida e pontas</td><td></td><td></td><td></td>de plástico</tr><tr><td>Clipes de</td><td></td><td></td> papel <td>20 - 25 clipes de papel de metal padrão ligados para formar um chain</td></tr><tr><td colspan="4">Reagentes</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído de grau EM</td> Reagentes <td></td><td></td>de <td>microscopia eletrônica</td></tr><tr><td>Ácido</td><td>acético Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>100% Etanol, grau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> químico <td colspan="4">Sintetizado comercialmente, oligos marcados com fluorescência Sonda</td></tr><tr><td>longa biotinilada</td><td>Invitrogen; Etapas alternativas 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>por exemplo, nick traduzido e biotinilado com BioNick da Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Etapas alternativas 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>para detecção de sonda biotinilada longa</td></tr><tr><td>Tampão de hibridização</td><td>Receita acima</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>4x SSCT</td><td>Receita acima</td><td></td> de <td>citrato salino-sódico + Tween</td></tr><tr><td>0,1x SSC</td><td>Receita acima</td><td></td><td>de solução salina-sódica</td></tr><tr><td>Solução de bloqueio</td><td>Receita acima</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Receita acima</td><td></td><td>SSC, albumina de soro bovino, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Receita acima</td><td></td> de <td>solução salina tamponada com fosfato + Tween</td></tr><tr><td>1x solução</td><td>salina tamponada com fosfato</td>PBS <td></td><td></td></tr><tr><td>Solução hipotônica</td><td></td><td></td><td>0,5% de citrato de sódio em H2O</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield meio de montagem com vetor DAPI</td><td> Laboratórios</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

método simples para dna de fluorescência<em&gt; in situ</em&gt; a hibridação com cromossomos squashed

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

ADN de hibridação in situ (ISH ADN) é um método vulgarmente utilizado para mapeamento de sequências para as regiões cromossómicas específicas. Esta abordagem é particularmente eficaz em mapeamento de sequências altamente repetitivas para regiões heterocromáticas, onde abordagens computacionais enfrentam desafios proibitivos. Aqui nós descrevemos um protocolo simplificado para DNA ISH que contorna lavagens formamida que são etapas padrão em outros protocolos de DNA ISH. Nosso protocolo é otimizado para a hibridação com sondas de DNA vertente individuais curtas que levam corantes fluorescentes, o que efetivamente marcam sequências de DNA repetitivas dentro de regiões cromossômicas heterocromáticos através de um número de diferentes tipos de tecidos do inseto. No entanto, os pedidos podem ser estendido para usar com sondas maiores e visualização de sequências de DNA única cópia (não repetitivo). Demonstramos esse método mapeando várias sequências repetitivas diferentes de cromossomos esmagados de Drosophila melanogaster células neurais e Nasoniavitripennis espermatócitos. Mostramos padrões de hibridização, quer para pequenas sondas, sintetizados comercialmente e para uma sonda maior para comparação. Este procedimento utiliza material de laboratório simples e reagentes, e é ideal para os investigadores que têm pouca experiência com a realização de DNA ISH.

Para demonstrar este método, que hibridou um conjunto de pequenos oligonucleótidos sintetizados comercialmente que foram quimicamente modificados com conjugados fluorescentes (Figura 2) e uma sonda mais longa biotinilado (feita através de tradução por cortes de um produto de PCR; Figura 2B), a partir de vários tecidos cromossomas diferente tipos (ver Tabela 1). As sequências alvo incluídas repete satélite localizadas em regiões (pericentroméricas heterocromáticos) de cr...

Aqui, apresentamos um método simples para realizar hibridização in situ de DNA de fluorescência (DNA ISH) para visualizar sequências heterocromáticas repetitivas em cromossomos montados em lâminas. O método requer reagentes mínimos e é versátil para uso com sondas curtas ou longas, tecidos diferentes e detecção com sinais baseados em fluorescência ou não fluorescência.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a hibridização in situ de DNA para mapear sequências heterocromáticas em cromossomos mitóticos. Isso é realizado primeiramente dissecando cérebros de larvas de drosófila de terceiro estágio, ou outro tecido de interesse. O segundo passo é fixar o tecido em uma lamínula.Em seguida, o tecido é esmagado entre a lamínula e uma lâmina. Para preparar os cromossomos para hibridização, a etapa final consiste em hibridar sondas oligonucleotídicas sintetizadas curtas ao tecido esmagado. Por fim, utiliza-se microscopia de fluorescência para mostrar a localização das sequências complementares às sondas oligonucleotídicas nos cromossomos.A principal vantagem deste método em relação aos métodos existentes é a sua simplicidade. A maioria dos outros métodos de hibridização cromossômica e C dois envolve lavagens com grandes quantidades de formamida, o que pode ser caro e trabalhoso. Nosso método não requer lavagens com formamida, tornando-o uma técnica mais barata, limpa e rápida.Embora este método forneça uma maneira simples de mapear visualmente sequências nos cromossomos somáticos de cérebros de drosófila, ele também pode ser usado para mapear sequências em outros tipos de cromossomos provenientes de diferentes tecidos em diversos organismos. Para cada lâmina a ser preparada, prepare quatro ou cinco tecidos, mas não mais que isso para dissecações de cérebro. Comece selecionando larvas de terceiro estágio vagantes e coletando-as em uma gota de 1x PBS.Escolha frascos para coleta que não estejam superlotados. Sob o microscópio de dissecação, use pinças ultrafinas para segurar os ganchos bucais e outro par para segurar a dois terços do comprimento do corpo. Em seguida, puxe suavemente os ganchos bucais para expor o cérebro, os gânglios ventrais, as glândulas salivares e partes do trato digestivo.Em seguida, remova o cérebro e os gânglios ventrais dos demais tecidos com uma pinça e transfira-os para uma gota de XPBT em uma placa de plástico. Para dissecações de testículo de nasia, colete machos de puy com três dias de idade. Puy com três dias de idade possuem corpos amarelos e olhos vermelhos.Os que possuem placas alares menores são machos. Segure a pupa na extremidade superior do abdômen, próxima à região torácica, com um par de pinças e, com um segundo par de pinças, segure a ponta mais distal do abdômen; em seguida, retire os testículos com formato de gota.Eles são rodeados por corpos gordurosos que podem ser suavemente agitados para removê-los; desprenda quaisquer partes externas do corpo dos testículos, o que impedirá o esmagamento adequado, e transfira os testículos para uma gota de XPBT 1% em uma placa limpa. Após coletar todos os tecidos, trate-os com uma solução hipotônica para melhorar a separação das cromátides-irmãs. Nas regiões e cromáticas, transfira os tecidos para uma gota de citrato de sódio 0,5% por 10 minutos.Para obter esse efeito, a colchicina não é recomendada porque pode causar artefatos na morfologia dos cromossomos. Agora, fixe os tecidos usando pinças ultrafinas. Transfira-os para uma gota de 20 microlitros de PFA a 2,5% recém-preparado em ácido acético a 45% sobre uma lamínula limpa tratada com revestimento sigma, distribuindo os tecidos uniformemente no fixador e incubando-os por quatro minutos à temperatura ambiente; em seguida, prossiga com a esmagamento das lamínulas, começando por colocar suavemente uma lâmina revestida com polilisina, com a face voltada para baixo, sobre o tecido e a lamínula.Deixe a lamínula aderir à parte inferior da lâmina sem pressionar. O tratamento das lamínulas com sigma coat ajuda a garantir que o tecido esmagado permaneça na lâmina após a remoção da lamínula. No entanto, raramente o tecido pode permanecer aderido à lamínula.Nesta etapa, recomendamos realizar esmagamentos teciduais em replicata. Agora, vire a lâmina e coloque-a em um pedaço de papel grosso dobrado. Em seguida, sobre uma superfície estável, pressione com firmeza diretamente para baixo sobre a lamínula usando o polegar.Não pressione de forma que deslize a lamínula, pois isso borrará o tecido. Uma pressão muito firme normalmente resulta em cromossomos bem definidos dentro do esmagamento tecidual. No entanto, ocasionalmente, você pode encontrar variabilidade na qualidade dos cromossomos, como cromossomos incompletos, esmagados ou fragmentados.Mais uma vez, recomendamos realizar duas ou três esmagamentos teciduais em replicata. Transfira a montagem para um bloco de gelo por alguns minutos, depois submerja em nitrogênio líquido até que a fervura do nitrogênio pare ou por mais tempo. Após remover a lâmina imediatamente antes do tecido descongelar, use uma lâmina de barbear nova para levantar um canto da lamínula. Removendo-a assim.Tenha cuidado para evitar arranhar o tecido. Em seguida, coloque rapidamente a lâmina em um frasco Coplin contendo etanol a 100%, e deixe embebendo por pelo menos cinco minutos. Retire a lâmina, absorva o excesso de etanol sem tocar o tecido e deixe a lâmina secar ao ar por uma hora.As lâminas podem então ser armazenadas por semanas a meses em uma câmara de dessecação. Comece adicionando 100 nanogramas de cada sonda a 20 microlitros de tampão de hibridização 1,1 x para obter uma solução de 22 microlitros de tampão de hibridização 1 x. Em seguida, pipete a mistura sobre o tecido fixado, deixando o tecido intocado, e aplique suavemente uma lamínula.Uma pequena bolha de ar que não esteja em contato com o tecido não apresentará problemas, mas qualquer quantidade adicional de bolhas exige a reaplicação da lamínula. Coloque a lâmina sobre o lado plano de um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius e cubra-a com papel alumínio. Aguarde cinco minutos, durante os quais você pode preparar a câmara de umidade adicionando toalhas de papel úmidas a uma caixa de ponteiras.Em seguida, remova a lâmina. Envolva cuidadosamente a lâmina com parafilm esticado e transfira-a para uma câmara umidificada composta por uma toalha úmida dentro de uma caixa para ponteiras. Incube a lâmina na câmara por quatro horas a durante a noite a 30 graus Celsius. Essa temperatura é adequada para sondas com baixo teor de GC, mas para sondas com teor mais alto de GC, pode ser necessário realizar alguns ajustes nos testes de temperatura de hibridização.Após a incubação, remova cuidadosamente o filme de parafina e levante lentamente a lamínula por um dos cantos. Em seguida, lave a lâmina três vezes em tampão 0,1 XSSC, durante 15 minutos por lavagem. Cubra o frasco com papel alumínio durante as lavagens para minimizar a exposição à luz.Para sondas biotiniladas longas, adicione rod domine avadon e lave antes de prosseguir. Primeiramente, seque a área ao redor do tecido e cubra o tecido com 100 microlitros de solução bloqueadora. Em seguida, aplique suavemente uma nova lamínula sem aprisionar bolhas.Novamente, envolva a lâmina com parafina. Em seguida, incube a lâmina a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em segundo lugar, após a incubação, remova a lamínula e seque ao redor do tecido com um lenço absorvente.Em seguida, aplique sobre o tecido 100 microlitros de uma diluição de um a 1000 de rumine avadon em SBT. Prossiga cobrindo, envolvendo e incubando a lâmina da mesma forma feita com o bloqueio. Por fim, remova cuidadosamente a lamínula e lave a lâmina.Realize três lavagens em quatro x SSC T, seguidas por três lavagens em 0,1 x SSC. Cada etapa de lavagem deve ter duração mínima de cinco minutos. Prosseguindo com o protocolo, seque as lâminas removendo o tampão em excesso por absorção, sem tocar o tecido.Em seguida, coloque a lâmina com o tecido voltado para cima em um local escuro por 10 a 15 minutos ou até que a umidade evapore completamente. Agora, monte a lâmina utilizando 11 microlitros de Vector Shield com DPI e abaixe cuidadosamente uma lamínula não revestida com sigma coat. Se o meio não atingir todas as bordas, adicione mais algumas microlitros do meio pela borda e remova qualquer excesso.Em seguida, vedar a lamínula com esmalte e armazenar a lâmina na posição vertical em local escuro enquanto o esmalte seca, o que geralmente leva pelo menos meia hora. Depois, armazenar a lâmina a menos 20 graus Celsius por até uma semana e realizar a aquisição de imagens do tecido o mais rápido possível. Um conjunto de oligonucleotídeos sintetizados comercialmente, de pequeno porte, com conjugados fluorescentes e uma sonda biotinilada mais longa produzida por tradução de Nick, foi hibridizado a cromossomos provenientes de vários tipos de tecidos diferentes.Utilizando a metodologia descrita, a sonda para a repetição satélite de 359 pares de bases de Drosophila Melanogaster reconheceu um grande bloco multimegabase no cromossomo X e uma região muito menor no cromossomo três. Uma sonda mais longa contra o satélite do gene responder detectou blocos de repetição constituídos por números relativamente baixos de cópias repetidas, cerca de 700. Assim, este método permite a visualização de blocos satélites muito pequenos.Quando o tempo de tratamento com a solução hipotônica foi dobrado, atingindo 10 minutos, a separação das cromátides-irmãs aumentou consideravelmente. Este procedimento pode ser associado a outros métodos, como a coloração com anticorpos, com o objetivo de responder perguntas como se certas proteínas da cromatina estão localizadas em sequências específicas.

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Research

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