Método simples para DNA de Fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a hibridização in situ de DNA para mapear sequências heterocromáticas em cromossomos mitóticos. Isso é realizado primeiramente dissecando cérebros de larvas de drosófila de terceiro estágio, ou outro tecido de interesse. O segundo passo é fixar o tecido em uma lamínula.

Em seguida, o tecido é esmagado entre a lamínula e uma lâmina. Para preparar os cromossomos para hibridização, a etapa final consiste em hibridar sondas oligonucleotídicas sintetizadas curtas ao tecido esmagado. Por fim, utiliza-se microscopia de fluorescência para mostrar a localização das sequências complementares às sondas oligonucleotídicas nos cromossomos.

A principal vantagem deste método em relação aos métodos existentes é a sua simplicidade. A maioria dos outros métodos de hibridização cromossômica e C dois envolve lavagens com grandes quantidades de formamida, o que pode ser caro e trabalhoso. Nosso método não requer lavagens com formamida, tornando-o uma técnica mais barata, limpa e rápida.

Embora este método forneça uma maneira simples de mapear visualmente sequências nos cromossomos somáticos de cérebros de drosófila, ele também pode ser usado para mapear sequências em outros tipos de cromossomos provenientes de diferentes tecidos em diversos organismos. Para cada lâmina a ser preparada, prepare quatro ou cinco tecidos, mas não mais que isso para dissecações de cérebro. Comece selecionando larvas de terceiro estágio vagantes e coletando-as em uma gota de 1x PBS.

Escolha frascos para coleta que não estejam superlotados. Sob o microscópio de dissecação, use pinças ultrafinas para segurar os ganchos bucais e outro par para segurar a dois terços do comprimento do corpo. Em seguida, puxe suavemente os ganchos bucais para expor o cérebro, os gânglios ventrais, as glândulas salivares e partes do trato digestivo.

Em seguida, remova o cérebro e os gânglios ventrais dos demais tecidos com uma pinça e transfira-os para uma gota de XPBT em uma placa de plástico. Para dissecações de testículo de nasia, colete machos de puy com três dias de idade. Puy com três dias de idade possuem corpos amarelos e olhos vermelhos.

Os que possuem placas alares menores são machos. Segure a pupa na extremidade superior do abdômen, próxima à região torácica, com um par de pinças e, com um segundo par de pinças, segure a ponta mais distal do abdômen; em seguida, retire os testículos com formato de gota.

Eles são rodeados por corpos gordurosos que podem ser suavemente agitados para removê-los; desprenda quaisquer partes externas do corpo dos testículos, o que impedirá o esmagamento adequado, e transfira os testículos para uma gota de XPBT 1% em uma placa limpa. Após coletar todos os tecidos, trate-os com uma solução hipotônica para melhorar a separação das cromátides-irmãs. Nas regiões e cromáticas, transfira os tecidos para uma gota de citrato de sódio 0,5% por 10 minutos.

Para obter esse efeito, a colchicina não é recomendada porque pode causar artefatos na morfologia dos cromossomos. Agora, fixe os tecidos usando pinças ultrafinas. Transfira-os para uma gota de 20 microlitros de PFA a 2,5% recém-preparado em ácido acético a 45% sobre uma lamínula limpa tratada com revestimento sigma, distribuindo os tecidos uniformemente no fixador e incubando-os por quatro minutos à temperatura ambiente; em seguida, prossiga com a esmagamento das lamínulas, começando por colocar suavemente uma lâmina revestida com polilisina, com a face voltada para baixo, sobre o tecido e a lamínula.

Deixe a lamínula aderir à parte inferior da lâmina sem pressionar. O tratamento das lamínulas com sigma coat ajuda a garantir que o tecido esmagado permaneça na lâmina após a remoção da lamínula. No entanto, raramente o tecido pode permanecer aderido à lamínula.

Nesta etapa, recomendamos realizar esmagamentos teciduais em replicata. Agora, vire a lâmina e coloque-a em um pedaço de papel grosso dobrado. Em seguida, sobre uma superfície estável, pressione com firmeza diretamente para baixo sobre a lamínula usando o polegar.

Não pressione de forma que deslize a lamínula, pois isso borrará o tecido. Uma pressão muito firme normalmente resulta em cromossomos bem definidos dentro do esmagamento tecidual. No entanto, ocasionalmente, você pode encontrar variabilidade na qualidade dos cromossomos, como cromossomos incompletos, esmagados ou fragmentados.

Mais uma vez, recomendamos realizar duas ou três esmagamentos teciduais em replicata. Transfira a montagem para um bloco de gelo por alguns minutos, depois submerja em nitrogênio líquido até que a fervura do nitrogênio pare ou por mais tempo. Após remover a lâmina imediatamente antes do tecido descongelar, use uma lâmina de barbear nova para levantar um canto da lamínula. Removendo-a assim.

Tenha cuidado para evitar arranhar o tecido. Em seguida, coloque rapidamente a lâmina em um frasco Coplin contendo etanol a 100%, e deixe embebendo por pelo menos cinco minutos. Retire a lâmina, absorva o excesso de etanol sem tocar o tecido e deixe a lâmina secar ao ar por uma hora.

As lâminas podem então ser armazenadas por semanas a meses em uma câmara de dessecação. Comece adicionando 100 nanogramas de cada sonda a 20 microlitros de tampão de hibridização 1,1 x para obter uma solução de 22 microlitros de tampão de hibridização 1 x. Em seguida, pipete a mistura sobre o tecido fixado, deixando o tecido intocado, e aplique suavemente uma lamínula.

Uma pequena bolha de ar que não esteja em contato com o tecido não apresentará problemas, mas qualquer quantidade adicional de bolhas exige a reaplicação da lamínula. Coloque a lâmina sobre o lado plano de um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius e cubra-a com papel alumínio. Aguarde cinco minutos, durante os quais você pode preparar a câmara de umidade adicionando toalhas de papel úmidas a uma caixa de ponteiras.

Em seguida, remova a lâmina. Envolva cuidadosamente a lâmina com parafilm esticado e transfira-a para uma câmara umidificada composta por uma toalha úmida dentro de uma caixa para ponteiras. Incube a lâmina na câmara por quatro horas a durante a noite a 30 graus Celsius. Essa temperatura é adequada para sondas com baixo teor de GC, mas para sondas com teor mais alto de GC, pode ser necessário realizar alguns ajustes nos testes de temperatura de hibridização.

Após a incubação, remova cuidadosamente o filme de parafina e levante lentamente a lamínula por um dos cantos. Em seguida, lave a lâmina três vezes em tampão 0,1 XSSC, durante 15 minutos por lavagem. Cubra o frasco com papel alumínio durante as lavagens para minimizar a exposição à luz.

Para sondas biotiniladas longas, adicione rod domine avadon e lave antes de prosseguir. Primeiramente, seque a área ao redor do tecido e cubra o tecido com 100 microlitros de solução bloqueadora. Em seguida, aplique suavemente uma nova lamínula sem aprisionar bolhas.

Novamente, envolva a lâmina com parafina. Em seguida, incube a lâmina a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em segundo lugar, após a incubação, remova a lamínula e seque ao redor do tecido com um lenço absorvente.

Em seguida, aplique sobre o tecido 100 microlitros de uma diluição de um a 1000 de rumine avadon em SBT. Prossiga cobrindo, envolvendo e incubando a lâmina da mesma forma feita com o bloqueio. Por fim, remova cuidadosamente a lamínula e lave a lâmina.

Realize três lavagens em quatro x SSC T, seguidas por três lavagens em 0,1 x SSC. Cada etapa de lavagem deve ter duração mínima de cinco minutos. Prosseguindo com o protocolo, seque as lâminas removendo o tampão em excesso por absorção, sem tocar o tecido.

Em seguida, coloque a lâmina com o tecido voltado para cima em um local escuro por 10 a 15 minutos ou até que a umidade evapore completamente. Agora, monte a lâmina utilizando 11 microlitros de Vector Shield com DPI e abaixe cuidadosamente uma lamínula não revestida com sigma coat. Se o meio não atingir todas as bordas, adicione mais algumas microlitros do meio pela borda e remova qualquer excesso.

Em seguida, vedar a lamínula com esmalte e armazenar a lâmina na posição vertical em local escuro enquanto o esmalte seca, o que geralmente leva pelo menos meia hora. Depois, armazenar a lâmina a menos 20 graus Celsius por até uma semana e realizar a aquisição de imagens do tecido o mais rápido possível. Um conjunto de oligonucleotídeos sintetizados comercialmente, de pequeno porte, com conjugados fluorescentes e uma sonda biotinilada mais longa produzida por tradução de Nick, foi hibridizado a cromossomos provenientes de vários tipos de tecidos diferentes.

Utilizando a metodologia descrita, a sonda para a repetição satélite de 359 pares de bases de Drosophila Melanogaster reconheceu um grande bloco multimegabase no cromossomo X e uma região muito menor no cromossomo três. Uma sonda mais longa contra o satélite do gene responder detectou blocos de repetição constituídos por números relativamente baixos de cópias repetidas, cerca de 700. Assim, este método permite a visualização de blocos satélites muito pequenos.

Quando o tempo de tratamento com a solução hipotônica foi dobrado, atingindo 10 minutos, a separação das cromátides-irmãs aumentou consideravelmente. Este procedimento pode ser associado a outros métodos, como a coloração com anticorpos, com o objetivo de responder perguntas como se certas proteínas da cromatina estão localizadas em sequências específicas.