Método simples para DNA de Fluorescência In Situ A hibridação com Cromossomos Squashed

O objetivo geral deste procedimento é usar a hibridização in situ de DNA para mapear sequências heterocromáticas para cromossomos mitóticos. Isso é feito dissecando primeiro os cérebros do terceiro em larvas de drosófilas estelares ou outro tecido de interesse. O segundo passo é fixar o tecido em uma lamínula.

Em seguida, o tecido é esmagado entre a lamínula e uma lâmina. Para preparar os cromossomos para a hibridização, a etapa final é hibridizar sondas oligo sintetizadas curtas para o tecido esmagado. Em última análise, a microscopia de fluorescência é usada para mostrar a localização de sequências complementares às sondas oligo nos cromossomos.

A principal vantagem deste método sobre os métodos existentes é sua simplicidade. A maioria dos outros métodos de hibridização cromossômica e C dois envolve lavagens com grandes quantidades de amida de forma, que podem ser caras e confusas. Nosso método não requer lavagens de IDE, tornando-o uma técnica mais barata, limpa e rápida.

Embora esse método forneça uma maneira simples de mapear visivelmente sequências nos cromossomos somáticos de cérebros de drosófilas, ele também pode ser usado para mapear sequências em outros tipos de cromossomos de diferentes tecidos em diferentes organismos. Para cada lâmina a ser feita, prepare quatro ou cinco tecidos, mas não mais para dissecções cerebrais. Comece selecionando larvas errantes de terceiro ínstar e coletando-as em uma gota de um XPBS.

Escolha frascos para coletar que não estejam superlotados. Sob o escopo de dissecação, use uma pinça ultrafina para segurar os ganchos da boca e outro par para agarrar dois terços do comprimento do corpo. Em seguida, puxe suavemente os ganchos da boca para expor o cérebro, os gânglios ventrais, as glândulas salivares e partes do trato digestivo.

Em seguida, afaste o cérebro e os gânglios ventrais dos outros tecidos e transfira-os para uma gota de um XPBT em uma placa de plástico. Para dissecações de testículos nasia, colete puy masculino de três dias. Puy de três dias tem corpos amarelos e olhos vermelhos.

Aqueles com almofadas de asa menores são do sexo masculino. Segure a pupa na parte superior do abdômen perto da região torácica com uma pinça e com uma segunda pinça. Agarre a ponta distal do abdômen e, em seguida, retire os testículos em forma de lágrima.

Eles são cercados por corpos gordurosos que podem ser sacudidos suavemente, separar quaisquer partes externas do corpo dos testículos, o que impedirá o esmagamento adequado e transferirá os testículos para uma gota de um XPBT em uma placa limpa. Depois que todos os tecidos forem coletados, trate-os com uma solução hipotônica para melhorar a separação das cromátides irmãs. Nas regiões cromáticas e, transfira os tecidos para uma gota de citrato de sódio a 0,5% por 10 minutos.

Para obter esse efeito, a colchicina não é recomendada porque pode causar artefatos na morfologia cromossômica. Agora, fixe os lenços usando uma pinça ultrafina. Transfira-os para uma gota de 20 microlitros de 2,5% PFA recém-feito em ácido acético a 45% em uma lamínula tratada com camada sigma limpa, coloque os tecidos uniformemente no fixador e incuba-os por quatro minutos em temperatura ambiente e, em seguida, prossiga com o esmagamento das lamínulas, comece colocando levemente uma lâmina revestida de polilisina voltada para baixo no tecido e na lamínula.

Deixe a lamínula grudar na parte inferior do slide sem pressionar. Tratamento. As lamínulas com revestimento sigma ajudam a garantir que o tecido da abóbora permaneça na lâmina após a remoção da lamínula. No entanto, raramente, o tecido pode permanecer preso à lamínula.

Durante esta etapa, recomendamos a realização de squashes de tecido replicado. Agora vire a corrediça e coloque-a em um pedaço de papel grosso dobrado. Em seguida, em uma superfície estável, usando o polegar, pressione com firmeza para baixo sobre a lamínula.

Não pressione de forma a deslizar a tampa ou manchar o tecido. A pressão muito firme normalmente resulta em cromossomos bem resolvidos dentro do tecido da abóbora. No entanto, ocasionalmente, você pode encontrar variabilidade na qualidade dos cromossomos, como cromossomos incompletos, esmagados ou fragmentados.

Então, novamente, recomendamos realizar duas ou três abóboras de tecido replicadas. Transfira o conjunto para um bloco de gelo por alguns minutos e, em seguida, mergulhe-o em nitrogênio líquido até que o nitrogênio pare de ferver ou mais Depois de remover a lâmina imediatamente antes do descongelamento do tecido, use uma lâmina de barbear nova para levantar um canto da lamínula. Removendo-o assim.

Tenha cuidado para evitar coçar o lenço de papel. Em seguida, coloque rapidamente a lâmina em um frasco de coplin cheio de etanol 100% e deixe de molho por pelo menos cinco minutos. Remova o pavio da lâmina, retire o excesso de etanol sem tocar no tecido e deixe a lâmina secar ao ar por uma hora.

As lâminas podem então ser armazenadas por semanas a meses em uma câmara de dessecação. Comece adicionando 100 nanogramas de cada sonda a 20 microlitros de 1,1 x tampão de hibridização para uma solução de 22 microlitros de um x tampão de hibridização. Em seguida, pipete a mistura sobre o tecido fixado, deixando o tecido intocado e aplique suavemente uma lamínula.

Uma pequena bolha de ar que não entra em contato com o tecido não apresentará problemas, mas mais bolhas justificam a reaplicação da lamínula. Coloque a lâmina no lado plano de um bloco de calor de 95 graus Celsius e cubra-o com papel alumínio. Aguarde cinco minutos, durante os quais você pode preparar a câmara de umidade adicionando toalhas de papel molhadas a uma caixa de gorjetas.

Em seguida, remova o slide. Enrole cuidadosamente a lâmina em paraforma esticada e transfira-a para uma câmara umidificada composta por uma toalha úmida Em uma caixa de pontas, incube a lâmina na câmara por quatro horas a uma noite a 30 graus Celsius. Essa temperatura funciona bem para sondas de baixo conteúdo de GC, mas para sondas com maior conteúdo de GC, pode ser necessária alguma solução de problemas com temperaturas de hibridização.

Após a incubação, remova cuidadosamente o filme para e levante lentamente a lamínula por um canto. Em seguida, lave a lâmina três vezes em tampão 0,1 XSSC por 15 minutos por lavagem. Cubra o frasco com papel alumínio durante as lavagens para minimizar a exposição à luz.

Para sondas biotiniladas longas, adicione avadon de domine de haste e lave antes de prosseguir. Em primeiro lugar, seque a área ao redor do tecido e cubra o tecido com 100 microlitros de solução bloqueadora. Em seguida, aplique suavemente uma nova lamínula sem prender bolhas.

Novamente, enrole o slide com param. Em seguida, incube a lâmina a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em segundo lugar, após a incubação, remova a lamínula e seque ao redor do tecido com um lenço.

Em seguida, aplique 100 microlitros de um a 1000 avadon de rumina diluído em SBT. Em seguida, cubra, embrulhe e incube o slide como feito com o bloco. Por fim, remova cuidadosamente a lamínula e lave a corrediça.

Use três lavagens em quatro x SSCs T, seguidas de três lavagens em 0,1 XSSC. Cada etapa de lavagem deve ter pelo menos cinco minutos de duração. Prosseguindo com o protocolo, seque as lâminas enxugando o excesso de tampão sem tocar no tecido.

Em seguida, coloque o tecido da lâmina com o lado voltado para cima em um local escuro por 10 a 15 minutos ou até que a umidade se dissipe completamente. Agora, monte o slide usando 11 microlitros de escudo vetorial com DPI e abaixe cuidadosamente em uma lamínula de revestimento não sigma. Se o meio não atingir todas as bordas, aplique mais alguns microlitros de mídia pela borda e limpe o excesso.

Em seguida, sele a lamínula com esmalte e guarde a lâmina na vertical em um local escuro enquanto o esmalte seca, o que geralmente leva pelo menos meia hora. Em seguida, armazene a lâmina a menos 20 graus Celsius por até uma semana e obtenha imagens do tecido o mais rápido possível. Um conjunto de pequenos oligos sintetizados comercialmente com conjugados fluorescentes e uma sonda biotinilada mais longa feita pela Nick Translation foram todos hibridizados com cromossomos de vários tipos diferentes de tecido.

Usando a metodologia descrita, a sonda para a repetição do satélite do par de bases Drosophila Melanogaster 359 reconheceu um grande bloco de pares de megabases múltiplas no x e uma região muito menor no cromossomo três. Uma sonda mais longa contra o satélite de resposta detectou blocos repetidos que consistiam em números de cópias repetidas relativamente baixos de cerca de 700. Assim, este método permite a visualização de blocos satélites muito pequenos.

Quando a etapa de tratamento com solução hipotônica foi dobrada em duração para 10 minutos, a separação das cromátides irmãs aumentou para o leste. Este procedimento pode ser acoplado a outros métodos, como coloração de anticorpos, a fim de responder a perguntas como certas proteínas da cromatina localizadas em sequências específicas.