Name: Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprenda a acessar o núcleo coclear dorsal em camundongos para estudos optogenéticos. Este protocolo cirúrgico permite visualização direta e manipulação precisa do sistema auditivo central.

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Financiamento: Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Bertarelli (DJL), uma subvenção MED-EL (DJL), e um dos Institutos Nacionais de Saúde Grants DC01089 (MCB).

NOTA: Todos os procedimentos experimentais são realizados de acordo com o Cuidado e Uso Comitê Animal do Massachusetts Eye e Ear Infirmary e Harvard Medical School, que seguem as diretrizes nacionais de cuidados de animais, incluindo a Política Pública de Saúde de serviço na Humane Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, o Guia ILAR, e da Lei do Bem-Estar Animal. Procedimentos experimentais listados abaixo exposição do DCN esquerda detalhe. Usar instrumentos esterilizados durante a realização da cirurgia de sobrevivência. 1. Primária Craniotomia e Dorsal Coclear Nucleus Exposição <ol><li> Anestesia <ol><li> Anestesiar um rato, com idade 8-12 semanas, com peso de 18-24 g, com xilazina 20 mg / kg de cetamina e 100 mg / kg via intraperitoneal. Confirme anestesia adequada pelo monitoramento da frequência cardíaca, frequência respiratória, bem como reflexo toe pitada retirada. Lugar vet pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. Uma vez adequadamente sob anestesia, cabelo shave recobre tele couro cabeludo para fornecer acesso livre para o local da cirurgia. </li></ol></li><li> Posicionamento cirúrgico <ol><li> Posicione o mouse de forma segura em um suporte estereotáxico de pequenos animais, mantido no lugar por um grampo focinho. </li><li> Certifique-se de que o grampo focinho é solto o suficiente para permitir a respiração adequada, mas firme o suficiente para imobilizar completamente a cabeça do rato. Se a cabeça do mouse é solto, o animal é provável cair fora do suporte da cabeça durante a parte craniotomia de procedimento. </li><li> Coloque auditivo de tronco cerebral implante de eletrodos em forma padrão, o que permite o monitoramento da frequência cardíaca. A freqüência respiratória deve ser monitorizada através da visualização. Note-se que a frequência cardíaca normal e taxa respiratória irá variar dependendo da idade do rato. </li><li> Um termômetro é colocado e é assegurada euthermia via colocação em um cobertor térmico homeotérmicos. </li></ol></li><li> Incisão da pele e exposição dos ossos interparietal e occipital do crânio <ol><li> Sob uma Microscope, fazer uma incisão vertical através da pele a partir da linha média, diretamente entre o pavilhão auricular, e estendendo-se até a porção caudal do occipital. Seguindo na linha média da pele incisão, deslocar a pele lateralmente. Visualize os músculos que cobrem a esquerda da face posterior do crânio. </li><li> Remover muscular que recobre a parietal esquerdo, interparietal, e os ossos occipital do crânio pela desarticulação de anexos musculares para seus respectivos ossos com um bisturi ou tesoura iris. Observar um pequeno grau de sangramento ao longo das bordas musculares corte. Minimizar isso por uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão para 10-15 seg. </li></ol></li><li> Sobreposta craniotomia Coclear Nucleus <ol><li> Identificar linhas de sutura relevantes, incluindo suturas sagital e lambda linhas (Figura 1, painel da esquerda). </li><li> Usando rongeurs, fazer uma craniotomia sobre o osso interparietal, à esquerda da linha média, ~ 2 milímetros caudal para a linha de sutura lambda. Esta região sobrepõe à DCN. </li><li> Seguireig craniotomia, observar uma fina camada de dura-máter que se sobrepõe ao cerebelo. Usando uma lâmina de bisturi, remover a dura-máter. (Figura 1, painel médio). NOTA: A remoção da dura-máter pode causar um pequeno grau de hemorragia. Este processo de usar a lâmina de bisturi para remover a dura destina-se a reduzir a quantidade de perda de sangue durante a aspiração cerebelo, que vai reunir na superfície do tronco cerebral e identificação obscura do DCN. Volume total de sangue de rato é de aproximadamente 1,5 ml não deve exceder&gt; de 15%. Se o sangramento for superior a esse valor, o rato deve ser fornecido com a suplementação com fluido. </li><li> Retirar sangue coagulado sobrepondo o cerebelo com o aplicador de ponta de algodão. Opcionalmente, pingar soro fisiológico delicadamente usando um ponto dental para o cerebelo para limpar o sangue para fora do sangue. </li></ol></li><li> Cerebelar Aspiração <ol><li> Usando uma sucção 5 francês, aspirar a porção mais lateral do cerebelo que se sobrepõe à esquerda DCN até o DCN é visual (Figura 1, painel da direita). Retirar cerca de 1/4 a 1/3 do cerebelo esquerdo. O principal marco adjacente à DCN é a ampola do canal semicircular superior. NOTA: A aspiração do cerebelo é o passo fundamental do protocolo. Dirigido aspiração do cerebelo é realizado com mais sucesso se ocorrer em uma única tentativa e não com várias passagens da sucção, pois isso irá causar sangramento. Para auxiliar na aspiração, definir o plano focal do microscópio na profundidade prevista para o CN, o qual será ligeiramente distai para a superfície do cerebelo. Definir o plano focal para o CN vai melhorar a visualização e garantir uma imagem nítida. </li><li> Após aspiração, de nova hemorragia, líquido cefalorraquidiano (LCR) build-up, e deslocamento cerebelo no DCN são esperados. Instilar 0,5 cc de solução salina estéril rapidamente na craniotomia para impedir a coagulação do sangue. Uma combinação de pontuar suave com um ponto dental e sucção pode então serusado para limpar um caminho para a visualização direta da DCN. Não contactar directamente a superfície do DCN. </li></ol></li></ol> 2. Microinjection Pressão para mediada-Virus Gene Transferência e recuperação cirúrgica <ol><li> Após a DCN é livre de sangue sobrejacente e CSF e é claramente visível, fazer microinjeções de pressão no DCN usando a 10 ul Hamilton seringa durante um período de 2 min. </li><li> Introduzir a agulha com um micromanipulador até que a ponta já não é visível sob a superfície do DCN. </li><li> Para um desempenho óptimo, utilizar uma agulha de calibre 33 ou 34 (com uma seringa estanque aos gases com a agulha de calibre 34) com um chanfro raso, tal como 45 °, para minimizar o trauma sem corte e localizar o volume de injecção no interior da DCN, que é uma fina e estrutura do tronco cerebral raso (&lt;300 mm de espessura). NOTA: Outros instrumentos microinjeção pode ser utilizado com base. Idealmente, a injeção instrumento deve ser flexível para permitir uma ligeira bend, se necessário, para atingir diretamente o DCN. Além disso, como o rato se move ligeiramente ao longo do processo, devido à respiração, o instrumento deve ser suficientemente robusto para resistir a pequenas quantidades de movimento. </li></ol> 3. Recuperação Cirúrgica <ol><li> Imediatamente após a injecção, re-aproximar a pele e permitir que o mouse para se recuperar por procedimento padrão de recuperação. Restante cerebelo e cicatriz irá preencher a cavidade causada pela aspiração do cerebelo. Constantemente monitorar os animais até que a consciência suficiente é recuperada para manter decúbito esternal. Monitor de frequência cardíaca, frequência respiratória, bem como a capacidade para se alimentar. NOTA: Nenhum animal que foi submetido a cirurgia é devolvido para uma gaiola com outros animais até totalmente recuperado. </li><li> Se um rato começa a andar em círculos de pós-operatório (&lt;5% dos casos), geralmente 2-4 horas após o fechamento da incisão na pele, sacrificar imediatamente o mouse, como ele provavelmente teria uma alimentação momento difícil. Tseu efeito colateral é provavelmente devido à aspiração de o cerebelo. O animal deve ser monitorado para a dor no pós-operatório, e narcóticos adequadas devem ter para garantir o conforto dos animais com base em normas institucionais. Antibióticos podem ser necessárias, se houver sinais de infecção. </li></ol> 4. Secundária Craniotomia e Coclear Nucleus Exposição <ol><li> Após 2-4 semanas de cicatrização e gene transferência de incubação mediada por vírus, re-anestesiar uma previamente injetados mouse e repita o passo 1,1-1,5 tempo de incubação Optimal varia com o tipo de gene transferido. </li><li> Remover o tecido cicatricial no local da craniotomia por uma combinação de uma pinça, bisturi, e fórceps. </li><li> Após visualizar a craniotomia, identificar uma combinação de permanecer cerebelo e tecido cicatricial que recobre a DCN. Use a 5 de sucção para aspirar francês cerebelo sobreposta / tecido cicatricial (similar à aspiração cerebelar anterior). </li><li> Após aspiração, esperar mais sangramento, CSF build-up, e os bits restantes do cerebelo. Introduzir rapidamente em solução salina a craniotomia para impedir a coagulação do sangue. Use uma combinação de suave dabbing ponto dental e sucção para limpar o caminho para a visualização direta da DCN. </li><li> Observar a superfície do DCN. Realizar experimentos de fisiologia à base de optogenética como DCN é agora acessível. Introduzir um estímulo de luz, por exemplo com uma fibra óptica (Figura 2), para conduzir uma experiência baseada Optogenetics. </li></ol> 5. Histologia <ol><li> Após a conclusão dos experimentos, sacrificar o mouse com uma overdose de cetamina. Perfundir do rato com soro fisiológico normal seguido por paraformaldeído a 4%. </li><li> Extraia o tronco cerebral a partir do crânio e pós-correção para 2 horas. Cryoprotect do tronco cerebral em 30% de sacarose por 24-48 horas. Secção do tronco cerebral utilizando um criostato padrão usando 60 mm secções. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve a técnica de visualização direta do DCN no modelo murino para a manipulação do sistema auditivo central. A abordagem descrita de visualização direta oferece vantagens significativas sobre a alternativa principal, que são abordagens estereotáxica. Primeiramente, a visualização direta da DCN permite confirmação imediata do local do tronco cerebral, enquanto abordagens estereotáxica não pagar a visualização direta. Em experiências que implicam o prolongados períodos de incubação, como é o caso da trans...

A transferência gênica mediada por vírus para reverter a perda auditiva tem se concentrado amplamente no sistema auditivo periférico. 1 Visando a cóclea, os investigadores examinaram uma série de vias de entrega, incluindo infusão osmótica de minibomba2, Gelfoam®2 embebido em complexo vetor-transgene 2 ou esponja de gelatina3, microinjeção direta4; numerosos vetores de transferência de genes, incluindo vetores virais adeno-associados5,6, vetores lentivirais7 e lipossomas catiônicos2; e a disseminação de vetores de transferência de genes além do tecido-alvo2. Mais recentemente, o vírus adeno-associado (AAV)-1 foi introduzido na cóclea para tratar a surdez em camundongos devido à perda do transportador vesicular de glutamato-3. 8 Além disso, a aplicação da optogenética no sistema auditivo periférico foi descrita recentemente. 9
Poucos estudos, no entanto, examinaram a transferência de genes para o sistema auditivo central. O núcleo coclear dorsal (DCN) do tronco encefálico contém neurônios de segunda ordem da via auditiva. Embora as técnicas de transferência de genes no núcleo coclear (NC) possam ser utilizadas para uma série de investigações, a transferência de genes de opsinas, proteínas sensíveis à luz, para o DCN também pode ser utilizada para permitir técnicas experimentais baseadas em optogenética. Após a entrega de transferência de genes mediada por vírus de uma opsina, como a channelrodopsina-2 (ChR2), os neurônios do DCN tornam-se sensíveis a estímulos luminosos. A transferência de genes optogenéticos foi previamente tentada em várias regiões do tronco encefálico, incluindo o núcleo retrotrapezóide de rato, locus coeruleus de camundongo, colículo superior de macaco e área tegmental ventral de camundongo. 10-14
Recentemente, os investigadores examinaram o uso da optogenética no DCN. 15,16 O DCN é o local de colocação de implantes auditivos de tronco encefálico em humanos, tornando-se uma parte atraente do sistema auditivo para estudo de estudos translacionais em neuropróteses auditivas. No entanto, dada a localização do DCN, a exposição cirúrgica é um desafio. A técnica aqui descrita fornece um protocolo para exposição máxima do DCN por meio da abordagem da fossa posterior para permitir a transferência de genes do vetor viral e experimentos baseados em optogenética em um modelo murino. Estudos anteriores usaram microinjeção estereotáxica no DCN com canalrodopsina-2. 16 As injeções estereotáxicas, no entanto, são potencialmente menos precisas do que as injeções feitas por visualização direta, especialmente em um núcleo tão pequeno e profundo ao longo do tronco cerebral quanto o DCN. Camundongos transgênicos que expressam proteínas específicas do tecido no NC também são uma opção atraente e evitariam a necessidade de transferência de genes. Nosso protocolo de exposição ao DCN também funcionaria em camundongos transgênicos, pois o DCN precisaria ser exposto diretamente para estimulação óptica. Essa técnica de exposição cirúrgica das DCN é adaptada de protocolos anteriores envolvendo registros do nervo auditivo e do núcleo coclear em modelos de camundongos e ratos. 15,17-20
O objetivo geral do protocolo é fornecer exposição direta ao NC para permitir técnicas de transferência de genes. Mais especificamente, a abordagem é compatível com cirurgia aguda e de sobrevivência e a preparação pode ser repetida no mesmo animal para testes neurofisiológicos subsequentes. A exposição direta do protocolo DCN tem implicações para a experimentação baseada em transferência de genes mediada por optogenética e vírus em outros núcleos do tronco cerebral.

<table><tbody><tr><td>Suporte estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Manta homeotérmica</td><td>Harvard</td><td>507214</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi #11</td><td>Ferramentas Cirúrgicas Finas</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris</td><td>Ferramentas Cirúrgicas Finas</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>5 Sucção Francesa</td><td>Simetria Cirúrgica</td><td>2777914</td><td></td></tr><tr><td>Dental Pontos</td><td>Henry Schein</td><td>100-8170</td><td></td></tr><tr>Ferramentas <td>Cirúrgicas Finas</td><td>Bone rongeur</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; l Seringa Hamilton</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>34 gauge, agulha</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td>207434</tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Ferramentas Cirúrgicas Finas</td><td>16021-14</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização direta do murino dorsal coclear nucleus para optogenetic estimulação da via auditiva

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

A investigação sobre o uso da transferência de genes mediada por vírus para prender ou reverter a perda auditiva tem sido amplamente relegado para o sistema auditivo periférico. Poucos estudos examinaram transferência de genes para o sistema auditivo central. O núcleo dorsal coclear (DCN) do tronco cerebral, que contém neurônios de segunda ordem da via auditiva, é um local potencial de transferência de genes. Neste protocolo, uma técnica para exposição direta e máxima da DCN murino através de uma abordagem posterior fossa é demonstrada. Esta abordagem permite a qualquer cirurgia aguda ou sobrevivência. Após a visualização direta da DCN, uma série de experimentos são possíveis, incluindo a injeção de opsinas para o núcleo coclear e subsequente estimulação por uma fibra óptica acoplada a uma luz de laser azul. Outros experimentos neurofisiologia, como a estimulação elétrica e traçados injetores neurais também são viáveis. O nível de Visualização e a duração da estimulação realizável que esta abordagem seja aplicável a uma ampla gama de experiências.

Parcial Cerebellar aspiração demonstra ter acesso ao núcleo coclear Após a pele e músculo sobrejacente ao crânio são removidos, marcadores de superfície do crânio, como as linhas de sutura coronal e lamda, demonstrar a localização aproximada da craniotomia. Após craniotomia com fórceps, o cerebelo é visualizada. Aspiração cuidadosa da pequena porção de o cerebelo demonstra visualização do CN, que podem então ser injectados (Figura 1). <e...

O objetivo deste protocolo é delinear uma abordagem cirúrgica para fornecer acesso direto ao núcleo coclear dorsal em um modelo murino.

Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

O objetivo geral deste procedimento é acessar cirurgicamente o núcleo coclear em um modelo murino para permitir experimentos baseados em optogenética. Isso é alcançado primeiramente preparando o camundongo para a craniotomia e retratando lateralmente o tecido mole da pele e o músculo subjacentes ao couro cabeludo. Como segundo passo, realiza-se uma craniotomia no osso interparietal esquerdo, cerca de dois milímetros cranialmente em relação à linha da sutura lambda.Essa região sobrepõe-se ao núcleo coclear. Em seguida, utilizando um tubo de sucção de cinco French, aspire a porção mais lateral do cerebelo esquerdo que sobrepõe o NCD. O resultado mostra uma visão desobstruída do NCD.As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos auxiliares, como a orientação estereotáxica, são a obtenção de visualização direta do núcleo coclear e a colocação de um neuroestimulador, como uma fonte de luz ou um arranjo de eletrodos, sobre a superfície do tronco encefálico. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas da optogenética e da audiologia. Nenhum prótese, como a transferência gênica, pode permitir que o tronco encefálico auditivo seja estimulado pela luz com resolução espacial e temporal suficiente.Após anestesiar um camundongo com cetamina e xilazina por administração intraperitoneal, verifique o reflexo de retirada do dedo do pé e monitore sua frequência cardíaca e frequência respiratória para confirmar a anestesia adequada. Em seguida, aplique pomada veterinária em ambos os olhos para prevenir ressecamento. Depois, retire o pêlo que recobre o couro cabeludo para proporcionar acesso desobstruído ao local cirúrgico.Após isso, posicione o camundongo em um suporte estereotáxico para pequenos animais. Ajuste o prendedor de focinho de modo que fique suficientemente solto para permitir uma respiração adequada, mas suficientemente firme para imobilizar completamente a cabeça do camundongo. Sob um microscópio, faça uma incisão vertical através da pele, começando na linha média diretamente entre a orelha e estendendo-se até a região occipital.Em seguida, desloque a pele lateralmente. Remova os músculos que recobrem os ossos parietal esquerdo, interparietal e occipital do crânio com uma lâmina ou tesoura de íris. Enquanto isso, minimize a hemorragia aplicando pressão suave com um aplicador de algodão por 10 a 15 segundos.Em seguida, identifique as linhas das suturas sagital e lambda. Utilizando um par de pinças Ron, faça uma craniotomia no osso parietal esquerdo, aproximadamente dois milímetros ao lado da linha da sutura lambda.Essa região sobrepõe-se ao DCN após a craniotomia. Uma fina camada de dura que recobre o cerebelo deve ser observada cuidadosamente e removida utilizando uma lâmina de bisturi. Remova o sangue coagulado com pontas de algodão ou goteje suavemente soro fisiológico sobre o cerebelo para afastar o sangue.Em seguida, utilize um tubo de sucção de cinco French para aspirar a porção mais lateral do cerebelo esquerdo, sobrejacente ao núcleo coclear dorsal, para auxiliar. Durante a aspiração, ajuste o plano focal do microscópio à profundidade esperada do núcleo coclear para melhorar a visualização e garantir uma imagem nítida. Remova aproximadamente um quarto a um terço do cerebelo esquerdo.O principal marco anatômico adjacente ao NCD é o AM do canal semicircular superior. Após a aspiração, sangramentos adicionais, acúmulo de líquido cefalorraquidiano e deslocamento do cerebelo sobre o NCD podem ocorrer; nesse caso, instile salina rapidamente na craniotomia para prevenir a coagulação sanguínea. Utilize uma combinação de leve pressão com uma ponta dental e sucção para limpar um trajeto que permita a visualização direta do NCD.Após o DCN estar claramente visível e livre de sangue e LCR sobrejacentes, realize uma microinjeção por pressão do vetor utilizando uma seringa Hamilton de cinco microlitros, estanque ao gás. Utilize uma agulha de calibre 34 com bisel raso para minimizar o trauma contundente e localizar o volume de injeção dentro do DCN. Em seguida, introduza lentamente a agulha com um micromanipulador até que a ponta não seja mais visível sob a superfície do DCN.Inicie a injeção de 1,5 microlitros do vetor. Após a conclusão, retire lentamente a agulha, feche novamente a pele e permita que o camundongo se recupere conforme o procedimento padrão de recuperação. Após dois a quatro semanas de cicatrização e incubação da transferência gênica mediada pelo vírus, reanestesie o camundongo injetado com o vetor e, em seguida, remova o tecido cicatricial sobre o local da craniotomia.Em seguida, identifique uma combinação de tecido cerebelar remanescente e tecido cicatricial sobrejacente ao DCN. Utilize uma cânula de sucção de cinco French para aspirar o tecido cerebelar e cicatricial sobrejacente. Após a aspiração.Aplique rapidamente solução salina na craniotomia. Para prevenir a coagulação sanguínea, utilize uma combinação de leve pressão com uma ponta dental e sucção para limpar o campo, permitindo a visualização direta do NCD. O NCD agora está acessível para os experimentos fisiológicos baseados em optogenética; aqui é mostrada a colocação de uma fibra laser diretamente sobre a superfície do NCD, o que permite a estimulação óptica dos NCD infectados com opsina. Uma série de pulsos de luz azul na superfície do NCD infectado resulta em uma resposta auditiva do tronco encefálico induzida opticalmente.Usando um micromanipulador, uma fibra óptica acoplada a um laser de luz azul é posicionada diretamente sobre a superfície do núcleo coclear e ativada. Aqui, podemos identificar pulsos de luz azul na superfície do núcleo coclear. Após este procedimento, outros métodos, como a estimulação elétrica do núcleo, podem ser realizados, permitindo-nos comparar diretamente não apenas as respostas neurais evocadas acusticamente, mas também as respostas evocadas eletricamente com aquelas evocadas pela estimulação óptica.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e realizar a craniotomia e a aspiração cerebelar com o objetivo final de visualização direta e acesso ao núcleo coclear.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neurônios adultos-nascido do bulbo olfativo pode ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 expressando injeção lentiviral no fluxo migratório rostral e fotoestimulação crônica com uma miniatura implantado LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Fonte: Kozin, E. D., et.al. Visualização direta do núcleo coclear dorsal murino para estimulação optogenética da via auditiva. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra a transferência de genes mediada por vírus para o núcleo coclear dorsal (DCN) de camundongos para permitir a estimulação auditiva induzida por luz. Um vetor viral que codifica opsina, um canal iônico sensível à luz, é injetado no DCN após uma craniotomia e aspiração cerebelar para acesso direto. As opsinas expressas permitem que...

Transferência gênica mediada por vírus para o núcleo coclear dorsal do camundongo para estimulação auditiva induzida por luz

Este vídeo demonstra o processo de preparação de fatias de cérebro em forma de cunha em um ambiente de laboratório. Usando um vibratome, uma fatia em forma de cunha do cérebro de um camundongo é trabalhada com espessura variável. Esta fatia contém a raiz nervosa auditiva posicionada na extremidade mais espessa, enquanto os neurônios relacionados à audição estão localizados na extremidade mais fina.

Preparando fatias cerebrais em cunha para visualizar neurônios auditivos

Este vídeo demonstra um protocolo para estimular a raiz nervosa auditiva e registrar correntes pós-sinápticas em neurônios olivococleares mediais em fatias de cunha cerebral de camundongo.

Estimulação da raiz nervosa auditiva e gravações de corrente pós-sináptica em uma fatia de cunha de cérebro de camundongo

Descrevemos um método para caracterizar a topografia funcional e as propriedades sinápticas dos circuitos do prosencéfalo usando uma abordagem optogenética para fotoestimular populações neuronais in vitro.

Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

A optogenética tornou-se uma ferramenta poderosa para uso em experimentos de neurociência comportamental. Este protocolo oferece um guia passo a passo para o projeto e configuração de sistemas de laser e fornece um protocolo completo para a realização de estímulos optogenéticos in vivo múltiplos e simultâneos compatíveis com a maioria dos paradigmas de teste comportamental de roedores.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

Aqui descrevemos nossa estratégia para obter gravações de unidade única estáveis e bem isoladas de interneurônios inibitórios identificados no córtex de camundongo anestesiado. Os neurônios que expressam ChR2 são identificados por sua resposta à luz azul. O método usa equipamento de gravação extracelular padrão e serve como uma alternativa barata à imagem de cálcio ou patch guiado visualmente.

Um Guia para In vivo Gravação única unidade de Optogenetically Identificado Cortical Inibitória Interneurônios

O implante coclear (IC) permitem ouvir pela estimulação elétrica direta do nervo auditivo. No entanto, a má frequência e intensidade resolução limita a qualidade de ouvir com CIs. Aqui descrevemos estimulação optogenética do nervo auditivo em ratos como uma estratégia alternativa para a investigação auditiva e desenvolvimento de futuros ICs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

A integração de diversas entradas sinápticas aos neurônios é melhor medida em uma preparação que preserva todos os núcleos pré-sinápticos para o tempo natural e a plasticidade do circuito, mas as fatias cerebrais normalmente cortam muitas conexões. Desenvolvemos uma fatia cerebral modificada para imitar a atividade do circuito in vivo, mantendo a capacidade de experimentação in vitro.

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

O presente protocolo descreve como usar optogenética sem fio combinada com videografia de alta velocidade em uma única tarefa de alcance à compreensão de pelotas para caracterizar os circuitos neurais envolvidos no desempenho do comportamento motor qualificado em camundongos em movimento livre.

In vivo Controle Optogenético Sem Fio do Comportamento Motor Qualificado

Aqui, apresentamos dois protocolos para registro de microeletrocorticografia de alta densidade (μEcoG) em ratos e camundongos, incluindo métodos cirúrgicos, de implantação e de registro. As gravações de μECoG são realizadas em combinação com a gravação de politrodo laminar no córtex auditivo de ratos ou com a manipulação optogenética da atividade neural no córtex somatossensorial de camundongos.

Investigações Multiescala de Processamento Cortical Integrando Politrodos Laminares e Optogenética com Microeletrocorticografia em Roedores

Aprenda a acessar o núcleo coclear dorsal em camundongos para estudos optogenéticos. Este protocolo cirúrgico permite visualização direta e manipulação precisa do sistema auditivo central.

Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

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