Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

O objetivo geral deste procedimento é acessar cirurgicamente o núcleo coclear em um modelo de camundongo para permitir experimentos baseados em optogenética. Isso é conseguido primeiro preparando o camundongo para a craniotomia e retraindo a pele, o tecido mole e o músculo que recobre o couro cabeludo lateralmente. Como segundo passo, uma craniotomia é feita no osso interparietal esquerdo, cerca de dois milímetros na linha de sutura lambda.

Esta região recobre o núcleo coclear. Em seguida, usando um tubo de sucção de cinco franceses, aspire a porção lateral do cerebelo esquerdo sobrejacente ao DCN. O resultado mostra uma visão desobstruída da DCN.

As principais vantagens dessa técnica sobre os métodos de assistência, como a orientação estereotáxica, são tanto a visualização direta do núcleo coclear quanto a colocação de um simulador de neuros, como uma fonte de luz ou um feixe de eletrodos, na superfície do tronco encefálico. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da optogenética e auditiva. Nenhuma prótese, como a transferência de genes, permite que o tronco cerebral auditivo seja estimulado pela luz com resolução facial e temporal suficiente.

Depois de anestesiar um camundongo com cetamina e xilazina por administração intraperitoneal, verifique o reflexo de retirada do pinçamento do dedo do pé e monitore sua frequência cardíaca e respiratória para confirmar a anestesia adequada. Em seguida, aplique pomada veterinária em ambos os olhos para evitar o ressecamento. Em seguida, raspe o cabelo que cobre o couro cabeludo para fornecer acesso desobstruído ao local da cirurgia.

Depois disso, coloque o mouse em um suporte estereotáxico de pequeno animal. Ajuste o grampo do focinho para que fique solto o suficiente para permitir uma respiração adequada, mas apertado o suficiente para imobilizar completamente a cabeça do mouse. Sob um microscópio, faça uma incisão vertical através da pele, começando na linha média diretamente entre o pavilhão auricular e estendendo-se até a porção do mimo do occipital.

Em seguida, desloque a pele lateralmente. Remova os músculos que recobrem os ossos parietal, interparietal e occipital esquerdo do crânio com um bisturi ou tesoura de íris. Enquanto isso, minimize o sangramento aplicando uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão por 10 a 15 segundos.

Em seguida, identifique as linhas de sutura sagital e lambda. Usando um par de joias Rony. Faça uma craniotomia no osso interparietal esquerdo cerca de dois milímetros na linha de sutura lambda.

Esta região se sobrepõe ao DCN após a craniotomia. Uma fina camada de dura-máter que cobre o cerebelo deve ser observada com cuidado, remova-a com uma lâmina de bisturi. Remova o sangue coagulado com pontas de algodão ou pingue suavemente solução salina no cerebelo para limpar o sangue.

Em seguida, use um tubo de sucção de cinco franceses para aspirar a porção mais lateral do cerebelo esquerdo, sobrepondo o DCN para ajudar. Na aspiração, defina o plano focal do microscópio na profundidade esperada do núcleo coclear para melhorar a visualização e garantir uma imagem nítida. Remova aproximadamente um quarto a um terço do cerebelo esquerdo.

O principal marco adjacente ao DCN é o AM do canal semicircular superior. Após a aspiração, sangramento adicional, acúmulo de líquido cefalorraquidiano e deslocamento do cerebelo no DCN aparecerão instilar solução salina rapidamente na craniotomia para evitar a coagulação do sangue. Use uma combinação de toques suaves com um ponto dentário e sucção para abrir caminho para visualização direta do DCN.

Depois que o DCN estiver claramente visível e livre de sangue e LCR, faça uma microinjeção de pressão do vetor nele com uma seringa Hamilton de cinco microlitros à prova de gás. Use uma agulha de calibre 34 com um chanfro raso para minimizar o trauma contuso e localizar o volume de injeção dentro do DCN. Em seguida, introduza lentamente a agulha com um micromanipulador até que a ponta não seja mais visível sob a superfície do DCN.

Comece a injetar 1,5 microlitros do vetor. Depois de concluído, retire lentamente a agulha, aproxime-se novamente da pele e permita que o mouse se recupere de acordo com o procedimento de recuperação padrão. Após duas a quatro semanas de cicatrização e incubação de transferência de genes mediada por vírus, reanestesiar o camundongo injetado no vetor e, em seguida, remover o tecido cicatricial sobre o local da craniotomia.

Depois disso, identifique uma combinação de cerebelo remanescente e tecido cicatricial sobrejacente ao DCN. Use uma sucção de cinco franceses para aspirar o cerebelo sobrejacente e o tecido cicatricial. Após a aspiração.

Aplique rapidamente solução salina na craniotomia. Para evitar a ululação do sangue, use uma combinação de toques suaves e sucção do ponto dentário para limpar o caminho para visualização direta do DCN. O DCN agora está acessível para os experimentos de fisiologia baseados em optogenética mostrados aqui é a colocação de uma fibra de laser diretamente na superfície do DCN, que permite a estimulação óptica da série de pulsos de luz azul DCNA infectada com opsina na superfície do DCN infectado resulta em uma resposta auditiva do tronco encefálico orientada opticamente.

Usando um micro manipulador, uma fibra óptica acoplada a um laser de luz azul é colocada diretamente na superfície do núcleo coclear e ligada. Aqui podemos identificar a luz azul pulsada na superfície do núcleo coclear. Seguindo este procedimento, outros métodos, como a simulação elétrica do núcleo, podem ser realizados, permitindo-nos comparar diretamente não apenas as respostas neurais evocadas acusticamente, mas também as evocadas eletricamente com as evocadas pela simulação óptica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e realizar a craniotomia e a aspiração cerebelar com o objetivo final de visualização direta e acesso ao núcleo coclear.