Exame de Rapid dopamina Dynamics com Fast digitalização Voltametria Cíclica Durante Intra-oral Administração saborizante em ratos acordados

O objetivo geral deste procedimento é medir as respostas da dopamina em subsegundos ao sabor oral denso. Isso é feito criando primeiro cateteres orais, eletrodos de referência e eletrodos de fibra de carbono necessários para os procedimentos cirúrgicos e subsequente registro por meio de telemetria V cíclica de varredura rápida. O segundo passo é implantar cirurgicamente os cateteres orais, o eletrodo intracraniano e a cânula guia para o eletrodo de fibra de carbono.

Uma semana depois, o microeletrodo de fibra de carbono pode ser baixado para o núcleo accumbens para registrar alterações na liberação extracelular de dopamina em resposta à entrega intraoral de sabores. A etapa final após a gravação é calibrar o eletrodo e usar a análise do componente principal para isolar os dados que contêm informações sobre a dopamina. Em última análise, o uso combinado de sabor e entrega intraoral e telemetria de vol cíclico de varredura rápida é usado para mostrar alterações nas respostas de dopamina em subsegundos à taten.

Existem duas vantagens principais dessa técnica combinada em relação aos métodos existentes. Primeiro, a fotometria rápida de IC tem uma alta resolução temporal e, segundo, a administração intraoral de taten minimiza o movimento que o rato precisa fazer para obter a tatina e nos permite isolar melhor as respostas da dopamina à tatina. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades com a fabricação do cateter oral.

No entanto, a construção de um cateter oral bom e pago garantirá um ajuste confortável do cateter entre a bochecha e os molares superiores e aumentará a probabilidade de um experimento bem-sucedido. Para preparar o eletrodo de registro, primeiro aspire uma fibra de carbono T seis 50 de sete mícrons de diâmetro em um capilar de vidro de silicato de bora com um diâmetro interno de 0,4 milímetros. Em seguida, posicione o capilar em um eletrodo polar vertical inicialmente puxe com um aquecedor ajustado para 55.0 e o ímã desligado, depois ajuste conforme necessário.

Depois de puxar a pipeta ao microscópio, corte a fibra de carbono exposta de forma que ela se estenda de 75 a 100 mícrons além do vidro. A fibra do vidro deve ser bem fechada, caso contrário, descarte a preparação. Em seguida, retire o isolamento de metade de um fio de calibre 30 de três polegadas, aplique termorretrátil para prender o eletrodo ao micro manipulador.

Em seguida, aplique uma fina camada de tinta prateada no fio enquanto a tinta ainda está molhada. Insira o fio na extremidade aberta do eletrodo e prenda-o à fibra de carbono nele. Verifique este contato sob um microscópio.

Pegue o eletrodo no micro manipulador e prenda-o com termorretrátil. Coloque o eletrodo de fibra de carbono preparado no IPA por pelo menos 10 minutos para limpar a superfície do eletrodo e aumentar a sensibilidade subsequente à dopamina. Depois de remover o eletrodo do IPA, enxágue a fibra de carbono com água da torneira para remover o IPA.

Em seguida, prepare o eletrodo de referência a partir de um fio de prata de 13 milímetros com uma malha de cloreto de prata de seis milímetros com um diâmetro de 0,4 milímetros, corte a parte não engrenada do fio e solde-o a um pino de ouro. Em seguida, aplique epóxi na solda. Em seguida, mergulhe a parte da malha em um ácido copolímero cinco vezes.

Deixe secar por 30 minutos ao ar livre entre os mergulhos após o último mergulho. Deixe secar ao ar durante a noite. No dia seguinte.

Asse a parte da malha do fio a 120 graus Celsius por uma hora. Para fazer o cateter oral primeiro corte. Tubulação de polietileno 100 em segmentos de seis centímetros.

Em seguida, faça um pequeno disco plano em um dos segmentos do tubo, derretendo a extremidade e pressionando-o em uma superfície plana e fria no centro do disco. Use uma agulha de calibre 18 para criar um orifício. Prenda a outra extremidade do segmento do tubo à extremidade cega de uma agulha de calibre 18.

Em seguida, usando um perfurador, faz vários pedaços de politetrafluoretileno de seis milímetros de diâmetro e 3,18 milímetros de espessura. Em seguida, no centro desses discos, crie um orifício, transformando os discos em arruelas. Corte a arruela em forma de trapézio para ajudar a alojá-los durante a implantação do molar.

Para completar o cateter, empurre uma agulha presa ao tubo de PE completamente através da arruela e deslize a arruela rente ao tubo. O protocolo a seguir leva cerca de 75 minutos para ser concluído. Comece com um rato preparado para a cirurgia e abra a boca usando um cotonete.

Em seguida, empurre a agulha em uma cânula no tecido entre a bochecha e o primeiro molar superior, de modo que a agulha saia logo atrás e medial às orelhas. Em seguida, suba a cânula e prenda a arruela aos molares para firmar o cateter na agulha exposta. Deslize uma arruela e aperte-a na incisão.

Prenda esta arruela na posição. Apare o tubo de forma que dois a quatro centímetros permaneçam expostos acima da cabeça do rato. Em seguida, usando a mesma técnica, coloque um cateter no outro lado da boca.

Em seguida, coloque o rato em uma estrutura estereotáxica e faça três furos para as cânulas e eletrodos para fazer gravações na posição central do núcleo accumbens. A cânula guia 1,2 milímetros anterior e 1,4 milímetros. Torema lateral.

Abaixe o aparelho da cânula até que a base de plástico esteja nivelada com o crânio. Coloque o eletrodo de referência no hemisfério contralateral à cânula guia. Abaixe a referência cerca de dois milímetros abaixo da dura-máter.

Em seguida, posicione o eletrodo de estimulação, 5,2 milímetros posterior e 1,0 milímetros lateral. Para atingir a área tegmental ventral. Abaixe o eletrodo estimulante 8,0 milímetros abaixo da dura-máter.

Em seguida, prenda os componentes com parafusos e cimento e forneça cuidados pós-operatórios. Antes de realizar um experimento, sempre verifique a permeabilidade da cânula oral infundindo 200 microlitros de água e observe se o rato sente o gosto da água, limpe o local de gravação removendo a cânula fictícia, adicionando duas gotas de heparina a 50% e, em seguida, reposicionando-a suavemente. O manequim não deve estar a menos de dois milímetros do local de registo.

Agora conecte e estabilize o estágio da cabeça ao estimulador implantado no VTA e, em seguida, abaixe o eletrodo de registro no núcleo accumbens. Agora, seguindo o protocolo de texto, produza um conjunto de dados de treinamento. Espere sempre pelo menos dois minutos, mas até quatro a cinco minutos entre as estimulações para permitir a recarga vesicular E deve.

A etapa mais crítica do experimento é obter um eletrodo de alta qualidade. Se o fundo é uma forma arredondada característica na fase ascendente é um bom eletrodo. Se a forma arredondada for pequena ou corresponder à forma de onda aplicada, tente um eletrodo diferente.

Se o fundo estiver exatamente onde foi deslocado, aplique um deslocamento à forma de onda aplicada em uma direção positiva em incrementos de 0,1 volt. Uma vez que um conjunto de treinamento é gerado no local de gravação, colete dados enquanto infunde bolus de 200 microlitros de taten a cada um a três minutos por 25 infusões. Em seguida, espere pelo menos 30 minutos e infunda o próximo sabor da mesma maneira.

O FSCV combinado com o implante de cateter intraoral foi usado para examinar como a sacarose e a AIT de taten modulam a liberação fásica de dopamina no núcleo accumbens antes da infusão de taten, a estimulação elétrica indicada pela barra vermelha do VTA produziu aumentos robustos na liberação de dopamina fásica no núcleo accumbens após a aquisição do conjunto de treinamento 6,5 segundos infusões de 200 microlitros de sacarose indicadas pela barra vermelha produzida em elevação em corrente indicada pela seta branca. Isso ocorreu no potencial de oxidação da dopamina, que é indicado pela linha tracejada branca, transformando os dados em um gráfico de concentração versus tempo. Após PCA verificou que o aumento da corrente em resposta ao sabor é o resultado de um aumento na concentração de dopamina.

Outro mentol de tatina foi infundido durante as gravações do FSCV no núcleo accumbens, aumento da concentração de dopamina também foi observado após a infusão de mentol Uma vez dominada, a cirurgia intraoral e canulação combinada pode ser realizada em 75 minutos. Essa técnica pode ser combinada com outras formas de comportamento, como um condicionamento pavloviano competitivo e aversivo e opera, a fim de responder a perguntas sobre a sinalização de dopamina em subsegundos durante esses processos.