Name: Exame de Rapid dopamina Dynamics com Fast digitalização Voltametria Cíclica Durante Intra-oral Administração saborizante em ratos acordados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a medir respostas rápidas de dopamina a estímulos gustativos orais em ratos acordados usando voltametria cíclica de varredura rápida. Este método permite registrar a liberação de neurotransmissores em tempo real.

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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por uma Bolsa de Pesquisa de Pós-Graduação da NSF (RJW) e pelo Instituto Nacional de Abuso de Drogas dos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Centro de Produtos de Tabaco da FDA (CTP) sob o Prêmio Número P50DA036151 (EJN e NAA). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial do National Institutes of Health.

<ol><li>Roitman, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+operates+as+a+subsecond+modulator+of+food+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine operates as a subsecond modulator of food seeking.</a> J Neurosci. 24 (6), 1265-1271 (2004).</li>
<li>Aragona, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specificity+in+the+real-time+development+of+phasic+dopamine+transmission+patterns+during+acquisition+of+a+cue-cocaine+association+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regional specificity in the real-time development of phasic dopamine transmission patterns during acquisition of a cue-cocaine association in rats.</a> European Journal of Neuroscience. 30 (10), 1889-1899 (2009).</li>
<li>Wheeler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+cues+drive+opposing+context-dependent+shifts+in+reward+processing+and+emotional+state%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cocaine cues drive opposing context-dependent shifts in reward processing and emotional state.</a> Biol Psychiatry. 69 (11), 1067-1074 (2011).</li>
<li>Wickham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+studying+phasic+dopamine+signaling+in+brain+reward+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Elite+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms.</a> Front Biosci (Elite Ed). 5, 982-999 (2013).</li>
<li>Roitman, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+chemical+responses+in+the+nucleus+accumbens+differentiate+rewarding+and+aversive+stimuli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Real-time chemical responses in the nucleus accumbens differentiate rewarding and aversive stimuli).</a> Nature Neuroscience. 11 (12), 1376-1377 (2008).</li>
<li>Cheer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasic+dopamine+release+evoked+by+abused+substances+requires+cannabinoid+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phasic dopamine release evoked by abused substances requires cannabinoid receptor activation.</a> J Neurosci. 27 (4), 791-795 (2007).</li>
<li>Owesson-White, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+encoding+of+cocaine-seeking+behavior+is+coincident+with+phasic+dopamine+release+in+the+accumbens+core+and+shell%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural encoding of cocaine-seeking behavior is coincident with phasic dopamine release in the accumbens core and shell.</a> Eur J Neurosci. 30 (6), 1117-1127 (2009).</li>
<li>Phillips, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsecond+dopamine+release+promotes+cocaine+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subsecond dopamine release promotes cocaine seeking.</a> Nature. 422 (6932), 614-618 (2003).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levels+of+mint+and+wintergreen+flavorants%3A+smokeless+tobacco+products+vs.+confectionery+products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Levels of mint and wintergreen flavorants: smokeless tobacco products vs. confectionery products.</a> Food Chem Toxicol. 48 (2), 755-763 (2010).</li>
<li>Manning, K. C., Kelly, K. J., Comello, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavoured+cigarettes%2C+sensation+seeking+and+adolescents%27+perceptions+of+cigarette+brands%5BTitle%5D)+AND+%22Tob+Control%22%5BJournal%5D)">Flavoured cigarettes, sensation seeking and adolescents' perceptions of cigarette brands.</a> Tob Control. 18 (6), 459-465 (2009).</li>
<li>Rainey, C. L., Conder, P. A., Goodpaster, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+characterization+of+dissolvable+tobacco+products+promoted+to+reduce+harm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical characterization of dissolvable tobacco products promoted to reduce harm.</a> J Agric Food Chem. 59 (6), 2745-2751 (2011).</li>
<li>Phillips, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+phasic+changes+in+extracellular+dopamine+concentration+in+freely+moving+rats+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).</li>
<li>Robinson, D. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+DL+%22Rapid+Dopamine+Release+in+Freely+Moving+Rats.+Electrochemical+Methods+for+Neuroscience%22">Rapid Dopamine Release in Freely Moving Rats. Electrochemical Methods for Neuroscience</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2007).</li>
<li>Montague, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gain+control+of+dopamine+delivery+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals.</a> J Neurosci. 24 (7), 1754-1759 (2004).</li>
<li>Heien, M. L., Johnson, M. A., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+neurotransmitters+detected+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Resolving neurotransmitters detected by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Anal Chem. 76 (19), 5697-5704 (2004).</li>
<li>Keithley, R. B., Heien, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+concentration+determination+using+principal+component+regression+with+residual+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Multivariate concentration determination using principal component regression with residual analysis.</a> Trends Analyt Chem. 28 (9), 1127-1136 (2009).</li>
<li>Keithley, R. B., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rank+estimation+and+the+multivariate+analysis+of+in+vivo+fast-scan+cyclic+voltammetric+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Rank estimation and the multivariate analysis of in vivo fast-scan cyclic voltammetric data.</a> Anal Chem. 82 (13), 5541-5551 (2010).</li>
<li>Rising, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+Young+Adults%3A+description+and+use+of+an+innovative+health+insurance+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Adolesc+Health%22%5BJournal%5D)">Healthy Young Adults: description and use of an innovative health insurance program.</a> J Adolesc Health. 41 (4), 350-356 (2007).</li>
<li>Day, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+learning+mediates+dynamic+shifts+in+dopamine+signaling+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Associative learning mediates dynamic shifts in dopamine signaling in the nucleus accumbens.</a> Nature Neuroscience. 10 (8), 1020-1028 (2007).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholamines+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+reciprocally+respond+to+reward+and+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Catecholamines in the bed nucleus of the stria terminalis reciprocally respond to reward and aversion.</a> Biol Psychiatry. 71 (4), 327-334 (2012).</li>
<li>Wheeler, R. A., Carelli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroscience+of+pleasure.+Focus+on+%27Ventral+pallidum+firing+codes+hedonic+reward%3A+when+a+bad+taste+turns+good%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The neuroscience of pleasure. Focus on 'Ventral pallidum firing codes hedonic reward: when a bad taste turns good.</a> J Neurophysiol. 96 (5), 2175-2176 (2006).</li>
<li>Bunin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+and+uptake+rates+of+5-hydroxytryptamine+in+the+dorsal+raphe+and+substantia+nigra+reticulata+of+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain.</a> J Neurochem. 70 (3), 1077-1087 (1998).</li>
<li>Zimmerman, J. B., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+electrochemical+measurements+of+oxygen+and+dopamine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous electrochemical measurements of oxygen and dopamine in vivo.</a> Anal Chem. 63 (1), 24-28 (1991).</li>
<li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+evaluating+the+reinforcing+properties+of+tastants+in+laboratory+rats%3A+operant+intraoral+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for evaluating the reinforcing properties of tastants in laboratory rats: operant intraoral self-administration.</a> J Vis Exp. (84), e50956(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Entrega saborizante intra-oral combinado com FSCV permite a análise de &quot;tempo real&quot; respostas Da e aromatizantes orais. Existem três passos críticos no protocolo que são necessárias para as medições de DA bem sucedidas. Em primeiro lugar, a implantação adequada do cateter por via oral é crítica para o fornecimento de aromatizantes. Garantir que o cateter é inserido atrás do primeiro molar e encravado no lugar impede que o cateter de perder permeabilidade e impede a remoção acidental pelo animal. A lavagem do c...

Erratum: Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

A liberação fásica do DA desempenha um papel importante na mediação do comportamento direcionado à recompensa [1-3]. No entanto, isolar e estudar como uma recompensa primária altera a liberação fásica de DA é muitas vezes complicado por processos comportamentais ou cognitivos concomitantes que também são capazes de alterar a liberação fásica de DA - como processos de tomada de decisão ou comportamento motor direcionado à recompensa para adquirir a recompensa. No presente trabalho, isolamos as respostas fásicas de DA a saborizantes por meio do uso de voltametria cíclica de varredura rápida in vivo (FSCV) combinada com entrega de saborizantes por meio de cânulas intraorais. Essa técnica ignora a escolha e a ação e nos permite examinar a liberação extracelular de DA durante a infusão direta de um saborizante no palato de um rato.
FSCV é uma técnica eletroquímica com alta resolução temporal e espacial, permitindo medidas de liberação de DA em uma área local discreta (aproximadamente 100 μm) em uma escala de sub-segundo (resolução de 10 Hz). A combinação de administração intraoral e FSCV oferece a vantagem de observar respostas rápidas e "em tempo real" de DA a um saborizante, que não pode ser examinado usando métodos convencionais de microdiálise. Além disso, a liberação fásica de DA em resposta a recompensas ou pistas associadas a recompensas ocorre em concentrações entre 20-100 nM, que está acima do limite de detecção de 10-20 nM para FSCV [4]. A alta resolução espacial do FSCV também permite o registro de sub-regiões de pequenas áreas cerebrais, como o núcleo accumbens (NAc). Assim, o FSCV combinado com infusões intraorais de saborizantes é um modelo ideal para estudar como os saborizantes ou outros estímulos alteram a liberação fásica de DA em animais acordados e comportados. De fato, essas técnicas permitiram experimentos investigando como saborizantes recompensadores e aversivos alteram a liberação extracelular de DA [5]. 
Na última década, as análises do FSCV foram combinadas com sucesso com paradigmas de administração intravenosa de drogas [6] e autoadministração de ratos [7, 8] para identificar o papel dos mecanismos fásicos de DA em modelos de dependência de drogas. Além disso, a entrega intraoral combinada com FSCV tem sido usada para examinar como as pistas de saborizantes emparelhadas com a disponibilidade de cocaína modulam a liberação fásica de DA e as respostas comportamentais que refletem o afeto emocional [3]. Essa metodologia intraoral e FSCV combinada também pode ser poderosamente utilizada para examinar as respostas fásicas do DA a aromatizantes, como mentol e adoçantes orais, que são adicionados a cigarros e produtos de tabaco solúveis [9-11]. Embora muitos dos aromatizantes adicionados aos produtos de tabaco sejam apetitivos [9-11], não se sabe se esses aromatizantes aumentam a liberação fásica de DA de maneira consistente com uma valência hedônica recompensadora. De fato, os aromatizantes adicionados aos cigarros e aos produtos de tabaco solúveis podem ter efeitos diretos no sistema de recompensa do DA e podem atuar por meio de mecanismos dopaminérgicos para influenciar a valência recompensadora de cigarros e outros produtos de tabaco. Assim, a administração intraoral combinada com o FSCV pode fornecer uma nova compreensão sobre como os aromatizantes modulam a liberação rápida de DA. O uso da metodologia combinada intra-oral e in vivo FSCV, e os dados obtidos de tais estudos, também podem facilitar estudos futuros para determinar como os aromatizantes e a nicotina interagem para alterar a sinalização do DA e potencialmente modular o reforço da nicotina. Além disso, os dados obtidos com esses estudos podem ser usados para informar as decisões regulatórias sobre aromatizantes de produtos de tabaco.

<table><tbody><tr><td>Estimulador elétrico</td><td>PlasticsOne</td><td>MS303/2-A/SPC</td><td>ao solicitar, pedir corte de 22 mm abaixo do pedestal</td></tr><tr><td>Cânula para eletrodo</td><td>BioAnalytical Systems</td><td>MD-2251</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro</td><td>A-M systems</td><td>624503</td><td></td></tr><tr><td>Fibra de carbono</td><td>Thornel</td><td>T650</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de eletrodos</td><td>Narishige International</td><td>PE-22</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/neurolog-system/" target="_blank"&gt;Isolador de estímulo Neurolog&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://digitimer.com" target="_blank"&gt;Digitimer Ltd.&lt;/a&gt;</a></td><td>&lt;a href="http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds4-bi-phasic-stimulus-isolator/" target="_blank"&gt;DS4&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Revestimento retrátil térmico</td><td>3M</td><td>FP-301</td><td></td></tr><tr><td>Fios isolados para eletrodos</td><td>Squires electronics</td><td>Custom</td><td>L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epóxi</td><td>ITW Devcon</td><td>14250</td><td>"epóxi de 5 minutos"</td></tr><tr><td>Copolímero de perfluoro-3,6-dioxo-4-metil-7-octeno-ácido sulfônico e politetrafluoretileno</td><td>Ion Power</td><td>LQ-1105</td><td>&lt;em&gt;ou seja,&lt;/em&gt; Nafion</td></tr><tr><td>Tinta de prata</td><td>GC Electronics</td><td>22-023</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>BK Precision</td><td>9110</td><td></td></tr><tr><td>Tubo para cateteres intraorais</td><td>Intramedic</td><td>427426</td><td>PE 100, D.I. = 0,86 mm; D.E. = 1,52 mm</td></tr><tr><td>Tubo para infusão intraoral</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-587-1A</td><td>D.I. 1/32"; D.E. 3/32"</td></tr><tr><td>Bomba de seringa para célula de fluxo</td><td>Pump Systems Inc.</td><td>NE 1000</td><td></td></tr><tr><td>Cimento cirúrgico</td><td>Dentsply Caulk</td><td>675571 e 675572</td><td></td></tr><tr><td>Atuador pneumático</td><td>VICI</td><td>A60</td><td>interface de válvula digital de 6 posições</td></tr><tr><td>Interface de válvula digital</td><td>VICI</td><td>DVI</td><td>230 VAC</td></tr><tr><td>Cabeçote quádruplo</td><td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação UEI</td><td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixa de interface UEI</td><td>Univ. of N. Carolina, Electronics Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação para bomba de seringa de substância gustativa</td><td>Med Associates</td><td>SG-504</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa de substância gustativa</td><td>Med Associates</td><td>PHM-107</td><td></td></tr><tr><td>Microeletrodo de tungstênio</td><td>MicroProbes</td><td>WE30030.5A3</td><td></td></tr><tr><td>Fio de prata com AgCl como referência</td><td>InVivo Metric</td><td>E255A</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>80497</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Ácido perclórico</td><td>Sigma</td><td>244252</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (4 M)</td><td>Sigma</td><td>54435</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma</td><td>306576</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de dopamina</td><td>Sigma</td><td>H8502</td><td></td></tr><tr><td>Software TarHeel HDCV</td><td>University of North Carolina-Chapel Hill</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.chem.unc.edu/facilities/index.html?display=electronics&amp;amp;content=software&amp;amp;software_id=2" target="_blank"&gt;É necessário solicitar o software: clique aqui para acessar a página de solicitação&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

exame de rapid dopamina dynamics com fast digitalização voltametria cíclica durante intra-oral administração saborizante em ratos acordados

Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats

A liberação rápida e fásica de dopamina (DA) no cérebro de mamíferos desempenha um papel crítico no processamento de recompensas, aprendizado por reforço e controle motivacional. A voltametria cíclica de varredura rápida (FSCV) é uma técnica eletroquímica com alta resolução espacial e temporal (subsegundo) que tem sido utilizada para examinar a liberação fásica de DA em vários tipos de preparações. Experimentos in vitro em células únicas e fatias de cérebro e experimentos in vivo em roedores anestesiados têm sido usados para identificar mecanismos que medeiam a liberação e captação de dopamina em condições normais e em modelos de doenças. Nos últimos 20 anos, experimentos in vivo do FSCV em roedores acordados e em movimento livre também forneceram informações sobre os mecanismos dopaminérgicos no processamento e aprendizado de recompensas. Uma grande vantagem da preparação acordada e em movimento livre é a capacidade de examinar as flutuações rápidas do DA que estão bloqueadas no tempo para eventos comportamentais específicos ou para recompensar ou sugerir a apresentação. No entanto, uma limitação dos experimentos combinados de comportamento e voltametria é a dificuldade de dissociar os efeitos do DA que são específicos para estímulos primários recompensadores ou aversivos de flutuações concomitantes do DA que medeiam comportamentos direcionados à recompensa ou outros comportamentos motores. Aqui, descrevemos um método combinado usando FSCV in vivo e infusão intraoral em um rato acordado para investigar diretamente as respostas de DA a saborizantes orais. Nesses experimentos, os saborizantes orais são infundidos diretamente no paladar do rato - ignorando o comportamento direcionado à recompensa e o comportamento voluntário de beber - permitindo o exame direto das respostas do DA aos estímulos do saborizante.

FSCV combinado com implantação do cateter intra-oral foi usado para examinar como a sacarose, um saborizante appetitive, modula a liberação fásica DA no núcleo NAc. Antes da perfusão saborizante, a estimulação elétrica (150 mA, 60 Hz, 24 pulsos; indicado pela barra vermelha) do VTA produz aumentos robustos na liberação fásica DA no NAc (Figura 1) Figura 1 mostra um gráfico colorido com potencial diante. o eixo y, o tempo no eixo-x, e corrente (representada como falsa cor) no eixo z. Abaixo do gráfico co...

Flutuações rápidas na dopamina extracelular (DA) medeiam tanto o processamento de recompensas quanto o comportamento motivado em mamíferos. Este manuscrito descreve o uso combinado de voltametria cíclica de varredura rápida (FSCV) e administração intraoral de saborizantes para determinar como os saborizantes alteram a liberação rápida de dopamina em ratos acordados e em movimento livre.

Exame de Rapid dopamina Dynamics com Fast digitalização Voltametria Cíclica Durante Intra-oral Administração saborizante em ratos acordados

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. ...

O objetivo geral deste procedimento é medir respostas de dopamina em escala de subsegundos a sabores orais concentrados. Isso é realizado primeiramente pela confecção de cânulas orais, eletrodos de referência e eletrodos de fibra de carbono necessários para os procedimentos cirúrgicos e posterior registro por meio de telemetria cíclica rápida por varredura de voltagem. O segundo passo consiste na implantação cirúrgica das cânulas orais, do eletrodo intracraniano e da cânula-guia para o eletrodo de fibra de carbono.Uma semana depois, o microeletrodo de fibra de carbono pode ser posicionado no núcleo accumbens para registrar alterações na liberação extracelular de dopamina em resposta à administração intraoral de sabores. O passo final após a gravação é calibrar o eletrodo e utilizar a análise de componentes principais para isolar os dados que contêm informações sobre a dopamina. Em última instância, o uso combinado da administração intraoral de sabores e da voltametria cíclica de varredura rápida é empregado para demonstrar alterações nas respostas de dopamina em escala de subsegundos em resposta ao sabor.Existem duas vantagens principais dessa técnica combinada em comparação com os métodos existentes. Primeiro, a fotometria de IC rápida possui uma alta resolução temporal e, segundo, a administração intraoral de taten minimiza o movimento que o rato precisa fazer para obter o tatin e nos permite isolar melhor as respostas de dopamina ao tatin. Geralmente, indivíduos novos nesse método terão dificuldade na fabricação do cateter oral.No entanto, a construção de um cateter oral adequado e bem fixado garantirá um encaixe firme do cateter entre a bochecha e os molares superiores, aumentando a probabilidade de um experimento bem-sucedido. Para preparar o eletrodo de registro, aspire primeiro uma fibra de carbono T6 50 com diâmetro de sete mícrons para dentro de uma capilar de vidro de borossilicato com diâmetro interno de 0,4 milímetros. Em seguida, posicione a capilar em um puxador de eletrodos vertical; inicialmente, puxe com o aquecedor ajustado a 55,0 e o ímã desligado, depois ajuste conforme necessário.Após puxar a pipeta sob um microscópio, corte a fibra de carbono exposta de modo que ela se estenda de 75 a 100 micrômetros além do vidro. A fibra dentro do vidro deve ser hermeticamente selada; caso contrário, descarte o preparo. Em seguida, retire a isolação da metade de um fio de 7,6 cm de calibre 30, e aplique um revestimento termorretrátil para fixar o eletrodo ao micromanipulador.Em seguida, aplique uma camada fina de tinta de prata ao fio enquanto a tinta ainda estiver úmida. Insira o fio na extremidade aberta do eletrodo e fixe-o à fibra de carbono no interior. Verifique esse contato sob um microscópio.Segure o eletrodo no micromanipulador e fixe-o com tubo termorretrátil. Coloque o eletrodo de fibra de carbono preparado em IPA por pelo menos 10 minutos para limpar a superfície do eletrodo e aumentar a sensibilidade subsequente à dopamina. Após remover o eletrodo do IPA, enxágue a fibra de carbono com água da torneira para remover o IPA.Em seguida, prepare o eletrodo de referência a partir de um fio de prata de 13 milímetros com uma malha de cloreto de prata, prata de seis milímetros e diâmetro de 0,4 milímetro, corte a porção do fio sem malha e solda-a a um pino de ouro. Em seguida, aplique epóxi à solda. Depois, mergulhe a porção da malha em um ácido copolimérico cinco vezes.Deixe secar por 30 minutos no ar entre mergulhos após o último mergulho. Deixe secar ao ar durante a noite. No dia seguinte.Asse a parte em malha do fio a 120 graus Celsius por uma hora. Para fabricar o cateter oral, primeiro corte o tubo de polietileno 100 em segmentos de seis centímetros.Em seguida, faça um pequeno disco plano em um dos segmentos do tubo derretendo a extremidade e pressionando-a sobre uma superfície plana e fria no centro do disco. Use uma agulha de calibre 18 para criar um orifício. Prenda a outra extremidade do segmento do tubo à extremidade romba de uma agulha de calibre 18.Em seguida, utilizando um furador, obtenha vários pedaços de politetrafluoretileno com diâmetro de seis milímetros e espessura de 3,18 milímetros. Depois, no centro desses discos, crie um orifício, transformando-os em arruelas. Corte a arruela no formato de um trapézio para facilitar seu encaixe durante a implantação do molar.Para concluir o cateter, empurre uma agulha ligada a um tubo de PE completamente através da arruela e deslize a arruela até encostar no tubo. O protocolo a seguir leva cerca de 75 minutos para ser concluído. Comece com uma rata preparada para cirurgia e abra sua boca usando um cotonete.Em seguida, insira a agulha de uma cânula no tecido entre a bochecha e o primeiro molar superior, de modo que a agulha saia logo atrás e medialmente às orelhas. Depois, mova a cânula para cima e fixe a arruela nos molares para estabilizar o cateter sobre a agulha exposta. Deslize uma arruela e aperte-a contra a incisão.Fixe esta arruela na posição. Corte o tubo de modo que dois a quatro centímetros permaneçam expostos acima da cabeça do rato. Em seguida, utilizando a mesma técnica, insira um cateter no outro lado da boca.Em seguida, coloque o rato em um estereotáxico e faça três furos para as cânulas e eletrodos a fim de realizar gravações na região do núcleo do accúmbens. A cânula-guia a 1,2 milímetros anterior e 1,4 milímetros lateral ao forame interventricular.Abaxe o aparelho de cânula até que a base plástica fique nivelada com o crânio. Coloque o eletrodo de referência no hemisfério contralateral à cânula-guia. Abaxe a referência cerca de dois milímetros abaixo da dura-máter.Em seguida, posicione o eletrodo estimulador a 5,2 milímetros posterior e 1,0 milímetro lateral em relação ao recesso. Para atingir a área tegmental ventral. Abaixe o eletrodo estimulador 8,0 milímetros abaixo da dura-máter.Em seguida, fixe os componentes com parafusos e cimento e forneça cuidados pós-operatórios. Antes de realizar um experimento, verifique sempre a patência da cânula oral infundindo 200 microlitros de água e observe se o rato sente o gosto da água; limpe o local de registro removendo a cânula fictícia, adicionando duas gotas de heparina a 50% a ela e, em seguida, reposicionando-a suavemente. A cânula fictícia não deve estar a menos de dois milímetros do local de registro.Agora fixe e estabilize o estágio da cabeça no estimulador implantado na área tegmental ventral e, em seguida, introduza o eletrodo de registro no núcleo accumbens central. Agora, seguindo o protocolo descrito, produza um conjunto de dados de treinamento. Espere sempre pelo menos dois minutos, mas até quatro ou cinco minutos entre as estimulações para permitir a recarga vesicular e deve.O passo mais crítico do experimento é obter um eletrodo de alta qualidade. Se o fundo apresenta uma forma arredondada característica na fase ascendente, trata-se de um bom eletrodo. Se a forma arredondada for pequena ou se assemelhar muito à forma de onda aplicada, experimente um eletrodo diferente.Se o fundo estiver deslocado para a direita, aplique um deslocamento de compensação na forma de onda aplicada em direção positiva em incrementos de 0,1 volt. Após gerar um conjunto de treinamento no local de gravação, colete dados enquanto infunde bolus de 200 microlitros de taten a cada um a três minutos durante 25 infusões. Em seguida, espere pelo menos 30 minutos e infunda o próximo sabor da mesma maneira.A FSCV combinada com a implantação de cateter intraoral foi utilizada para examinar como a sacarose e um AIT de taten modulam a liberação fásica de dopamina no núcleo accumbens antes da infusão de taten. A estimulação elétrica indicada pela barra vermelha da VTA produziu aumentos robustos na liberação fásica de dopamina no núcleo accumbens após a aquisição do conjunto de treinamento. Infusões de 6,5 segundos de 200 microlitros de sacarose, indicadas pela barra vermelha, produziram uma elevação na corrente indicada pela seta branca. Isso ocorreu no potencial de oxidação da dopamina, indicado pela linha tracejada branca, transformando os dados em um gráfico de concentração versus tempo. Após a análise de componentes principais (PCA) confirmar que o aumento na corrente em resposta ao sabor é resultado de um aumento na concentração de dopamina.Outro tatin mentol foi infundido durante gravações de FSCV no núcleo do accumbens, e um aumento na concentração de dopamina também foi observado após a infusão de mentol. Uma vez dominada, a cirurgia combinada intraoral e de cânula pode ser realizada em 75 minutos. Esta técnica pode ser combinada com outras formas de comportamento, como condicionamento pavloviano competitivo e aversivo e condicionamento operante, a fim de responder perguntas sobre a sinalização de dopamina em escala de subsegundos durante esses processos.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

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Pré-sináptica de dopamina Dynamics em fatias de cérebro estriado com Fast-scan voltametria cíclica

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