Neural Activity Propagação em uma Unfolded Hippocampal Preparação com um penetrante Micro-eletrodo Matriz

O objetivo geral deste procedimento é introduzir o processo de desdobramento do hipocampo de roedores e colocar a preparação de tecido plano no conjunto de microeletrodos penetrantes. Para gravação. Isso é feito isolando primeiro o hipocampo de um camundongo da metade de seu cérebro.

O segundo passo é desdobrar a estrutura curva do hipocampo com ferramentas personalizadas. Em seguida, o hipocampo desdobrado é transferido para a câmara de gravação e colocado na matriz de gravação. A etapa final é remover o hipocampo desdobrado da matriz após o experimento.

Em última análise, o método de mapeamento de normalização individual é usado na análise de dados para mostrar a propagação da atividade neural registrada pelo conjunto de microeletrodos penetrantes. Bem, a principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite registrar a atividade neural em duas direções: transversal e longitudinal. Para ver a propagação real da atividade neural, você precisa de um hipocampo intacto, desenrolar os potes de amassados e deitar em uma câmara de gravação, e a propagação ocorrerá nas direções transversal e longitudinal.

E fomos capazes de descobrir a velocidade de propagação do tecido. Estávamos com a atividade nas duas direções e pudemos estudar os mecanismos de propagação, em particular, os mecanismos não sinápticos. Fomos capazes de ver a atividade se propagando com essa transmissão sináptica com essas junções comunicantes e, por causa da velocidade, sabemos que não é difusão.

Então, agora estamos tentando descobrir os mecanismos reais dessa propagação. Geralmente, os indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades devido aos procedimentos desafiadores de desdobrar o hipocampo e colocar a preparação de tecido plano neste micro feixe de eletrodos penetrantes sem danificar o tecido ou a matriz. Para iniciar este procedimento, coloque a cabeça do rato em sacarose oxigenada gelada.

Um LCR usa uma tesoura fina para remover a pele do crânio. Em seguida, corte o crânio ao longo da linha média e as duas extremidades próximas ao lobo temporal. Em seguida, descasque o crânio cortado para os lados da cabeça.

Para expor o cérebro, remova cuidadosamente o cérebro do crânio com a espátula. Depois disso, coloque o cérebro em um estágio cirúrgico gelado coberto com papel de filtro úmido. Remova o cerebelo com uma lâmina gelada.

Posteriormente, separe os dois hemisférios cortando a linha média do cérebro. Em seguida, coloque os dois hemisférios separados em um copo cheio de sacarose gelada. Um LCR borbulhou com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono.

Transfira um hemisfério para o estágio gelado coberto com papel de filtro. Coloque toalhas de papel comuns ou papéis de filtro ao redor do cérebro para absorver a solução extra. Depois, use duas pipetas de vidro polido para separar o córtex da parte central do cérebro, a fim de expor o hipocampo.

Em seguida, aplique duas a três gotas de suse A CSF gelado no tecido e remova a solução extra. Corte as conexões com o córtex nas duas extremidades do hipocampo. Em seguida, disseque o hipocampo para fora do cérebro com as ferramentas de vidro polido a fogo.

Em seguida, separe todo o hipocampo com o lado voltado para cima e o sulco do hipocampo voltado para baixo Aplique rapidamente duas a três gotas de LCR gelado no tecido novamente e remova a solução extra ao redor dele. Em seguida, use a ferramenta de vidro polido a fogo para virar todo o hipocampo. Para expor o sulco, use uma lâmina gelada para aparar as extremidades septal e temporal do hipocampo.

Se necessário, insira uma agulha de vidro personalizada no sulco e corte a trilha de fibra de DG a cerca de três. Em seguida, use um laço de arame de metal para puxar o DG e desdobrar o hipocampo. Todo o processo de cirurgia geralmente dura cerca de dois minutos.

Aplique mais duas a três gotas de sacarose A CSF gelada no tecido e remova a solução extra ao redor dele. Em seguida, apare as bordas do hipocampo desdobrado com uma lâmina gelada. Transfira a preparação para a câmara de recuperação cheia de LCR A normal e borbulhada com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono em temperatura ambiente por uma hora antes de transferi-la para a câmara de registro.

Neste procedimento, encha um frasco com um LCR normal e outro frasco com quatro bolhas AP A CSF. As soluções com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono desde o início dos experimentos. Use um conector trivalve para controlar qual solução será selecionada durante um experimento.

Em seguida, conecte um tubo de vácuo à saída da câmara. Para remover a solução em um recipiente de pó, aqueça a tubulação antes de entregar a solução na câmara de registro e mantenha-a a uma temperatura controlada de 35 graus Celsius. Depois de fechar a entrada e a saída da câmara de gravação, use um conta-gotas de pipeta de vidro personalizado para transferir o hipocampo desdobrado para a câmara de gravação.

Sob a posição do microscópio, o hipocampo desdobrado, com o lado alvia voltado para baixo, ca uma área de três apontando para longe e ca um campo apontando para o pesquisador, aspire cuidadosamente a solução na câmara usando uma pipeta a vácuo da borda da câmara de registro até que a câmara esteja seca e o tecido fique na matriz. Em seguida, coloque cuidadosamente uma âncora de tecido personalizada em cima do tecido para segurar o hipocampo desdobrado na matriz. Reabasteça a câmara de gravação com algumas gotas de solução.

Abra gradualmente a entrada e a saída para ajustar a taxa de fluxo para cerca de duas gotas por segundo na câmara de disparo IV. Incubar o tecido na câmara de registo com LCR A normal durante cerca de um minuto. Em seguida, troque as soluções.

Aplique a quatro AP dissolvido A CSF e ajuste a taxa de fluxo corretamente. Incube o tecido em quatro AP dissolvido A CSF por cerca de cinco a 10 minutos antes da gravação. Para remover o tecido do PMEA, controle a âncora de tecido por um micromanipulador e levante gradualmente a âncora da câmara de registro.

Desligue a entrada e a saída para interromper o fluxo. Na câmara de gravação, use um pincel pequeno para levantar o canto do lenço de papel. Se o tecido não estiver flutuando na solução, use o tubo de vácuo para secar a câmara cuidadosamente com o tecido ainda sentado na matriz.

Em seguida, abra cuidadosamente a entrada para reabastecer gradualmente a câmara e desligue a entrada para interromper o fluxo. Quando a câmara de gravação estiver cheia, use o pincel pequeno para levantar o canto do lenço de papel. Outra vez. Se o tecido estiver flutuando na solução, use o tubo de vácuo para sugar o tecido.

Abra o fluxo na entrada e o vácuo na saída. Lave o sistema com água destilada e seque-o. Este é um exemplo da atividade espontânea induzida por 100 micromolares quatro AP A CSF registrados a partir de um dos microeletrodos localizados na região dendrítica basal com uma relação sinal-ruído de 34,9 decibéis.

E aqui estão as atividades ampliadas no retângulo vermelho. Estes são os dados brutos de outro microeletrodo localizado mais próximo do somata com uma relação sinal-ruído de 27,2 decibéis mostrada. Aqui está outro exemplo de gravação obtida a partir de um eletrodo posicionado dentro da camada somática.

Neste exemplo, a relação sinal-ruído é de 18,53 decibéis, e aqui está o ruído de linha de base registrado de um microeletrodo. A linha de base geralmente tem um valor pico a pico de 150 a 200 microvolts, e a impedância de um único eletrodo é de cerca de um a dois mega ohms. Este vídeo mostra a propagação neural gravada com a matriz e depois processada usando o método de normalização individual.

Na análise de dados, toda a propagação por todo o tecido dura cerca de 100 milissegundos Após este procedimento. Outros métodos, como neuroimagem no desdobrado, hipocampo in vitu também podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o movimento de focos neurológicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desdobrar o hipocampo no local, a preparação do tecido plano na matriz de micro palestras.