Name: Neural Activity Propagação em uma Unfolded Hippocampal Preparação com um penetrante Micro-eletrodo Matriz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda a desdobrar o hipocampo de roedores para preparação de tecido plano e registro neural com matriz de microeletrodos penetrantes. Esta técnica permite monitorar atividade em direções transversal e longitudinal simultaneamente.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 e pela cadeira dotada de E.L. Lindseth para Dominique M. Durand. Agradecemos ao laboratório do Dr. Andrew M. Rollins pela ajuda na imagem da OCT.

NOTA: Animal protocolos experimentais foram revisados ​​e aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na universidade. Ratos CD1 de ambos os sexos com a idade de P10 a P20 são usadas neste estudo. 1. Soluções para Cirurgia Experimental e Gravação <ol><li> Preparar tampão normal de fluido cerebrospinal artificial (ACSF) contendo (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO4 2, NaHCO3 26, glicose 10, e CaCl 2 2. Utilizar esta ACSF normal para a recuperação do tecido após a dissecação, bem como para o sistema de lavagem no início da experiência. </li><li> Prepare ACSF sacarose que é usada durante a dissecção do hipocampo e contém (mM): Sacarose 220, KCl 2,95, NaH 2 PO 4 1,3, MgSO 4 2, NaHCO3 26, glicose 10, e CaCl 2 2. A fim de induzir a actividade epileptiforme na preparação intacta tecido do hipocampo, e adicionar 4-aminopiridina (4-AP) para ACSF normal noa concentração de 100 uM. </li></ol> 2. Procedimento cirúrgico para a Intacta Hippocampus Preparação <ol><li> Gota isoflurano (1 ml) para dentro da câmara na parte inferior de um frasco de vidro exsicador (No.1 em Materiais e Equipamento específicos) e usar uma toalha de papel comum para cobrir a superfície da fase de fundo, de modo que o animal não entrar em contacto com o líquido. Em seguida, coloque o CD1 do mouse dentro do frasco e feche a tampa. Manter o animal no frasco fechado durante cerca de 1 min e 2 min. Quando a freqüência de respiração é de cerca de um por segundo, retire o mouse do frasco. </li><li> Posicione o mouse sobre o estágio de cirurgia e decapitar com uma tesoura adequados. Imediatamente após a decapitação, coloque a cabeça para dentro do gelado (3-4 ° C), oxigenado aCSF sacarose por cerca de 30 segundos. </li><li> Utilize uma tesoura fina (No.5 em Materiais e Equipamento específicos) para remover a pele na parte superior do crânio e para cortar o crânio, ao longo da linha média da cabeça, bem como em duas extremidades perto do ritmolóbulo ral. Use uma pinça (# 6 em materiais específicos e equipamentos) para descascar o crânio corte no sentido de cada lado da cabeça, a fim de expor o cérebro. </li><li> Insira uma espátula laboratório micro (No. 8 em materiais específicos e equipamentos) no espaço entre os lobos parietais do cérebro e do crânio de descascar cuidadosamente o cérebro a partir do fundo do crânio e, em seguida, solte-o em uma gelada preparada (3 -4 ° C) estágio cirúrgico coberto com papel de filtro molhado (No.2 em materiais específicos e equipamentos). Remover o cerebelo com uma lâmina de gelo-refrigerados e separar os dois hemisférios por corte da linha média do cérebro. Em seguida, colocar os dois hemisférios separadas em um copo cheio com a sacarose ACSF gelado borbulhar com 95% de O2 / 5% de CO 2. </li><li> Pegue uma metade do hemisfério e lugar no cenário papel de filtro gelada. Coloque toalhas de papel regulares ou filtro de papel ao redor do cérebro para sugar a solução extra. Use duas ferramentas de pipetas de vidro polido-fogo (# 10 em Materiais eEquipamento) para separar o córtex do resto da parte central do cérebro. </li><li> Após o hipocampo é exposta a partir de dentro do córtex e colocou na fase gelada, colocar dois ou três gotas de sacarose gelada ACSF sobre o tecido e, em seguida, remover a solução extra em torno do hipocampo. Corte as ligações com o córtex em duas extremidades do hipocampo. Em seguida, dissecar o hipocampo para fora do cérebro com as ferramentas de vidro polido de fogo e remover a restante parte do cérebro. </li><li> Separe toda a hipocampo com o seu lado alveus voltada para cima e hipocampo sulco voltado para baixo. Cair rapidamente duas ou três gotas de sacarose gelada ACSF sobre o tecido novamente e remover a solução extra em torno do tecido usando um pedaço de toalha de papel. Usar uma ferramenta de vidro polido ao fogo entregar todo o hipocampo para expor o sulco (Figura 1B, C). </li><li> Sob um microscópio óptico normal, inserir uma agulha de vidro feita sob encomenda (No. 11 em Materi Specificals e Equipamento) em uma das extremidades do sulco e cortar as conexões de fibra, a partir de giro dentado (DG) para subículo ou o campo CA1, ao longo da direcção do sulco (Figura 1C). Aplicar uma lâmina gelada para aparar as extremidades do septo e temporais do hipocampo, se necessário. Insira um loop fio de metal personalizado feito (No. 12 em materiais específicos e equipamentos) no sulco de corte e encostar o DG longe do tecido, mantendo o final subiculum / CA1 do hipocampo por uma ferramenta de fogo de vidro polido (Figura 1D) . </li><li> Seguindo o procedimento acima desdobramento, adicionar mais duas ou três gotas de sacarose ACSF gelado para remover o tecido e a solução extra em torno do tecido. Em seguida, a guarnição do hipocampo desdobrado com a lâmina gelada nas bordas (Figura 1E) e colocar a preparação de uma espátula para a câmara de recuperação preenchido com ACSF normal e borbulhada com 95% de O2 / 5% de CO2 à temperatura ambiente (cerca de 25 ° C). Deixaro tecido de hipocampo desdobrado para recuperar cerca de 1 hora antes da sua colocação na câmara de gravação. </li><li> Pegue o outro hemisfério cerebral e usá-lo a passar por etapas 2,5-2,9. Geralmente, levam cerca de 1 a 2 minutos para terminar todo o processo a se desenrolar um único hipocampo e soltar gelada sacarose aCSF continuamente para manter o tecido oxigenada e hidratada. </li></ol> Setup 3. Sistema Experimental <ol><li> Cole um PMEA fabricados sob encomenda em um pacote pin grid array (PGA) e usar ligação micro fios para conectar cada almofada a partir de um único microeléctrodos para a almofada de um pino sobre o pacote (Figura 3B). Em seguida, insira o pacote no soquete em uma placa de circuito feito sob medida 13. </li><li> Individualmente conectar cada microeletrodos para seus filtros com passagem de banda de freqüência de corte de 1 Hz a 4 KHz e amplificadores com ganho de 100 na placa de circuito personalizado feito 13. Digitalize a saída analógica da placa de circuito por um A D conv /sistema Erting, e adquirir e armazenar os dados em um computador. </li><li> Cole numa câmara de registo de plástico feito por medida em torno da matriz e com uma entrada de tubo de saída para o fluxo da solução (Figura 4A). Use pelo menos duas garrafas para manter as soluções diferentes no sistema, e se juntar e controlar a tubagem de saída das garrafas por um grupo tri-válvula. Ligue a saída do tri-válvula para um sistema de tubagem com uma câmara de gotejamento IV, que é guiar a solução para a câmara de gravação. </li><li> Entre os tri-válvula e a entrada da câmara de gravação, adicionar um aquecedor eléctrico para aquecer a solução a uma temperatura controlada (35 ° C) antes que a solução é orientada para a câmara de registo. Anexar a saída da câmara de registo para um tubo de vácuo para recolher a solução para um balão ligado tubo de vácuo. Não reciclar qualquer solução em qualquer experiência neste estudo. </li></ol> 4. Colocar o Unfolded Hippocampus para o PMEA para registrar a atividade Neural </p&gt; <ol><li> Para preparar a configuração experimental, encha uma garrafa com aCSF normal e outra garrafa com 4-AP aCSF. Em ambos os frascos, bolha de 95% de O2 / 5% de CO 2 a partir do início de cada experiência. Usar um conector tri-válvula para controlar qual a solução será seleccionado durante uma experiência. Conectar um tubo de vácuo na saída da câmara para bombear a solução para um recipiente de pó. Aquece-se a tubagem antes de serem enviados para a câmara de registo e manter a solução a um nível de temperatura controlada (35 ° C). </li><li> Quando a entrada e a saída de câmara de registo está fechado, utilizar um conta-gotas de pipeta de vidro feito à medida para transferir e colocar o hipocampo desdobrado para dentro da câmara de gravação. Sob o microscópio, posicionar o hipocampo desdobrado utilizando um pequeno pincel de pintura regular, enquanto o tecido está a flutuar na solução. Coloque o hipocampo desdobrado com o seu lado alveus voltada para baixo, a área CA3 apontando para fora, e no campo CA1 apontando para o pesquisador. </li&gt; <li> Chupar cuidadosamente afastado da solução na câmara de vácuo com uma pipeta a partir da borda da câmara de registo para reduzir o nível da solução até que a câmara é seca e o tecido é reduzido, para o agrupamento. Em seguida, coloque cuidadosamente uma âncora de tecido feito à medida (Figura 4) (No. 14 em materiais específicos e equipamentos) em cima do tecido para segurar o hipocampo desdobrado para a matriz. Coloque algumas gotas de solução para a câmara de registo para encher-lo, e abrir gradualmente a entrada e a saída para ajustar a taxa de fluxo de cerca de duas gotas por segundo na câmara de gotejamento IV. </li><li> Incubar o tecido na câmara de registo com ACSF normal durante cerca de 1 min para recuperar, depois mudar para o abastecimento da solução de 4-AP ACSF dissolvido e ajustar a taxa de fluxo adequada. Incubar o tecido em 4-AP dissolvido ACSF para cerca de 5 a 10 minutos e, em seguida, o investigador poderia iniciar o software para gravar o sinal de actividade espontânea quando aparece. </li></ol> 5. Retirar oTecido da PMEA Após uma experiência <ol><li> Controlar a âncora do tecido por um micromanipulador e gradualmente levantar o tecido a partir da câmara de gravação. Desligue ambos entrada e saída para interromper o fluxo na câmara de gravação. A câmara de gravação deve estar cheio com solução ou adicionar algumas gotas de solução para encher a câmara se a câmara de gravação não é completa. </li><li> Usar um pequeno pincel de pintura para levantar cada canto do tecido. Se o tecido não está a flutuar na solução, em seguida, utilizar o tubo de vácuo para secar a câmara de cuidado com o tecido ainda está sentado sobre a matriz. Em seguida, abra cuidadosamente a entrada para encher gradualmente a câmara e fechou a entrada para interromper o fluxo quando a câmara de gravação está cheia. Aplique o pincel pequeno para levantar cada canto do tecido novo. </li><li> Repetir o passo 5.2 até o tecido é separado da matriz e que flutua na solução. Se o tecido está flutuando na solução, em seguida, usar o tubo de vácuo para sugar o tecido de distância. Abrir tele fluir na entrada e abrir o vácuo na saída. Lavar o sistema com água destilada e seca-lo. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O desenvolvimento do hipocampo preparação desdobrada, em que os eixos longitudinais e transversais do hipocampo são preservadas em combinação com uma matriz de microeléctrodos penetrante, fornece uma ferramenta poderosa para investigar as ligações anatomia ou propagação neural no hipocampo 7. Este procedimento de desdobramento é também aplicável para estudar hipocampo em ratos adultos. Estudos recentes com esta preparação mostrou que a actividade epileptiforme induzido-4-AP poderia propagar com uma frente de ...

Compreendendo a condução neural ou propagação de sinais neurais é crucial para a determinação do mecanismo da comunicação neuronal, tanto no funcionamento normal e em condições patológicas do cérebro 1-3. O hipocampo é uma das estruturas mais estudadas no cérebro, uma vez que desempenha papel fundamental em diversas funções cerebrais como memória, e rastreamento espacial e está envolvido em várias alterações patológicas que afetam drasticamente o comportamento bem 1,6. Embora, o hipocampo exibe uma organização complexa, os diferentes elementos da sua estrutura pode ser facilmente identificado e consultados na preparação fatia 4-6. No sentido transversal do hipocampo, actividade neuronal é conhecida a propagar através da via de tri-sináptica que compreendem o giro dentado (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. Acredita-se que a transmissão sináptica e a condução axonal, desempenham um papel importante para comuniem neste circuito transversal 4,6. No entanto, a propagação do sinal neural ocorre em ambas direções transversal e longitudinal 4,6. Isto implica que o hipocampo não pode ser totalmente investigado usando preparações de fatias que limitam a observação de uma determinada direcção de propagação 4. A fatia longitudinal foi desenvolvido para investigar os caminhos axonal ao longo do eixo longitudinal 5. Pesquisadores observaram gama e teta oscilações específicas de comportamento predominantemente ao longo eixos transversal e longitudinal, respectivamente 6. Esses comportamentos foram estudados separadamente, mas o acesso simultâneo a ambos os sentidos é crucial para entender esses comportamentos. Mesmo com o desenvolvimento da preparação hipocampo intactos, é difícil controlar a propagação ao longo de todo o tecido devido à estrutura dobrada do hipocampo 4. O hipocampo desdobrado dá acesso aos neurônios embaladosem uma forma de uma camada de células de 7,8 bidimensional plana. Por desdobramento do giro dentado (DG) (Figura 1), o hipocampo adopta um formato achatado com uma configuração rectangular, em que ambos transversais e longitudinais permanecem intactos ligações com a camada de células piramidais dispostos numa chapa bidimensional contendo tanto CA3 e CA1, deixando uma peça plana de tecido neural que pode ser utilizado para investigar a propagação neural (Figura 2) 8. Actividade neural pode ser monitorada com pipetas individuais de vidro, matrizes microeléctrodos, eléctrodos estimulantes, bem como corantes sensíveis à voltagem (VSD) 3,7,8. Além disso, o indicador de tensão geneticamente codificado a partir de ratinhos transgénicos que pode ser usado para controlar o padrão de propagação 9. A configuração plana da rede do hipocampo desdobrada é bem adequado para a gravação óptica método mas também para uma matriz de microeléctrodos. Most das matrizes disponíveis no mercado são fabricados com eletrodos de perfil plano ou baixo e pode gravar a atividade neural em ambas as fatias de tecido e neurônios cultivados 10-12. No entanto, a relação sinal-para-ruído (SNR) decresce quando os sinais são obtidos a partir de um tecido intacta uma vez que a soma dos neurónios estão localizadas mais profundamente no tecido. Matrizes de eletrodos de microeletrodos com proporções elevadas são necessárias para melhorar o SNR. Para este efeito, uma matriz de microeléctrodos penetrante (PMEA), foi desenvolvido no nosso laboratório, e proporciona a capacidade para sondar directamente no tecido através da inserção de 64 pontos com um diâmetro de 20 mm e altura de 200 mm no hipocampo desdobradas 7,13 . Esta matriz de microeléctrodos tem SNR superior em comparação com o corante de imagem sensível à voltagem e o SNR permanece estável durante uma experiência 7,13. A combinação da preparação do hipocampo e desdobrada a PMEA proporciona uma nova maneira de investirIGATE a propagação neural ao longo de um plano bidimensional. Experimentos usando esta técnica já produziu resultados significativos sobre os mecanismos de propagação do sinal neural no hipocampo em que a atividade neural pode propagar de forma independente das sinapses sinápticas ou elétricos 7.

<table><tbody><tr><td>frasco dessecador</td><td>LABRECYCLERS Inc.</td><td>5410</td><td>Coloque toalhas de papel comuns no fundo do frasco para uso em anestesia animal.</td></tr><tr><td>Uma lâmina e um estágio cirúrgico feito pela Custome para desdobrar o hipocampo</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>Uma placa de Petri é colocada de cabeça para baixo (no centro) no gelo com um papel de filtro úmido colocado em cima dela.&nbsp;</td></tr><tr><td>Câmara de recuperação de tecidos feita sob medida</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Os tubos de plástico foram colados com malha plástica na parte inferior e borbulharam com 95% de O2/5% de CO2 no aCSF.</td></tr><tr><td>Operação Reta&nbsp; Tesoura</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17336B&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Medco Instruments No.:81995&nbsp;</td><td>Esta tesoura é usada para&nbsp; &nbsp; decapitar os ratos.</td></tr><tr><td>Integra Miltex Goldman-Fox&nbsp; Tesoura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-517&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MILTEX INC&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; No.:5-SC-320</td><td>Esta tesoura é usada para cortar o crânio dos ratos.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fórceps de Histerectomia Miltex </td><td>Claflin Equipamento médico</td><td>CESS-722033-00001</td><td>Este fórceps é usado para descascar o crânio cortado para expor o cérebro</td></tr><tr><td>Micro Espátula</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>Esta micro espátula é usada para transferir todo o cérebro de uma semiesfera para a câmara de reperfuração.&nbsp;</td></tr><tr><td>Espátula Semi-Micro de Aço Inoxidável Frey Scientific</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td>Esta espátula semi micro é usada para transferir o hipocampo desdobrado para a glicose aCSF na câmara de recuperação.</td></tr><tr><td>pincel pequeno</td><td>Lowe's</td><td>tem #:&nbsp; 105657&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Modelo #:&nbsp; 90219</td><td>Aquele com o menor tamanho em um pacote de pincel normal</td></tr><tr><td>Ferramenta de ajuda de vidro polido a fogo</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares.</td></tr><tr><td>Agulha de vidro feita sob medida</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares.</td></tr><tr><td>Ferramenta de vidro feita sob medida com um laço de fio de metal</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Esta ferramenta foi polida a fogo e feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares com um laço de fio de metal remodelado.</td></tr><tr><td>Conta-gotas de solução de vidro feito sob medida</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Esta ferramenta foi feita a partir das pipetas de vidro Pasteur regulares com suas pontas cortadas e uma cabeça de borracha anexada com a extremidade cortada.</td></tr><tr><td>Âncora de tecido personalizada</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>A Malha de fibra de nylon foi colada em um anel de fio de cobre isolado. A âncora de tecido foi segurada por um micromanipulador.</td></tr><tr><td>Matriz de microeletrodos fabricada sob medida</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mais detalhes sobre a matriz, consulte&nbsp; Kibler, et al, 2011.</td></tr><tr><td>Circuitos de filtro e amplificadores feitos sob medida para a matriz</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mais detalhes sobre a matriz, consulte&nbsp; Kibler, et al, 2011.</td></tr><tr><td>Processador de aquisição de dados 3400a</td><td>Microstar Laboratories</td><td>N/A</td><td>Este é um sistema completo de aquisição de dados com conversor A/D.</td></tr></tbody></table>

neural activity propagação em uma unfolded hippocampal preparação com um penetrante micro-eletrodo matriz

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

Este protocolo descreve um método para a preparação de uma nova preparação de hipocampo in vitro fixa combinada com uma rede de micro-maquinado para mapear a actividade neuronal no hipocampo. A preparação transversal fatia do hipocampo é a preparação do tecido mais comum para estudar hipocampo eletrofisiologia. Uma fatia de hipocampo longitudinal também foi desenvolvido a fim de investigar as ligações longitudinais no hipocampo. Os hipocampo do rato também intactos podem ser mantidas in vitro, porque a sua espessura permite a difusão de oxigénio adequado. No entanto, estas três preparações não fornecem acesso direto a propagação neural já que alguns dos tecidos está ausente ou dobrado. O hipocampo intacto desdobrado fornece tanto transversais e longitudinais conexões em uma configuração plana para acesso direto ao tecido para analisar toda a extensão da propagação do sinal no hipocampo in vitro. A fim de controlar eficazmente a atividade neural de tele camada de células, um feito penetrar rede de micro-eléctrodo (PMEA) foi fabricado e aplicado ao hipocampo desdobrado. O PMEA com 64 eletrodos de 200 mm de altura poderia gravar a atividade neural profundo dentro do hipocampo do rato. A combinação única de uma preparação do hipocampo e desdobrada a PMEA fornece uma nova ferramenta in vitro para estudar a velocidade e direcção de propagação da actividade neural nas regiões bidimensionais CA1-CA3 do hipocampo, com uma alta relação sinal-ruído.

Os dados mostrados nas figuras aqui foram registados na preparação hipocampo desdobrado com 4-AP (100 uM) aCSF adicionado durante a incubação do tecido na câmara de gravação à TA (25 ° C). Normalmente atividade começa dentro de 5 min, mas em alguns tecidos do hipocampo dos animais mais velhos pode demorar mais tempo. O disparo neuronal induzida por AP-4 observado com o PMEA é o mesmo que anteriormente relatado 14,15. Uma vez que os eléctrodos têm uma altura de 200 mm, as pontas dos eléctrodos estão localizado...

Nós desenvolvemos uma hipocampo in vitro desdobrada que preserva CA1-CA3 matriz de neurónios. Combinada com a rede de micro-eléctrodo penetrante, actividade neuronal pode ser monitorizada em ambas as orientações longitudinais e transversais. Este método oferece vantagens em relação a preparações de fatias do hipocampo como a propagação em todo o hipocampo podem ser gravados simultaneamente.

Neural Activity Propagação em uma Unfolded Hippocampal Preparação com um penetrante Micro-eletrodo Matriz

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

O objetivo geral deste procedimento é introduzir o processo de desdobramento do hipocampo de roedores e colocar a preparação de tecido plano no conjunto de microeletrodos penetrantes. Para gravação. Isso é feito isolando primeiro o hipocampo de um camundongo da metade de seu cérebro.O segundo passo é desdobrar a estrutura curva do hipocampo com ferramentas personalizadas. Em seguida, o hipocampo desdobrado é transferido para a câmara de gravação e colocado na matriz de gravação. A etapa final é remover o hipocampo desdobrado da matriz após o experimento.Em última análise, o método de mapeamento de normalização individual é usado na análise de dados para mostrar a propagação da atividade neural registrada pelo conjunto de microeletrodos penetrantes. Bem, a principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite registrar a atividade neural em duas direções: transversal e longitudinal. Para ver a propagação real da atividade neural, você precisa de um hipocampo intacto, desenrolar os potes de amassados e deitar em uma câmara de gravação, e a propagação ocorrerá nas direções transversal e longitudinal.E fomos capazes de descobrir a velocidade de propagação do tecido. Estávamos com a atividade nas duas direções e pudemos estudar os mecanismos de propagação, em particular, os mecanismos não sinápticos. Fomos capazes de ver a atividade se propagando com essa transmissão sináptica com essas junções comunicantes e, por causa da velocidade, sabemos que não é difusão.Então, agora estamos tentando descobrir os mecanismos reais dessa propagação. Geralmente, os indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades devido aos procedimentos desafiadores de desdobrar o hipocampo e colocar a preparação de tecido plano neste micro feixe de eletrodos penetrantes sem danificar o tecido ou a matriz. Para iniciar este procedimento, coloque a cabeça do rato em sacarose oxigenada gelada.Um LCR usa uma tesoura fina para remover a pele do crânio. Em seguida, corte o crânio ao longo da linha média e as duas extremidades próximas ao lobo temporal. Em seguida, descasque o crânio cortado para os lados da cabeça.Para expor o cérebro, remova cuidadosamente o cérebro do crânio com a espátula. Depois disso, coloque o cérebro em um estágio cirúrgico gelado coberto com papel de filtro úmido. Remova o cerebelo com uma lâmina gelada.Posteriormente, separe os dois hemisférios cortando a linha média do cérebro. Em seguida, coloque os dois hemisférios separados em um copo cheio de sacarose gelada. Um LCR borbulhou com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono.Transfira um hemisfério para o estágio gelado coberto com papel de filtro. Coloque toalhas de papel comuns ou papéis de filtro ao redor do cérebro para absorver a solução extra. Depois, use duas pipetas de vidro polido para separar o córtex da parte central do cérebro, a fim de expor o hipocampo.Em seguida, aplique duas a três gotas de suse A CSF gelado no tecido e remova a solução extra. Corte as conexões com o córtex nas duas extremidades do hipocampo. Em seguida, disseque o hipocampo para fora do cérebro com as ferramentas de vidro polido a fogo.Em seguida, separe todo o hipocampo com o lado voltado para cima e o sulco do hipocampo voltado para baixo Aplique rapidamente duas a três gotas de LCR gelado no tecido novamente e remova a solução extra ao redor dele. Em seguida, use a ferramenta de vidro polido a fogo para virar todo o hipocampo. Para expor o sulco, use uma lâmina gelada para aparar as extremidades septal e temporal do hipocampo.Se necessário, insira uma agulha de vidro personalizada no sulco e corte a trilha de fibra de DG a cerca de três. Em seguida, use um laço de arame de metal para puxar o DG e desdobrar o hipocampo. Todo o processo de cirurgia geralmente dura cerca de dois minutos.Aplique mais duas a três gotas de sacarose A CSF gelada no tecido e remova a solução extra ao redor dele. Em seguida, apare as bordas do hipocampo desdobrado com uma lâmina gelada. Transfira a preparação para a câmara de recuperação cheia de LCR A normal e borbulhada com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono em temperatura ambiente por uma hora antes de transferi-la para a câmara de registro.Neste procedimento, encha um frasco com um LCR normal e outro frasco com quatro bolhas AP A CSF. As soluções com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono desde o início dos experimentos. Use um conector trivalve para controlar qual solução será selecionada durante um experimento.Em seguida, conecte um tubo de vácuo à saída da câmara. Para remover a solução em um recipiente de pó, aqueça a tubulação antes de entregar a solução na câmara de registro e mantenha-a a uma temperatura controlada de 35 graus Celsius. Depois de fechar a entrada e a saída da câmara de gravação, use um conta-gotas de pipeta de vidro personalizado para transferir o hipocampo desdobrado para a câmara de gravação.Sob a posição do microscópio, o hipocampo desdobrado, com o lado alvia voltado para baixo, ca uma área de três apontando para longe e ca um campo apontando para o pesquisador, aspire cuidadosamente a solução na câmara usando uma pipeta a vácuo da borda da câmara de registro até que a câmara esteja seca e o tecido fique na matriz. Em seguida, coloque cuidadosamente uma âncora de tecido personalizada em cima do tecido para segurar o hipocampo desdobrado na matriz. Reabasteça a câmara de gravação com algumas gotas de solução.Abra gradualmente a entrada e a saída para ajustar a taxa de fluxo para cerca de duas gotas por segundo na câmara de disparo IV. Incubar o tecido na câmara de registo com LCR A normal durante cerca de um minuto. Em seguida, troque as soluções.Aplique a quatro AP dissolvido A CSF e ajuste a taxa de fluxo corretamente. Incube o tecido em quatro AP dissolvido A CSF por cerca de cinco a 10 minutos antes da gravação. Para remover o tecido do PMEA, controle a âncora de tecido por um micromanipulador e levante gradualmente a âncora da câmara de registro.Desligue a entrada e a saída para interromper o fluxo. Na câmara de gravação, use um pincel pequeno para levantar o canto do lenço de papel. Se o tecido não estiver flutuando na solução, use o tubo de vácuo para secar a câmara cuidadosamente com o tecido ainda sentado na matriz.Em seguida, abra cuidadosamente a entrada para reabastecer gradualmente a câmara e desligue a entrada para interromper o fluxo. Quando a câmara de gravação estiver cheia, use o pincel pequeno para levantar o canto do lenço de papel. Outra vez. Se o tecido estiver flutuando na solução, use o tubo de vácuo para sugar o tecido.Abra o fluxo na entrada e o vácuo na saída. Lave o sistema com água destilada e seque-o. Este é um exemplo da atividade espontânea induzida por 100 micromolares quatro AP A CSF registrados a partir de um dos microeletrodos localizados na região dendrítica basal com uma relação sinal-ruído de 34,9 decibéis.E aqui estão as atividades ampliadas no retângulo vermelho. Estes são os dados brutos de outro microeletrodo localizado mais próximo do somata com uma relação sinal-ruído de 27,2 decibéis mostrada. Aqui está outro exemplo de gravação obtida a partir de um eletrodo posicionado dentro da camada somática.Neste exemplo, a relação sinal-ruído é de 18,53 decibéis, e aqui está o ruído de linha de base registrado de um microeletrodo. A linha de base geralmente tem um valor pico a pico de 150 a 200 microvolts, e a impedância de um único eletrodo é de cerca de um a dois mega ohms. Este vídeo mostra a propagação neural gravada com a matriz e depois processada usando o método de normalização individual.Na análise de dados, toda a propagação por todo o tecido dura cerca de 100 milissegundos Após este procedimento. Outros métodos, como neuroimagem no desdobrado, hipocampo in vitu também podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o movimento de focos neurológicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desdobrar o hipocampo no local, a preparação do tecido plano na matriz de micro palestras.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Este vídeo demonstra o procedimento para configurar uma câmara de gravação com um conjunto de microeletrodos penetrantes (PMEA) para capturar sinais neurais de um hipocampo desdobrado. Este método nos permite estudar a velocidade e a direção da propagação da atividade neural dentro do hipocampo desdobrado in vitro.

Registro da atividade neural do tecido hipocampal desdobrado usando matriz de microeletrodos penetrantes

Este protocolo envolve o uso de um conjunto de microeletrodos (MEA) para registrar a atividade elétrica em uma fatia do cérebro exposta a uma droga indutora de convulsões. O procedimento inclui posicionar a fatia do cérebro em uma câmara de gravação MEA, aplicar estimulação elétrica para induzir convulsões artificiais e analisar os sinais resultantes.

Monitoramento da atividade elétrica neural induzida por convulsões em fatias cerebrais usando matrizes de microeletrodos

Este vídeo demonstra o procedimento para configurar uma fatia de cérebro em uma câmara de submersão para registrar a atividade sináptica. O processo envolve prender a fatia no papel da lente, manter um fluxo contínuo de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) para garantir a viabilidade neuronal e posicionar com precisão os eletrodos de estimulação e registro em relação a uma região específica do cérebro de interesse. Essa configuração permite o monitoramento preciso da atividade sináptica...

Registro de potenciais pós-sinápticos excitatórios do campo neuronal em fatias agudas do hipocampo

Este vídeo demonstra a implantação estereotáxica de um feixe de eletrodos de fio e uma fibra óptica no hipocampo de um modelo de camundongo.

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