Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

O objetivo geral deste procedimento é medir a capacidade de resposta ao frio de camundongos. Isso é feito primeiro resfriando ou aquecendo o vidro até a temperatura desejada. O segundo passo é aclimatar os ratos até que estejam em repouso.

O terceiro passo é comprimir o pó de gelo seco em um pellet em uma seringa. A etapa final é testar os camundongos usando o pellet de gelo seco e um cronômetro para medir a latência de retirada. Em última análise, o ensaio do plantador a frio é usado para medir a capacidade de resposta e adaptação ao frio em camundongos que se comportam livremente.

A principal vantagem do nosso ensaio sobre os ensaios atualmente existentes, como o teste de acetona e o teste de placa fria, é que podemos testar tanto a hipersensibilidade quanto a analgesia na linha de base sob uma variedade de circunstâncias ambientais. Embora esse método possa fornecer informações sobre a capacidade de resposta ao frio dos camundongos. Também pode ser usado em outros sistemas, como o macaco, o rato e os humanos Demonstrando o procedimento estará Daniel Brenner, um estudante de pós-graduação em meu laboratório.

Depois de limpar a superfície do vidro, prenda a sonda termopar de filamento tipo T na superfície no meio da placa de vidro com fita adesiva de laboratório. Coloque os recintos dos animais na placa de vidro em uma única linha ao longo do meio. Em seguida, passe a sonda do termopar pelo compartimento central do animal e conecte-a ao registrador de dados.

Ligue o registrador de dados e desative o recurso de desligamento automático. Conecte o registrador de dados ao computador com o cabo fornecido. Separe os recintos dos animais com inserções pretas para evitar interações visuais entre os camundongos e posicione os espelhos embaixo do vidro para permitir a visualização da parte inferior dos recintos.

Para começar o teste, coloque caixas de alumínio na placa de vidro de cada lado do animal, com os recintos a uma distância fixa. Se testar a 30 graus Celsius, conecte circuladores de água aquecida às caixas de alumínio colocadas a 0,25 polegadas de distância do recinto dos animais. Encha as caixas com água até a metade enquanto os orifícios de drenagem estão tampados.

Posicione os circuladores de forma que a água quente das caixas de alumínio seja drenada diretamente de volta para o reservatório do circulador de cada lado. Você precisará adicionar água a cada circulador. Assim que as caixas de metal estiverem cheias, ajuste os circuladores para 45 a 60 graus Celsius e encha as caixas de alumínio com um fluxo constante de água quente.

Quando os óculos atingirem a faixa de temperatura desejada, coloque os mouses nos gabinetes da placa. Deixe os ratos se aclimatarem ao aparelho e à temperatura. Esses camundongos se aclimatam por 2,5 horas.

Ao se aproximar do final do período de aclimatação, encha um balde de gelo até a metade e use um martelo ou martelo para esmagar o gelo seco em pó. Faça isso fora da sala comportamental para evitar perturbar os ratos. Em seguida, use uma lâmina de barbear ou tesoura para cortar a parte superior de uma seringa de três mililitros.

Em seguida, use uma agulha de calibre 21 para fazer dois conjuntos de três orifícios em lados opostos da seringa para diminuir a pressão gerada pela sublimação enquanto comprime o gelo seco de volta à sala comportamental, encha a câmara da seringa até a metade com pó de gelo seco. Segure a extremidade cortada da seringa contra um objeto plano e comprima firmemente o pó usando o êmbolo. Estenda a ponta da paleta de gelo seco comprimido além da borda da seringa.

Agora, teste os ratos que têm as quatro patas no vidro e não estão se movendo, mas não totalmente adormecidos. Usando os espelhos para mirar suavemente, mas com firmeza, pressione o pellet plano contra a superfície de vidro sob a pata traseira do rato. Simultaneamente, pressione iniciar em um cronômetro.

Quando o mouse se afastar do vidro resfriado, vertical ou horizontalmente, pare o cronômetro e remova a pelota de gelo seco. No entanto, se o mouse mover a pata muito brevemente e depois retorná-la à superfície de resfriamento, continue cronometrando e estimulando até que o mouse se afaste permanentemente. Se o mouse não se afastar do vidro resfriado, pare o estímulo após 20 segundos.

Repita este procedimento de teste até que pelo menos três valores em cada pata do animal sejam coletados para testar camundongos a 17 graus Celsius. Repita o experimento como acabamos de mostrar, mas em vez de encher as caixas de alumínio com água aquecida, use gelo úmido e posicione as caixas a aproximadamente 0,25 polegadas de distância dos gabinetes para testar os ratos. A 12 graus Celsius, é usado gelo seco, mas as caixas são colocadas a 1,25 polegadas de distância dos recintos.

Este protocolo alternativo testa os camundongos à medida que a temperatura da placa está diminuindo, e não depois de estabilizada. Isso nos permite testar a adaptação dos mouses à medida que está acontecendo Depois de configurar o aparelho. Como antes, execute o experimento conforme descrito anteriormente para fazer medições à temperatura ambiente.

Uma vez que as latências da linha de base tenham sido medidas à temperatura ambiente. Usando o procedimento mostrado anteriormente, encha as caixas de alumínio vazias com gelo seco e coloque-as a 1.25 polegadas dos gabinetes de cada lado. Por fim, repita o experimento para fazer medições de latência à medida que a placa de vidro esfria.

Fazendo medições com a maior freqüência possível. Este gráfico mostra a latência média de retirada para camundongos a partir de 12 graus Celsius, 17 graus Celsius, 23 graus Celsius ou 30 graus Celsius. As latências de retirada são consistentes em todas as temperaturas.

Os efeitos analgésicos podem ser medidos usando o ensaio de plantador a frio, conforme mostrado aqui. A injeção subcutânea de 1,5 miligramas por quilograma de morfina aumenta a latência de retirada de camundongos 30 minutos após a injeção, medida por um teste post-hoc de innova bidirecional com Bonferroni 60 minutos após a injeção. Não há diferença significativa entre morfina injetada e solução salina injetada.

A hipersensibilidade dos camundongos também pode ser medida aqui. A injeção intra-plantadeira de 10 microlitros de adjuvante fros completo diminui significativamente a latência de retirada de camundongos duas e três horas após a injeção, medida por uma innova bidirecional com teste post-hoc de bonferroni. Os mesmos camundongos receberam injeções subcutâneas de morfina em quatro horas e todas as latências de retirada em 4,5 horas foram significativamente maiores em comparação com três horas, conforme medido por um innova unidirecional com teste post hoc feito.

Uma vez que a morfina foi metabolizada 5,5 horas após a injeção, os camundongos que foram injetados com CFA ainda apresentaram latências de abstinência mais baixas do que os camundongos injetados com solução salina, conforme medido por um inova bidirecional com teste post-hoc de Bonferroni. A adaptação às mudanças ambientais de resfriamento pode ser medida em tempo real com este ensaio. Os camundongos do tipo selvagem têm a mesma latência de retirada que a placa de vidro esfria, sugerindo que eles se adaptam às temperaturas de resfriamento mais rapidamente do que pode ser medido com o CPA, que não teve diferenças significativas entre nenhum grupo.

No entanto, quando os camundongos foram injetados com U 7 3 1 2 2 para bloquear a hidrólise do PIP dois, sua latência diminui à medida que a placa da temperatura diminui, sugerindo adaptação prejudicada Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas, incluindo o tempo de aclimatação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a sensação de frio e a adaptação em camundongos acordados com comportamento livre. Não se esqueça de que trabalhar com gelo seco pode ser excepcionalmente perigoso e que você precisa garantir a ventilação adequada e a liberação de ar durante esse método.