Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução In Situ Hibridização

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar mRNAs localizados acidentalmente em amostras de cérebro adulto. Isso é conseguido por pré-tratamento. As amostras por ebulição e digestão de protease para desmascarar as moléculas de mRNA como uma segunda etapa A hibridização é realizada, seguida pelas etapas de amplificação e detecção, que permitem a visualização do mRNA de interesse.

Em seguida, os axônios são corados com anticorpos ou corantes para verificar se o mRNA de interesse está localizado nos axônios. Os resultados mostram a presença de um mRNA de TF quatro em amostras de cérebro usando diferentes procedimentos de desmascaramento e contadores, métodos de coloração baseados em análises de microscopia. Este método pode ajudar a responder a perguntas em neurociência, como quais mRNAs são localizados e traduzidos sem éxons.

Embora este método possa fornecer informações sobre a síntese de proteínas intracon, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como dendritos e células e tecidos não neuronais nos quais ocorre a localização do mRNA. Após a fixação das fatias de cérebro, de acordo com as instruções do protocolo escrito, prepare um frasco de copin contendo 60 mililitros de solução de recuperação de antígeno e mergulhe as lâminas na solução. Em seguida, encha um copo de um litro com água destilada e coloque-o no micro-ondas para amortecer o calor.

Ao desmascarar, coloque o frasco de coplan contendo as lâminas e a solução de recuperação no micro-ondas. Ferva as lâminas em alta potência por cinco minutos. Imediatamente após a solução parar de ferver, aqueça as lâminas novamente em alta potência por mais cinco minutos.

Deixe as lâminas esfriarem em temperatura ambiente Após o resfriamento, mergulhe as lâminas em um prato contendo PBS para lavá-las e repita a lavagem mais duas vezes Após a lavagem, coloque as lâminas em uma superfície plana e adicione duas a três gotas ou 100 microlitros de DAP B.Probe a duas ou três seções cerebrais como controle. Para avaliar a coloração de fundo, adicione duas a três gotas da sonda de direcionamento às seções experimentais Para detectar o RNA de interesse, uma sonda direcionada aos resíduos 20 a 1381 de camundongo a TF quatro RNA é usada aqui. Use uma pinça para colocar o parâmetro sobre as lâminas para evitar a evaporação da sonda.

Em seguida, coloque as lâminas na caixa de lâminas umidificada dentro do forno de hibridização e incube-as a 40 graus Celsius por duas horas. Decorrido o tempo de incubação, lave as lâminas em um prato com um tampão de lavagem por dois minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione duas a três gotas de reagente de amplificação por MP um fl a cada fatia de cérebro.

Em seguida, cubra com filme paralímpico fresco, coloque na caixa de lâminas e incube a 40 graus Celsius por 15 minutos no forno de hibridização. Depois de lavar as lâminas como antes, adicione duas a três gotas de reagente de amplificação A MP quatro fl a cada fatia de cérebro e cubra com perfil. Incube as lâminas na caixa de lâminas a 40 graus Celsius por 15 minutos no forno de hibridização.

Lave as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem por dois minutos cada em temperatura ambiente. Como antes, após a última lavagem, cubra cada fatia com 100 a 200 microlitros de solução de bloqueio contendo três miligramas por mililitro BSA, 100 milimolares de glicina e 0,25% Triton X 100 em PBS, cubra cada lâmina com paraforma e incube por 30 minutos Em temperatura ambiente após a incubação, adicione 100 a 200 microlitros de anticorpo diluído em solução de bloqueio às lâminas. Um anticorpo anticolina acetil transferase é usado aqui depois de cobrir as lâminas com perfil incubado por dois dias a quatro graus Celsius.

Certifique-se de que as fatias do cérebro não sequem, se necessário, reaplique a solução de anticorpo anti CHATT nas fatias do cérebro 24 horas após a incubação. Depois de lavar as lâminas três vezes em um XPBS por cinco minutos. À temperatura ambiente, adicione 100 a 200 microlitros do anticorpo secundário conjugado Alexa apropriado às lâminas.

Cubra com param e incube por uma hora em temperatura ambiente, protegido da luz após a hora. Lave as lâminas três vezes em um XPBS por cinco minutos cada, como antes, e depois lave uma vez com água destilada. Monte as lâminas com meio de montagem contendo DPI e, em seguida, visualize as fatias do cérebro sob o microscópio de fluorescência.

Depois de preparar amostras formais e fixas de cérebro humano embebido em parafina, de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo, execute o desmascaramento do antígeno induzido pelo calor imergindo as lâminas em duas soluções quentes de pré-tratamento e fervendo por 15 minutos. Depois de lavar três a cinco vezes em água destilada e três a cinco vezes em etanol fresco a 100%, deixe as lâminas secarem por cinco minutos em temperatura ambiente para realizar o desmascaramento do antígeno induzido por protease. Adicione quatro gotas de pré-tratamento três cubra com perfil e incube por 30 minutos a 40 graus Celsius no forno de hibridização Após lavar três a cinco vezes em água destilada.

Como antes, adicione quatro gotas do conjunto de sondas DAP B para controlar fatias de cérebro para avaliar a coloração de fundo e quatro gotas do conjunto de sondas de direcionamento para as seções experimentais. Coloque o par de lâminas cobertas de filme na caixa de lâminas e incube por duas horas a 40 graus Celsius no forno de hibridização. Depois de seguir as etapas do protocolo escrito para desenvolver o sinal DAB para o mRNA de interesse, verifique a presença de um sinal em um microscópio de campo claro.

Defina áreas de referência nas amostras cerebrais para monitorar a presença de pontos durante todo o procedimento de contracoloração. Para combater manchas. Primeiro coloque as lâminas em azul rápido luxal pré-aquecido a 60 graus Celsius e incube por 30 minutos a 60 graus Celsius.

Após a incubação, enxágue as lâminas várias vezes em água destilada e, em seguida, mergulhe as lâminas em solução de carbonato de lítio a 0,05% várias vezes para iniciar a diferenciação. Em seguida, mergulhe as lâminas duas vezes em etanol fresco a 75% e enxágue em água destilada. Verifique as fatias do cérebro sob um microscópio de campo brilhante.

Observe que a substância cinzenta e branca devem começar a ser distinguíveis e os grânulos de RNA ainda visíveis como puncta preto azul escuro. Verifique se os axônios começam a aparecer como fibras azuis claras, repita o procedimento de coloração azul luxal, incubando com azul luxal em etapas de 10 a 20 minutos e monitorando cuidadosamente a contra-coloração e a presença de grânulos de RNA quando a coloração ideal for alcançada. Coloque as lâminas de enxágue em solução violeta crestal e incube por 10 minutos após a incubação.

Enxágue as lâminas em água destilada. Mergulhe as lâminas em etanol a 70% de cinco a 10 vezes e, em seguida, desidrate através de três trocas rápidas de etanol a 100% em uma capela de exaustão. Limpe as fatias do cérebro incubando duas vezes em xileno.

Agente de compensação alternativo por dois minutos e uma terceira vez por cinco minutos. À temperatura ambiente, monte as fatias de cérebro em meio de montagem permanente à base de xileno e analise sob um microscópio de campo claro. O peixe foi realizado usando desmascaramento induzido por protease seguido pela detecção de anticorpos da colina acetiltransferase mostrada em vermelho.

O anticorpo não reconheceu o chat quando o tratamento com protease foi realizado. São mostrados exemplos de resultados obtidos com uma sonda não-alvo e uma sonda de mira TF quatro usando as mesmas configurações de microscópio e ajustes de imagem. ATF verde quatro grânulos positivos com localização axonal incerta são indicados com pontos de interrogação.

As áreas azuis são núcleos corados quando o peixe foi realizado usando antígeno induzido pelo calor. A coloração imunofluorescente de desmascaramento novamente mostrada em vermelho foi bem-sucedida. Um TF quatro grânulos positivos localizados nos axônios aparecem laranja e são marcados como ok após os axônios ish foram contra-corados com luxal.

O azul rápido e o SOTA neuronal foram contra-corados com luxal subótimo violeta crestal. Pode ocorrer coloração azul rápida se a temperatura diminuir. Aqui, as amostras foram coradas com azul rápido luxal a 40 graus Celsius por quatro horas.

Um TF quatro grânulos positivos com localização acidental pouco clara são indicados com pontos de interrogação. A coloração abaixo do ideal também ocorre quando a intensidade da contra-coloração não é verificada após curtos períodos de incubação, como visto aqui. Exemplos de coloração LFB ideal combinada com ish usando uma sonda não-alvo ou uma sonda de direcionamento TF quatro são mostrados aqui.

A aquisição de imagens foi ajustada automaticamente para a melhor relação sinal-ruído. Axônio localizado um TF quatro grânulos são marcados como ok. Uma vez dominado.

Esta técnica pode ser feita em um a três dias, dependendo do método de contracoloração escolhido após o seu desenvolvimento. Essa técnica abre caminho para os neurocientistas explorarem a tradução e localização do mRNA em nuances.