Name: Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução In Situ Hibridização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a detectar mRNAs localizados em axônios em amostras de cérebro de camundongos e humanos usando hibridização in situ de alta resolução combinada com imunohistoquímica. Este método permite visualizar a distribuição espacial de mRNAs em tecidos neurais.

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Este trabalho foi apoiado pela Alzheimer's Association (NIRG-10-171721; para U.H.), Instituto Nacional de Saúde Mental (MH096702; para U.H.), Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NS081333; para C.M.T.), e prêmios de estudo piloto do Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer financiado pelo Instituto Nacional de Envelhecimento da Universidade de Columbia (AG008702; para J.B. e Y.Y.J.), que também apóia o Banco de Cérebros de Nova York. Agradecemos aos membros do laboratório Hengst pelos comentários e discussões

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo IACUC da Universidade de Columbia e orientações aplicáveis ​​para o cuidado e uso de animais de laboratório foram seguidas. Nota: Prepare todos os buffers utilizados para os procedimentos ISH em água RNase ou tratada com DEPC. Esta recomendação não é estritamente necessário após ISH foi concluída, mas sugere-se que buffers ainda são preparadas com água bidestilada autoclavado e / ou esterilizado por filtragem. 1. Detecção de ATF4 mRNA localizada Cholinergic axônios no Adulto do rato do cérebro usando fluorescência Hibridização In Situ (FISH) Seguido por imuno-histoquímica <ol><li> Preparação de amostras para fatias de cérebro congeladas fixo-paraformaldeído <ol><li> Por exemplo a seguir, preparar fatias de cérebros de camundongos congelados fixos. <ol><li> Resumidamente, sacrificar ratos nove meses de idade, pela anestesia com cetamina (100 mg kg -1 de peso corporal) e xilazina (10 mg kg -1 weig corpoHT) seguido por infusão transcardial de 4% de paraformaldeído em PBS (pH 7,4). </li><li> Remover cérebros e pós-correção em paraformaldeído a 4% durante 24 horas a 4 o C. </li><li> Após a fixação, lavar as amostras três vezes em PBS e cryoprotect em 30% de sacarose em PBS (pH 7,4) durante 24 horas a 4 o C. </li><li> Cérebros Incorporar em outubro congelamento composto, em série na seção de 20 um em um criostato e montar em poli-D-lisina tratados lâminas de microscópio. Mantenha fatias do cérebro a -20 ° C até o uso. </li></ol></li><li> Remover fatias do cérebro fixadas com paraformaldeído a partir do congelador e secar ao ar durante 30 min à TA. </li><li> Lavar três vezes com PBS 1x. </li><li> Numa hotte, re-fixar fatias do cérebro do 20 min com 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente. NOTA: CUIDADO: 4% de paraformaldeído é tóxico e devem ser manuseados e descartados apropriadamente seguindo os protocolos de segurança. </li><li> Lavar três vezes com PBS 1x. </li><li> Desidratar fatias de cérebro. <ol><li> Prepare a 50%, 75% e 100%soluções de etanol. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 50% durante 5 min à TA. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 75% durante 5 min à TA. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 100% durante 5 min à TA. </li><li> Imergir as lâminas em fresco etanol a 100% durante 5 min à TA. Nota: Em alternativa, as lâminas podem ser armazenadas em etanol a 100% a -20 ° C até 1 mês. </li></ol></li></ol></li><li> Teste FISH seguido de imunohistoquímica usando induzida pelo calor antígeno / desmascaramento RNA <ol><li> Antes de começar preparar todo o material necessário: <ol><li> Aqueça o forno de hibridação a 40 ° C e colocar num tabuleiro contendo água destilada no forno para criar um ambiente humidificado. </li><li> Pegue uma caixa de slides e colocar toalhas de papel embebido em água destilada para dentro para umidificar a caixa de slide. Coloque a caixa de slides no forno de hibridização. </li><li> Remover as sondas (ambos sondas negativos e de destino) de geladeira e aqueça-os no forno de hibridação para 10 min. Deixe esfriar as sondas down à temperatura ambiente. </li><li> Equilibrar reagentes de amplificação AMP 1-4 (incluídos no kit de reagentes multiplex fluorescente) à TA. </li><li> Preparar a solução de recuperação de antigénio de: citrato de sódio 10 mM (pH 6), 0,05% de Tween 20. Nota: A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente indefinidamente e ser utilizado para a coloração futuro. </li><li> Preparar o tampão de lavagem 1x diluição da solução estoque 50x (incluídos no kit de reagentes multiplex fluorescente) em água isenta de RNase ou tratada com DEPC. NOTA: 1x tampão de lavagem pode ser armazenado à temperatura ambiente durante 1 mês e ser utilizado para a coloração futuro. Tampão de lavagem 50x pode precipitar. Se assim for, o calor 50x tampão de lavagem a 40 ° C durante 10 min antes da preparação da solução 1x. </li></ol></li><li> Retirar as lâminas a partir de etanol a 100% e ar seco, durante 5 min à TA. </li><li> Prepare um frasco coplin contendo 50 ml de solução de recuperação antigênica. Imergir as lâminas em solução de recuperação antigênica e ferva-os durante 10 minutos em um forno de microondas. NOTA: Como alternativa lugar desliza horizontalmente em um 100 milímetrosdiâmetro prato de vidro redondo contendo 100 ml de solução de recuperação. <ol><li> Encha um copo de 1 L com água destilada e colocá-lo no microondas. NOTA: A água vai &quot;tampão&quot; o calor quando se realiza desmascaramento. </li><li> Colocar as lâminas em solução de recuperação antigênica dentro do microondas. Ferva desliza em potência alta por 5 min. Imediatamente após amostras pararam de ebulição, calor desliza novamente em alta potência para extra de 5 min. </li><li> Esfriar lâminas à temperatura ambiente. NOTA: passo crítico: ebulição duração e procedimento deve ser determinada pelo utilizador, dependendo das características de micro-ondas. Quanto mais rápido a ebulição começa maiores as chances de solução de evaporação. Neste caso recomenda-se que as amostras são fervidas durante períodos de tempo mais curtos do que mais duas vezes para completar um tempo de desmascaramento total de 10 min. Pelo contrário, se o aquecimento realizado a potência média ou baixa, desmascaramento pode ser realizada uma vez durante 10 min. No entanto, se as amostras não ferver continuously para um total de cerca de 10 min, isto pode resultar em desmascaramento parcial de ambos os ARN alvo e proteína a ser detectada. </li></ol></li><li> Lave as lâminas três vezes com PBS 1x. </li><li> Adicionar 2-3 gotas (~ 100? L) de sonda dapB definida como aquelas fatias do cérebro utilizadas para avaliar a coloração de fundo. Nota: O conjunto de sonda dapB tem como alvo um gene bacteriano e não deve reconhecer qualquer RNA mamíferos. </li><li> Adicionar 2-3 gotas de direccionamento a sonda definida como aquelas fatias do cérebro utilizadas para detectar o ARN de interesse. Nota: um conjunto de sondas alvo resíduos de 20 - 1381 do rato ATF4 ARNm é utilizado neste exemplo. </li><li> Lâminas de cobertura com parafilme para evitar a evaporação da sonda, colocá-los na caixa de slides umidificado dentro do forno de hibridação e incubar-los a 40 o C durante 2 horas. NOTA: OPCIONAL: fatias de cérebro adicionais podem ser hibridados com um conjunto sonda segmentação do mouse Polr2A e utilizados como controlos positivos. </li><li> Wash SLIdes duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 1-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 2-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação de AMP 3-FL a cada fatia de cérebro, cobrir as lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2-3 gotas de reagente de amplificação AMP 4-FL para cada fatia do cérebro, cobrir slides com parafilme, colocá-los noCaixa de lâminas e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente e duas vezes com PBS 1x. </li><li> Adicionar 100-200 ul (ou volume suficiente para cobrir completamente as fatias) de uma solução de bloqueio contendo 3 mg / ml de BSA, 100 mM de glicina e 0,25% de Triton X-100 em PBS (pH 7,4) às lâminas, cobri-los com parafilme e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 100-200 ul de anticorpo anti-ChAT em ​​solução diluída (1/100) para as lâminas de bloqueio, cobri-los com parafilme e incubar durante 2 dias a 4 o C. Certifique-se de que fatias de cérebro não sequem. Se necessário, re-aplique a solução de anticorpo anti-chat para fatias de cérebro de 24 horas após a incubação. </li><li> Lave as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicione 100-200 ul do anticorpo secundário Alexa conjugado apropriado (. Por exemplo, Alexa-594 burro anti-cabra para este exemplo particular) para os slides, cubra com filme plástico e incubcomeu durante 1 h à TA. </li><li> Lave as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavagem das lâminas uma vez com água destilada. </li><li> Mount slides com meio de montagem contendo DAPI. </li><li> Visualize fatias de cérebro sob um microscópio de fluorescência. </li></ol></li></ol> 2. Detecção de ATF4 mRNA localizado para axônios em amostras de cérebro usando Chromogenic Hibridização In Situ (CISH) Seguido por Luxol rápido azul e violeta Cresyl contracoloração <ol><li> A preparação da amostra para amostras de cérebros humanos embebidos em parafina e fixados em formalina <ol><li> Fatias Asse em forno seco a 60 ° C durante 1 hora. </li><li> Desparafinar fatias de cérebro em um exaustor. NOTA: CUIDADO: Os reagentes são tóxicos e deve ser manuseado e descartado seguindo as diretrizes de segurança apropriadas <ol><li> Imergir as lâminas em xileno agente de compensação alternativa duas vezes durante 10 minutos. </li><li> Imergir as lâminas em etanol a 100%, duas vezes durante 1 min. </li><li> UMAIR-seco fatias 5 min à TA. NOTA: Como alternativa amostras pode ser seco a temperatura ambiente O / N, mas deve ser utilizada dentro de 24 horas. </li></ol></li></ol></li><li> Diaminobenzidina (DAB) à base de ensaio ISH cromogï¿½ico seguido por Luxol rápido mancha azul violeta e cresyl usando induzida protease-induzida pelo calor e RNA desmascaramento <ol><li> Antes de começar preparar os materiais necessários: <ol><li> Aqueça o forno de hibridação a 40 ° C e colocar num tabuleiro contendo água destilada para criar um ambiente humidificado. </li><li> Pegue uma caixa de slides e colocar toalhas de papel embebido em água destilada para dentro para umidificar a caixa de slide. Coloque a caixa de slides no forno de hibridização. </li><li> Prepare 1x Pretreat 2 por diluição da solução estoque 10x (incluídos no kit de reagentes CISH) em água isenta de RNase ou tratada com DEPC. Se o pré-tratamento é realizado em uma placa quente, adicionando 100 ml de solução de pré-tratamento para um prato de 100 mm de diâmetro de vidro para aumentar a superfície de contacto entre o prato e a placa quente (pré-tratamento seé realizada em um forno de microondas, um frasco Coplin pode ser usado em vez conforme especificado no ponto 1.2.3). Solução de aquecimento para 100 ° C e mantê-lo não mais de 30 min a ferver antes de submergir amostras. </li><li> Calor sondas positivos e negativos 10 min a 40 o C e arrefecer à temperatura ambiente. </li><li> Equilibrar reagentes de amplificação AMP 1-6 (incluídos no kit de reagentes CISH) à TA. </li><li> Preparar o tampão de lavagem 1x diluição da solução estoque 50x (incluído no Kit de Reagentes CISH) em água destilada. Nota: 1x tampão de lavagem pode ser armazenado à temperatura ambiente durante 1 mês e ser utilizado para a coloração futuro. </li></ol></li><li> Adicionar ~ 4 gotas (~ 120 ul) de um Pré-tratar a cada fatia de cérebro, cobrir com parafilme e incubar à TA durante 10 min. </li><li> Lavar 3 a 5 vezes em água destilada fresca. </li><li> Execute desmascaramento induzida pelo calor: <ol><li> Lâminas de transferência para quente Pretreat 2 (incluído no Kit de Reagentes CISH) de solução e deixe ferver por 15 minutos. Nota: Ebulição pode ser executada em um prato quente assegurandoebulição contínua ou em um forno seguindo os passos críticos especificados no ponto 1.2.3). </li></ol></li><li> Imediatamente transferir lâminas para água destilada e lava-se 3-5 vezes. </li><li> Lavagem das lâminas de 3 a 5 vezes em fresco etanol a 100%. </li><li> Fatias de ar seco 5 min a RT. Nota: Em alternativa pode ser seco fatias O / N. </li><li> Realizar desmascaramento induzida por protease: <ol><li> Adicionar 4 gotas de 3 Pré-tratar (incluído no Kit de Reagentes CISH), cobrir com parafilme e incubar 30 min a 40 ° C no forno de hibridação. </li></ol></li><li> Lavagem das lâminas de 3 a 5 vezes em água destilada fresca. </li><li> Adicionar 4 gotas da sonda dapB definido para essas fatias do cérebro utilizadas para avaliar a coloração de fundo. </li><li> Adicionar 4 gotas da sonda alvo definido para essas fatias do cérebro utilizadas para detectar o ARN de interesse. NOTA: Um conjunto de sonda alvo resíduos de 15 - 1256 do ATF4 ARNm humano é utilizado neste exemplo. OPCIONAL: fatias de cérebro adicionais podem ser hybridized com um conjunto de sonda alvo PPIB humano e utilizado como controle positivo. </li><li> Colocar as lâminas na caixa de corrediça e incubar durante 2 horas. a 40 ° C no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 gotas de AMP um reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 gotas de AMP 2 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 gotas de reagente de AMP 3 para cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 30 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com 1x erah tampão durante 2 minutos à TA. </li><li> Adicionar 4 gotas de AMP 4 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme, colocá-los na caixa de corrediça e incubar a 40 ° C durante 15 minutos no forno de hibridação. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 gotas de AMP 5 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme e incubar 30 min a RT. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 4 gotas de AMP 6 reagente a cada fatia de cérebro, cobrir lâminas com parafilme e incubar 15 min a RT. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Misturar um volume igual de BROWN-1 e BROWN-2 reagentes (incluído no Kit de Reagentes CISH), adicione ~ 120 ml de solução para cada fatia do cérebro, cubra com parafilme e incubar 10 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavagem das lâminas duas vezes com tampão de lavagem 1x durante 2 min à temperatura ambiente e enxaguar uma vez em água destilada. NOTA: As etapas críticas: as seguintes etapas são fundamentais paraobter uma contracoloração axonal óptima sem mascarando a presença de grânulos de ARN. </li><li> Antes de executar counterstain verificar a presença de mRNA de interesse sob um microscópio de campo claro. Definir zonas de referência em amostras de cérebro nas quais a monitorizar a presença de pontos lacrimais durante todo o procedimento de contraste. </li><li> Pré-aqueça o Luxol rápido solução de azul a 60 o C. </li><li> Colocar as lâminas em Luxol azul rápido e incubar 30 min a 60 o C. </li><li> Lavar várias vezes em água destilada. </li><li> Dip slides para várias vezes em solução de carbonato de lítio 0.05% para iniciar a diferenciação. </li><li> Dip desliza duas vezes em fresco etanol a 75%. </li><li> Enxágüe em água destilada. </li><li> Verifique fatias de cérebro sob um microscópio de campo claro. Note-se que a matéria cinzenta e branca deve começar a ser distinguíveis grânulos e RNA ainda visíveis como azul escuro / puncta preto. Verifique se axónios começam a aparecer como fibras de luz azul. </li><li> Repita os passos 2.2.28 a 2.2.32. Perform incubações com Luxol solução de azul rápido em 10-20 mínimo de etapas, acompanhando atentamente a counterstain ea presença de grânulos de RNA. Nota: Tipicamente, contracoloração óptima é adquirido em 60 - 90 minutos (tempo total de incubação), mas o tempo pode ser encurtado se suspeita-se que os grânulos de ARN pode ser mascarado pela Luxol rápido mancha azul (ver Figura 2 para os exemplos). </li><li> Incubar as lâminas em solução de violeta de cresilo, durante 10 min à TA. </li><li> Lavar as lâminas em água destilada. </li><li> Dip slides para 5 a 10 vezes em etanol a 70%. </li><li> Desidratar fatias do cérebro através de 3 mudanças rápidas de etanol a 100%. </li><li> Numa hotte, fatias de cérebro claras através da incubação de duas vezes em xileno agente de remoção alternativa, durante 2 minutos e uma terceira vez durante 5 min à TA. </li><li> Mount fatias cerebrais em meio de montagem permanente à base de xileno. </li><li> Analisar amostras sob um microscópio de campo claro. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste relatório, descreve-se a utilização de uma tecnologia de ISH alta-resolução na detecção de axonally localizada ATF4 ARNm. Estes estudos anteriores publicados e mostram que esta tecnologia é compatível com a detecção de proteína à base de anticorpo em tecidos de embriões inteiros ou mesmo 33. É importante notar que foi recentemente usada para a detecção de ARNm dentro do arco dendrites dos neurónios do hipocampo 34. Também podem ser combinados com corantes para a coloração hi...

Recrutamento mRNA axonal e tradução local permitir axônios de responder a estímulos extracelulares de uma forma temporal e espacialmente aguda 1. Síntese da proteína intra-axonal é melhor compreendida no contexto de neurodesenvolvimento, onde ele desempenha um papel crucial no crescimento do cone de comportamento 2-8, 9-11 pathfinding axonal retrógrado e sinalização 12,13. Mas muito menos se sabe sobre o significado funcional da síntese de proteínas axonal em neurónios pós-desenvolvimento, quando os níveis de mRNA e ribossomas axonal são muito reduzidas 14,15. Axônios vertebrados maduros têm sido pensado para ser traducionalmente inativo 16. No entanto, estudos recentes indicam que a tradução local é reativado em axônios maduras em condições patológicas. Por exemplo, um subconjunto de mRNAs é recrutado para axónios em regeneração após a lesão do nervo e a síntese de proteínas intra-axonal é necessária para a regeneração de axónios correcta destes 17. Além disso, o nosso grupo has demonstrou que mRNAs específicos são recrutados para os axônios após exposição local à doença de Alzheimer peptídeo Aâ 1-42, e tradução local do ATF4 fator de transcrição é necessária para propagar os efeitos neurodegenerativos de Ap 1-42 de axônios para a soma neuronal 18. Finalmente, análises de alto rendimento têm revelado que os axônios maduros têm um transcriptoma mais complexo e dinâmico do que o esperado 18-21, especialmente sob condições patológicas. À luz destes estudos, um método altamente sensível e específico para a detecção de mRNAs axonally localizados no sistema nervoso adulto é necessária. Grande parte do trabalho sobre recrutamento mRNA e tradução local em axônios maduras foi realizada em neurônios cultivados. Isto é especialmente verdadeiro para as análises do transcriptoma de cultura uma vez que não existem métodos especializados que permitem o isolamento de axónios do compartimento da somato-dendrítico 18-20. Embora esses estudos tenham dado ins valiososight para o papel da tradução local em axônios maduros, a questão de saber se neurônios cultivados representam fielmente a situação in vivo ou se o recrutamento mRNA é uma resposta adaptativa dos axônios para condições de cultura ainda está aberta. Poucos estudos têm fornecido evidências de recrutamento mRNA para amadurecer axônios in vivo. Por exemplo, o transcrito que codifica para a proteína marcadora olfactiva tem sido detectada em axónios em neurónios sensoriais adultos 22. Um transgene contendo 3 &#39;UTR do mRNA β-actina é transportado para axónios em neurónios do sistema nervoso periférico e central, nos ratinhos, e é localmente traduzido após períodos de desenvolvimento 23. Lamin b2 mRNA é localizada axônios da retina em Xenopues laevis girinos e seu esgotamento afeta manutenção axônio após o desenvolvimento axonal 21. Interferência com o transporte axonal do ARNm que codifica para o citocromo C oxidase IV altera o comportamento do rato 24. Finalmente, ATF4 ARNm é encontrado em um adultoXONs de ratos e cérebros humanos no contexto de Ap 1-42 induzida neurodegeneração 18. Transcriptoma análises de alto rendimento têm provado ser útil para identificar perfis de mRNA em axônios isolado in vitro, mas tem limitações para estudos in vivo uma vez que em tecidos completos axônios nunca são encontrados isoladamente, mas misturado com corpos celulares neuronais, células gliais e outros tipos de células. Assim, essas análises têm de ser combinadas com as técnicas de imagem que confirmem a localização subcelular de mRNAs. RNA de hibridação in situ (ISH ARN) permite a detecção e a visualização de sequências de RNA específicas em células e tecidos. No entanto, os ensaios de ARN ISH originais foram adequado apenas para a identificação de ARN altamente abundantes 25, que é raramente o caso para o ARNm axonally localizadas. Para as últimas décadas crescentes esforços têm sido postas em desenvolvimento novas tecnologias que permitem a detecção de ARNm no nível de uma única molécula <sup&gt; 25,26. Por exemplo, Singer e seus colegas desenvolveram sondas ISH para detectar mRNAs em células individuais, que consiste em 5 não sobrepostas marcado por fluorescência 50-meros (para obter detalhes consulte o 27). A principal diferença entre as técnicas acima mencionadas e aquela aqui descrito é que a posterior usa 20 Z-estrutura dupla (não linear), que tipicamente têm como alvo sondas ~ 1 kb da região de ARN de interesse assegurar a especificidade e baixos níveis de fundo. As sondas são então hibridados com sequências pré-amplificador e do amplificador que estão, finalmente, marcados com fluorescência ou conjugados com enzimas que permitem reacções cromogénicos. Estes passos de amplificação melhorar a relação sinal-para-ruído em comparação com outras tecnologias de ISH 28. Aqui nós descrevemos dois protocolos utilizando RNAscope combinada ou com fluorescência imunocitoquímica ou com corantes histológicos permitindo counterstaining axonal. Ambos os protocolos são adequados para visualizar localização axonal de ATF4 mRNA em mo adultoe utilizar os cérebros humanos.

<table><tbody><tr><td>sonda personalizada direcionada aos resíduos 20-1.381 do camundongo Atf4 mRNA (NM_009716)</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td> <td>-</td> <td>sonda</td></tr><tr><td>personalizada direcionada aos resíduos 15-1.256 do < humano i> mRNA (NM_001675.2)</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td> <td>-</td> <td>sonda</td></tr><tr><td>de controle negativo - DapB</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>310043</td><td>sonda</td></tr><tr><td>sonda de controle positivo-camundongo Polr2A (opcional)</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>312471</td><td>sonda</td></tr> de <tr><td>controle positivo sonda PPIB humano (opcional)</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>313901</td><td>sonda</td></tr><tr><td>RNAscope Kit de Reagente Multiplex Fluorescente (para detecção de fluorescência)</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>320850</td><td>in situ kit</td></tr> <tr><td>de hibridizaçãoKit de reagentes RNAscope 2.0 HD - MARROM (para detecção cromogênica)</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>310035</td><td>in situ kit de hibridização</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ChAT policlonal de cabra</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td><td>American MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearify agente de limpeza (substituto de xileno)</td><td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>Montagem ProLong Gold com suporte DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>DPX Sigma</td><td></td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção de axonally localizada mrnas em seções do cérebro usando de alta resolução<em&gt; in situ</em&gt; hibridização

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs são freqüentemente localizada axônios vertebrados e sua tradução local é necessário para pathfinding axônio ramificação ou durante o desenvolvimento e para a manutenção, reparação ou neurodegeneração em períodos postdevelopmental. Análises de alto rendimento revelaram recentemente que os axônios têm um transcriptoma mais dinâmico e complexo do que o anteriormente esperado. Estas análises, no entanto, têm sido feitas principalmente em neurónios em cultura, onde axónios podem ser isolados a partir dos compartimentos somato-dendrítico. É virtualmente impossível de alcançar tal isolamento em tecidos completos in vivo. Assim, a fim de verificar o recrutamento de ARNm e a sua relevância funcional num animal inteiro, análises transcriptoma devem, idealmente, ser combinadas com as técnicas que permitem a visualização de ARNm in situ. Recentemente, as novas tecnologias ISH que detectam ARN a um nível de uma única molécula têm sido desenvolvidos. Isto é especialmente importante quando se analisa a localização subcelular de ARNm, Uma vez que os ARN são localizados, tipicamente encontrada em níveis baixos. Aqui, descrevemos dois protocolos para a detecção de ARNm axonally-localizadas utilizando um novo ultra-sensível tecnologia de RNA ISH. Nós combinamos RNAscope ISH com counterstain axonal usando imuno-histoquímica de fluorescência ou corantes histológicos para verificar o recrutamento de ATF4 mRNA para axônios in vivo no rato maduro e cérebros humanos.

Uma breve resumo dos procedimentos descritos acima é mostrado na Figura 1. Detecção óptima de mRNA ATF4 grânulos em axónios colinérgicos usando desmascaramento induzida por calor Ao avaliar a localização axonal de ARNm, que é crítico para ser capaz de identificar os axónios e para ser capaz de visualizar baixas RNAs abundantes. A tecnologia de ARN ISH aqui descrito permite a detecção de RNAs com uma resolução de uma única molécula. Os pr...

A hibridização in situ (ISH) de RNA permite a visualização de RNAs em células e tecidos. Aqui, mostramos como a combinação de RNAscope ISH com imuno-histoquímica ou corantes histológicos pode ser usada com sucesso para detectar mRNAs localizados em axônios em seções de cérebros de camundongos e humanos.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

O objetivo geral do seguinte experimento é detectar RNAs mensageiros acidentalmente localizados em amostras de cérebro adulto. Isso é alcançado por meio de um pré-tratamento das amostras com fervura e digestão por protease, a fim de expor as moléculas de RNA mensageiro. Como segundo passo, realiza-se a hibridização, seguida por etapas de amplificação e detecção, que permitem a visualização do RNA mensageiro de interesse.Em seguida, os axônios são corados com anticorpos ou corantes para verificar se o mRNA de interesse está localizado nos axônios. Os resultados mostram a presença de um mRNA de fator de transcrição quatro em amostras cerebrais utilizando diferentes procedimentos de desmascaramento e contadores, métodos de coloração baseados em análises microscópicas. Este método pode ajudar a responder perguntas na neurociência, como quais mRNAs são localizados e traduzidos sem éxons.Embora este método possa fornecer informações sobre a síntese proteica intracelular, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como dendritos e células e tecidos não neuronais nos quais ocorre o direcionamento de mRNA. Após fixar fatias de cérebro, de acordo com as instruções no protocolo escrito, prepare um recipiente Coplin contendo 60 mililitros de solução de recuperação de antígeno e imerja as lâminas nesta solução. Em seguida, encha um béquer de um litro com água destilada e coloque-o no micro-ondas para amortecer o calor.Ao realizar a desmascaramento, coloque o frasco coplan contendo as lâminas e a solução de recuperação no micro-ondas. Ferva as lâminas em potência alta por cinco minutos. Imediatamente após a solução parar de ferver, aqueça novamente as lâminas em potência alta por mais cinco minutos.Deixe os lâminas esfriarem à temperatura ambiente. Após o resfriamento, imerja as lâminas em um recipiente contendo PBS para lavá-las e repita a lavagem mais duas vezes. Após a lavagem, coloque as lâminas sobre uma superfície plana e adicione duas a três gotas ou 100 microlitros de DAP B.Probe a duas ou três secções cerebrais como controle. Para avaliar a coloração de fundo, adicione duas a três gotas da sonda direcionada às secções experimentais. Para detectar o RNA de interesse, utiliza-se aqui uma sonda que direciona os resíduos 20 a 1381 do RNA de a TF four de camundongo. Use pinças para colocar parafina sobre as lâminas, evitando a evaporação da sonda.Em seguida, coloque as lâminas na caixa de lâminas umidificada dentro da estufa de hibridização e incube-as a 40 graus Celsius por duas horas. Após o tempo de incubação, lave as lâminas em uma placa com tampão de lavagem 1 x durante dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione duas a três gotas do reagente de amplificação a MP um fl a cada fatia cerebral.Em seguida, cubra com filme parafina fresco, coloque na caixa de lâminas e incube a 40 graus Celsius por 15 minutos no forno de hibridização. Após lavar as lâminas como anteriormente, adicione duas a três gotas do reagente de amplificação A MP four fl a cada fatia cerebral e cubra com perfil. Incube as lâminas na caixa de lâminas a 40 graus Celsius por 15 minutos no forno de hibridização.Lave as lâminas duas vezes com um x de tampão de lavagem durante dois minutos cada, à temperatura ambiente. Como antes, após a última lavagem, cubra cada fatia com 100 a 200 microlitros de solução bloqueadora contendo três miligramas por mililitro de BSA, 100 milimolares de glicina e 0,25% de Triton X-100 em PBS, cubra cada lâmina com paraform e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicione 100 a 200 microlitros de anticorpo diluído na solução bloqueadora às lâminas. Um anticorpo anti-colina acetiltransferase é usado aqui; após cobrir as lâminas com perfil, incube por dois dias a quatro graus Celsius.Certifique-se de que as fatias cerebrais não sequem; se necessário, reaplique a solução de anticorpo anti-CHATT às fatias cerebrais 24 horas após a incubação. Após lavar as lâminas três vezes em PBS 1X durante cinco minutos, adicione de 100 a 200 microlitros do anticorpo secundário conjugado com Alexa apropriado às lâminas, à temperatura ambiente.Cubra com param e incube por uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz, após o término da hora. Lave as lâminas três vezes em um XPBS por cinco minutos cada, como antes, e depois lave uma vez com água destilada. Monte as lâminas com meio de montagem contendo DPI e visualize então os cortes cerebrais ao microscópio de fluorescência.Após o preparo de amostras de cérebro humano embebidas em parafina formalizada e fixada, conforme as instruções na parte escrita do protocolo, realize a exposição induzida por calor de antígenos imersindo as lâminas em solução pré-tratamento dois aquecida e fervendo por 15 minutos. Após lavar de três a cinco vezes em água destilada e de três a cinco vezes em etanol 100% fresco, deixe as lâminas secarem por cinco minutos à temperatura ambiente para realizar a exposição de antígenos induzida por protease. Adicione quatro gotas de pré-tratamento três, cubra com perfil e incube por 30 minutos a 40 graus Celsius no forno de hibridização após lavar de três a cinco vezes em água destilada.Como antes, adicione quatro gotas do conjunto de sondas DAP B em fatias cerebrais controle para avaliar a coloração de fundo e quatro gotas do conjunto de sondas direcionadoras nas seções experimentais. Coloque o par de lâminas cobertas com filme na caixa de lâminas e incube por duas horas a 40 graus Celsius no forno de hibridização. Após seguir os passos do protocolo escrito para desenvolver o sinal DAB para o mRNA de interesse, verifique a presença de sinal em microscópio de campo claro.Defina áreas de referência nas amostras cerebrais nas quais monitorar a presença de pontos durante todo o procedimento de coloração de contraste. Para a coloração de contraste, primeiro coloque as lâminas em azul luxol rápido pré-aquecido a 60 graus Celsius e incube por 30 minutos a 60 graus Celsius.Após a incubação, lave as lâminas várias vezes em água destilada e, em seguida, mergulhe as lâminas várias vezes em solução de carbonato de lítio a 0,05% para iniciar a diferenciação. Em seguida, mergulhe as lâminas duas vezes em etanol a 75% fresco e lave em água destilada. Examine as fatias cerebrais em um microscópio de campo claro.Observe que a substância cinzenta e branca devem começar a ser distinguíveis e os grânulos de RNA ainda visíveis como pontos escuros azul-escuros. Verifique se os axônios começam a aparecer como fibras azul-claras, repita o procedimento de coloração com azul de luxol, incubando com azul de luxol em etapas de 10 a 20 minutos e monitorando cuidadosamente a contracoloração e a presença de grânulos de RNA até que a coloração ideal tenha sido alcançada. Coloque as lâminas de enxágue em solução de violeta cristal e incube por 10 minutos após a incubação.Lave as lâminas com água destilada. Mergulhe as lâminas em etanol 70% de cinco a dez vezes e, em seguida, desidrate com três trocas rápidas de etanol 100% em uma capela. Limpe as fatias cerebrais incubando-as duas vezes em xilol.Agente de clareamento alternativo por dois minutos e uma terceira vez por cinco minutos. Monte as fatias cerebrais em meio de montagem permanente à base de xilol à temperatura ambiente e analise ao microscópio de campo claro. A técnica foi realizada utilizando desmascaramento induzido por protease seguido pela detecção com anticorpo contra a colina acetiltransferase, mostrada em vermelho.O anticorpo não conseguiu reconhecer o chat quando o tratamento com protease foi realizado. São apresentados exemplos de resultados obtidos com uma sonda não direcionada e com a sonda direcionada ao TF4, utilizando as mesmas configurações do microscópio e ajustes de imagem. Grânulos positivos verdes para ATF4 com localização axonal não clara estão indicados com pontos de interrogação.As áreas azuis são núcleos corados com DAPI quando o peixe foi submetido à exposição de antígeno induzida por calor. A revelação do rótulo imunofluorescente, novamente mostrado em vermelho, foi bem-sucedida. Grânulos positivos para TF4 localizados nos axônios aparecem laranja e são marcados como OK; os axônios seguintes foram contracontracorados com Luxol.A coloração rápida azul e a SOTA neuronal foram contra-coloradas com violeta de gêmeos luxal subótimo. A coloração azul rápida pode ocorrer se a temperatura for reduzida. Aqui, as amostras foram coradas com azul rápido luxal a 40 graus Celsius durante quatro horas.Grânulos positivos de TF4 com localização acidental incerta são indicados com pontos de interrogação. A coloração subótima também ocorre quando a intensidade da contracoloração não é verificada após períodos curtos de incubação, como visto aqui. São apresentados exemplos de coloração ótima com LFB combinada com hibridização in situ utilizando uma sonda não alvo ou a sonda direcionada ao TF4.A aquisição de imagem foi ajustada automaticamente para obter a melhor relação sinal-ruído. O axônio localizou um TF: quatro grânulos são marcados como adequados. Uma vez dominado.Essa técnica pode ser realizada em um a três dias, dependendo do método de contracoloração escolhido após o seu desenvolvimento. Este método abre caminho para que neurocientistas explorem com nuances a tradução e a localização de mRNA.

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Este vídeo descreve uma estratégia de hibridização sequencial que envolve a hibridização de sondas de mRNA para mRNA alvo específico. Após a hibridização da sonda, a amplificação do sinal é realizada para melhorar a resolução por meio da redução da relação sinal-ruído durante o RNA-CISH de amostras histológicas.

Hibridização de sonda e amplificação de sinal em hibridização in situ de RNA: uma técnica para detectar sequências específicas de RNA em seções de tecido

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinando hibridização de fluorescência dupla  in situ com imunomarcação para detecção da expressão de três genes em seções cerebrais de camundongos. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra o uso de hibridização in situ de fluorescência dupla para visualizar a expressão de dois alvos de RNA em seções cerebrais de camundongos. O protocolo envolve a detecção sequencial de RNA usando sondas marcadas com isotiocianato de fluoresceína e digoxigenina, seguida de...

 Realizando hibridização in situ de fluorescência dupla para detectar a expressão gênica em seções cerebrais de camundongos

Fonte: Baleriola, J., et. al., Detecção de mRNAs localizados axonalmente em seções cerebrais usando hibridização in situ de alta resolução.  J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra a detecção de mRNA dentro de axônios colinérgicos em fatias fixas de hipocampo de camundongo usando hibridização in situ fluorescente e coloração de anticorpos. A microscopia de fluorescência revela a localização espacial de mRNAs marcados com sonda e colina acetiltransferase em neurônios colinérgicos.

Imunocoloração de neurônios em fatias de cérebro de camundongo após hibridização in situ fluorescente

Este protocolo descreve um método de hibridização in situ rápido e simplificado, ideal para cérebro com prefixo de paraformaldeído, reduzindo assim a necessidade de etapas complexas prolongadas ao usar tecidos frescos congelados.  O método é validado usando a identificação do gene do receptor de serotonina 5-HT2A htr2a em ratos.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação usando sondas Oligonucleotide no cérebro prefixado-paraformaldeído de ratos com síndrome serotoninérgica

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Este protocolo descreve um método para combinar hibridização in situ fluorescente (FISH) e imunohistoquímica de fluorescência (IHQ) em cortes frescos congelados e fixos de camundongos em cérebros, com o objetivo de obter sinais de FISH multimarcados e IHC de fluorescência. IHQ teve como alvo proteínas citoplasmáticas e ligadas à membrana.

Combinando Hibridização In Situ por Fluorescência Multiplex com Imunohistoquímica Fluorescente em Seções Cerebrais de Camundongos Frescos Congelados ou Fixos

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Estabelecemos um ensaio de hibridização in situ Duplex para mapear as isoformas do receptor de insulina IR-A e IR-B no plexo coróide murino, superando as limitações dos métodos tradicionais. Essa abordagem de alta resolução revela a expressão específica da isoforma, oferecendo novos insights sobre a sinalização da insulina cerebral e possíveis terapias direcionadas à isoforma para distúrbios neurológicos.

Visualização precisa dos receptores de insulina A e B no cérebro murino com um ensaio de hibridização in situ de RNA

Este estudo apresenta um método robusto para isolar mRNAs axonais usando inserções de membrana porosas, possibilitando a separação total de neurônios vs. neuritos e a purificação de RNA. Combinado com o RTddPCR, a abordagem permite a quantificação absoluta de transcritos de baixa cópia, facilitando estudos de transporte de mRNA e tradução local com alta sensibilidade, reprodutibilidade e ampla aplicabilidade experimental.

Isolamento e Quantificação de MRNAs Axonais Usando Inserções de Membrana Porosa e RTddPCR

Aprenda a detectar mRNAs localizados em axônios em amostras de cérebro de camundongos e humanos usando hibridização in situ de alta resolução combinada com imunohistoquímica. Este método permite visualizar a distribuição espacial de mRNAs em tecidos neurais.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução

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