Combinando Duplo Fluorescência In Situ A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

O objetivo geral deste experimento é detectar simultaneamente a expressão de três genes diferentes em seções cerebrais, usando hibridização in situ de fluorescência dupla seguida de imunocoloração. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da neurociência, como qual tipo de célula expressa meu gene de interesse? A principal vantagem dessa técnica é que você não precisa de um bom anticorpo para que seu gene de interesse seja capaz de localizar sua expressão em um tipo específico de célula.

Para resumir este procedimento, no primeiro dia, seções de tecido fixas são cortadas e hibridizadas com duas sondas de RNA marcadas de forma diferente durante a noite. No segundo dia, as seções são incubadas durante a noite com um anticorpo direcionado à sonda marcada com FITC. Este anticorpo é conjugado com peroxidase de rábano, que catalisa a adição de um tiramida fluorescente no terceiro dia.

Em seguida, um anticorpo conjugado com fosfatase alcalina é usado para direcionar a sonda marcada com DIG. No quarto dia, esta enzima catalisa a formação de precipitado fluorescente quando incubada com solução Fast Red. Em seguida, as seções são incubadas durante a noite com um anticorpo primário direcionado a uma proteína de interesse.

Finalmente, no quinto dia, essa proteína é visualizada com um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo. Para iniciar este procedimento, escolha um clone de DNA que contenha a sequência de cDNA do gene de interesse em um plasmídeo com promotores de RNA polimerase. Em seguida, cultive o clone de DNA, extraia o plasmídeo com um kit de purificação de plasmídeo em pequena escala e sequencie-o com primers universais T7 e SP6.

Digerir 10 a 20 microgramas de DNA plasmidial com uma enzima de restrição que corta a extremidade cinco primos da fita sensorial do cDNA. Incube por 1,5 horas a 37 graus Celsius. Em seguida, execute uma pequena alíquota em um gel de agarose para verificar se o plasmídeo está totalmente linearizado.

Para purificar o plasmídeo linearizado, adicione 1/10 do volume de acetato de sódio de três molares, um volume de fenol equilabrado Tris-HCl 10 milimolar e um volume de álcool isoamílico clorofórmio. Centrifugar a 16 000 Gs durante um minuto à temperatura ambiente e extrair a fase aquosa superior. Em seguida, adicione um volume de clorofórmio IAA.

Centrifugar a 16 000 Gs durante um minuto e extrair a fase aquosa superior. Repita esta etapa mais uma vez. Em seguida, adicione dois volumes de etanol e mantenha-o a 20 graus Celsius negativos por uma hora ou durante a noite.

Em seguida, centrifugue a 16.000 Gs a quatro graus Celsius por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e lave o pellet com etanol a 70% frio. Em seguida, ressuspenda-o em TE a uma concentração de um micrograma de cDNA por 2,5 microlitros.

Para sintetizar as duas sondas, primeiro selecione a RNA polimerase apropriada. Em seguida, prepare a reação de transcrição in vitro e aumente o volume final para 20 microlitros com água tratada com DEPC. Incube a 37 graus Celsius por 1,5 horas.

Posteriormente, execute um microlitro da reação de transcrição em um gel de agarose a 1% para verificar se a reação funcionou. O gel deve mostrar o gabarito linear e uma faixa brilhante da sonda. Neste procedimento, corte seções de tecido congelado de 15 micrômetros de espessura em um criostato.

Colete as seções nas lâminas do microscópio e deixe-as secar por uma hora para garantir que os tecidos adiram às lâminas. O fator mais importante para que esse procedimento funcione bem é a qualidade das seções. Isso depende em parte de ter tecido bem perfundido e fixado e, em parte, da técnica de seccionamento para obter seções planas e livres de contaminação por RNase.

Em seguida, dilua as duas sondas em tampão de hibridização pré-aquecido a 65 graus Celsius e misture bem. Aplique 300 microlitros de mistura de hibridização em cada lâmina e cubra com uma lamínula assada no forno. Em seguida, incube as lâminas durante a noite a 65 graus Celsius em uma câmara umidificada.

No dia seguinte, transfira as lâminas para um frasco Coplin contendo tampão de lavagem pré-aquecido e lave as lâminas por 30 minutos, duas vezes, a 65 graus Celsius. Depois disso, lave as lâminas por 10 minutos três vezes com a solução de lavagem MABT em temperatura ambiente. Nesta etapa, use uma caneta hidrofóbica para desenhar círculos ao redor das seções de tecido.

Em seguida, incube as lâminas por uma hora em temperatura ambiente com tampão de bloqueio ISH em uma câmara umidificada. Em seguida, incubar as lâminas durante a noite a 4 graus Celsius com um anticorpo anti-fitc conjugado peroxidado de raiz-forte. Em seguida, coloque as lâminas em um frasco de coplin contendo PBST.

Lave-os em PBST três vezes por 10 minutos de cada vez e substitua por PBST novo a cada vez. Depois, adicione tiromida fluorescente às lâminas e deixe-as por 10 minutos em temperatura ambiente. Coloque as lâminas em um frasco de coplin e lave em PBST por 10 minutos três vezes.

Em seguida, incubar as lâminas com tampão de bloqueio ISH por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, incube as lâminas durante a noite a quatro graus Celsius com um anticorpo anti-escavação conjugado com fosfatase alcalina. Depois disso, lave-os com MABT três vezes por 10 minutos de cada vez.

Em seguida, lave as lâminas duas vezes com 0,1 molar tris HCL a pH 8,2 por cinco minutos em temperatura ambiente. Filtre a solução vermelha rápida e incube as lâminas a 37 graus Celsius com solução vermelha rápida em uma câmara umidificada. Como o tempo para o desenvolvimento ideal varia, verifique as lâminas regularmente com um microscópio fluorescente para monitorar a formação de precipitado.

Em seguida, lave-os três vezes com PBST por 10 minutos de cada vez. Para realizar a imuno-histoquímica, incubar as lâminas com tampão bloqueador de IHC por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Em seguida, incube as lâminas na solução de anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, lave as lâminas com PBST por 10 minutos três vezes. Incube-os na solução de anticorpos secundários à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, lave-os com PBST três vezes por 10 minutos de cada vez.

Em seguida, seque parcialmente as lâminas à temperatura ambiente e monte com um meio de montagem de fluorescência. Deixe as lâminas secarem antes de fotografá-las em um microscópio confocal. Aqui estão as imagens representativas de ISH para Aspa e Mbp, seguidas de imunocoloração para OLIG2 combinada com coloração em gancho.

A Aspa foi expressa em algumas células positivas para OLIG2 positivas para MBP no córtex e no corpo caloso. Algumas células positivas para OLIG2 positivas para Mbp não expressam Aspa. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de manter as fatias e todas as soluções livres de contaminação por RNase.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar os padrões de expressão gênica por inibição de N-citrino e imuno-histoquímica. Esta técnica pode ser adaptada para uma variedade de tecidos de diferentes origens e estágios de desenvolvimento.