Combinando Duplo Fluorescência In Situ A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato
26 de março de 2016
Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.
O objetivo geral deste experimento é detectar simultaneamente a expressão de três genes diferentes em seções cerebrais, usando hibridização in situ de fluorescência dupla seguida de imunocoloração. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da neurociência, como qual tipo de célula expressa meu gene de interesse? A principal vantagem dessa técnica é que você não precisa de um bom anticorpo para que seu gene de interesse seja capaz de localizar sua expressão em um tipo específico de célula.
Para resumir este procedimento, no primeiro dia, seções de tecido fixas são cortadas e hibridizadas com duas sondas de RNA marcadas de forma diferente durante a noite. No segundo dia, as seções são incubadas durante a noite com um anticorpo direcionado à sonda marcada com FITC. Este anticorpo é conjugado com peroxidase de rábano, que catalisa a adição de um tiramida fluorescente no terceiro dia.
Em seguida, um anticorpo conjugado com fosfatase alcalina é usado para direcionar a sonda marcada com DIG. No quarto dia, esta enzima catalisa a formação de precipitado fluorescente quando incubada com solução Fast Red. Em seguida, as seções são incubadas durante a noite com um anticorpo primário direcionado a uma proteína de interesse.
Finalmente, no quinto dia, essa proteína é visualizada com um anticorpo secundário conjugado com fluoróforo. Para iniciar este procedimento, escolha um clone de DNA que contenha a sequência de cDNA do gene de interesse em um plasmídeo com promotores de RNA polimerase. Em seguida, cultive o clone de DNA, extraia o plasmídeo com um kit de purificação de plasmídeo em pequena escala e sequencie-o com primers universais T7 e SP6.
Digerir 10 a 20 microgramas de DNA plasmidial com uma enzima de restrição que corta a extremidade cinco primos da fita sensorial do cDNA. Incube por 1,5 horas a 37 graus Celsius. Em seguida, execute uma pequena alíquota em um gel de agarose para verificar se o plasmídeo está totalmente linearizado.
Para purificar o plasmídeo linearizado, adicione 1/10 do volume de acetato de sódio de três molares, um volume de fenol equilabrado Tris-HCl 10 milimolar e um volume de álcool isoamílico clorofórmio. Centrifugar a 16 000 Gs durante um minuto à temperatura ambiente e extrair a fase aquosa superior. Em seguida, adicione um volume de clorofórmio IAA.
Centrifugar a 16 000 Gs durante um minuto e extrair a fase aquosa superior. Repita esta etapa mais uma vez. Em seguida, adicione dois volumes de etanol e mantenha-o a 20 graus Celsius negativos por uma hora ou durante a noite.
Em seguida, centrifugue a 16.000 Gs a quatro graus Celsius por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e lave o pellet com etanol a 70% frio. Em seguida, ressuspenda-o em TE a uma concentração de um micrograma de cDNA por 2,5 microlitros.
Para sintetizar as duas sondas, primeiro selecione a RNA polimerase apropriada. Em seguida, prepare a reação de transcrição in vitro e aumente o volume final para 20 microlitros com água tratada com DEPC. Incube a 37 graus Celsius por 1,5 horas.
Posteriormente, execute um microlitro da reação de transcrição em um gel de agarose a 1% para verificar se a reação funcionou. O gel deve mostrar o gabarito linear e uma faixa brilhante da sonda. Neste procedimento, corte seções de tecido congelado de 15 micrômetros de espessura em um criostato.
Colete as seções nas lâminas do microscópio e deixe-as secar por uma hora para garantir que os tecidos adiram às lâminas. O fator mais importante para que esse procedimento funcione bem é a qualidade das seções. Isso depende em parte de ter tecido bem perfundido e fixado e, em parte, da técnica de seccionamento para obter seções planas e livres de contaminação por RNase.
Em seguida, dilua as duas sondas em tampão de hibridização pré-aquecido a 65 graus Celsius e misture bem. Aplique 300 microlitros de mistura de hibridização em cada lâmina e cubra com uma lamínula assada no forno. Em seguida, incube as lâminas durante a noite a 65 graus Celsius em uma câmara umidificada.
No dia seguinte, transfira as lâminas para um frasco Coplin contendo tampão de lavagem pré-aquecido e lave as lâminas por 30 minutos, duas vezes, a 65 graus Celsius. Depois disso, lave as lâminas por 10 minutos três vezes com a solução de lavagem MABT em temperatura ambiente. Nesta etapa, use uma caneta hidrofóbica para desenhar círculos ao redor das seções de tecido.
Em seguida, incube as lâminas por uma hora em temperatura ambiente com tampão de bloqueio ISH em uma câmara umidificada. Em seguida, incubar as lâminas durante a noite a 4 graus Celsius com um anticorpo anti-fitc conjugado peroxidado de raiz-forte. Em seguida, coloque as lâminas em um frasco de coplin contendo PBST.
Lave-os em PBST três vezes por 10 minutos de cada vez e substitua por PBST novo a cada vez. Depois, adicione tiromida fluorescente às lâminas e deixe-as por 10 minutos em temperatura ambiente. Coloque as lâminas em um frasco de coplin e lave em PBST por 10 minutos três vezes.
Em seguida, incubar as lâminas com tampão de bloqueio ISH por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, incube as lâminas durante a noite a quatro graus Celsius com um anticorpo anti-escavação conjugado com fosfatase alcalina. Depois disso, lave-os com MABT três vezes por 10 minutos de cada vez.
Em seguida, lave as lâminas duas vezes com 0,1 molar tris HCL a pH 8,2 por cinco minutos em temperatura ambiente. Filtre a solução vermelha rápida e incube as lâminas a 37 graus Celsius com solução vermelha rápida em uma câmara umidificada. Como o tempo para o desenvolvimento ideal varia, verifique as lâminas regularmente com um microscópio fluorescente para monitorar a formação de precipitado.
Em seguida, lave-os três vezes com PBST por 10 minutos de cada vez. Para realizar a imuno-histoquímica, incubar as lâminas com tampão bloqueador de IHC por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. Em seguida, incube as lâminas na solução de anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, lave as lâminas com PBST por 10 minutos três vezes. Incube-os na solução de anticorpos secundários à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, lave-os com PBST três vezes por 10 minutos de cada vez.
Em seguida, seque parcialmente as lâminas à temperatura ambiente e monte com um meio de montagem de fluorescência. Deixe as lâminas secarem antes de fotografá-las em um microscópio confocal. Aqui estão as imagens representativas de ISH para Aspa e Mbp, seguidas de imunocoloração para OLIG2 combinada com coloração em gancho.
A Aspa foi expressa em algumas células positivas para OLIG2 positivas para MBP no córtex e no corpo caloso. Algumas células positivas para OLIG2 positivas para Mbp não expressam Aspa. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de manter as fatias e todas as soluções livres de contaminação por RNase.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar os padrões de expressão gênica por inibição de N-citrino e imuno-histoquímica. Esta técnica pode ser adaptada para uma variedade de tecidos de diferentes origens e estágios de desenvolvimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a detecção simultânea de três expressões gênicas diferentes em seções de tecido cerebral. O método combina hibridização in situ por dupla fluorescência (FISH) com imunomarcação, permitindo aos pesquisadores localizar a expressão gênica em tipos celulares cerebrais específicos, mesmo quando anticorpos adequados não estão disponíveis para todos os alvos. O protocolo é exemplificado por meio do estudo da expressão do gene Aspartoacilase (ASPA) em oligodendrócitos e outras células cerebrais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia molecular
- Histologia
Contexto
- A análise de expressão gênica em tecido cerebral é frequentemente limitada pela disponibilidade de anticorpos específicos para imunomarcação.
- A hibridização in situ permite a detecção de transcritos de mRNA, oferecendo uma alternativa aos métodos baseados em anticorpos.
- A combinação de FISH com imunomarcação possibilita a visualização simultânea de múltiplos produtos gênicos no mesmo corte de tecido.
- O gene ASPA está implicado na doença de Canavan e acredita-se que seja expresso em oligodendrócitos e micróglias, mas seu padrão exato de expressão no cérebro era anteriormente desconhecido.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver e demonstrar um protocolo para detectar três expressões gênicas diferentes na mesma seção cerebral.
- Determinar o padrão de expressão específico do tipo celular do gene ASPA no cérebro.
- Fornecer um método amplamente aplicável para estudos de expressão gênica em diversos tecidos e estágios de desenvolvimento.
Métodos Utilizados
- Preparação de seções de tecido cerebral fixado e corte em criostato.
- Síntese de duas sondas de RNA específicas para genes marcadas com diferentes marcadores (FITC e DIG) por meio de transcrição in vitro.
- Hibridização fluorescente dupla in situ utilizando as duas sondas, cada uma detectada com anticorpos conjugados a enzimas e substratos fluorescentes (Tiramida e Fast Red).
- Imunomarcação subsequente com um anticorpo altamente específico contra uma terceira proteína, visualizada com um anticorpo secundário conjugado a fluoróforo.
- Microscopia confocal para imagem e análise dos padrões de expressão gênica.
Resultados Principais
- O protocolo permitiu com sucesso a detecção simultânea de três produtos gênicos no mesmo corte cerebral.
- A expressão de ASPA foi localizada em um subconjunto de oligodendrócitos maduros, conforme demonstrado pela marcação simultânea com os marcadores MBP e OLIG2.
- Algumas células positivas para MBP e positivas para OLIG2 não expressaram ASPA, indicando heterogeneidade entre os oligodendrócitos.
- O método mostrou-se adaptável a diferentes tipos de tecidos e estágios de desenvolvimento.
Conclusões
- Este protocolo permite o mapeamento preciso da expressão gênica em tipos celulares cerebrais específicos, sem necessidade de anticorpos para todos os alvos.
- Ele fornece novas perspectivas sobre a expressão específica por tipo celular de ASPA no cérebro.
- A técnica é amplamente aplicável para o estudo de padrões de expressão gênica em diversos contextos biológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
No desenvolvimento de fármacos em neurociência, identificar a expressão gênica em tipos celulares cerebrais específicos é essencial para a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas. Este método permite a detecção simultânea de três genes sem depender de anticorpos de alta qualidade, solucionando um gargalo fundamental na confirmação de alvos. Ao fornecer dados espacialmente resolvidos e multiplexados de expressão gênica, ele apóia testes iniciais de hipóteses e a priorização de portfólios no desenvolvimento de terapias para o sistema nervoso central.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da associação da expressão gênica a oligodendrócitos, micróglias, astrócitos ou neurônios.
- Valor Operacional: Reduz a dependência da disponibilidade de anticorpos, acelerando os prazos de validação de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da visualização direta dos padrões de coexpressão gênica em tipos celulares relevantes para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera leituras fluorescentes padronizadas e reprodutíveis para três alvos por seção, permitindo comparação quantitativa entre diferentes condições.
- Escalabilidade: Compatível com plataformas de imagem de alta resolução, permitindo análise escalonável da expressão gênica em modelos pré-clínicos.
- Reutilização da Plataforma: Adaptável a diversas regiões cerebrais e estágios de desenvolvimento, facilitando a consistência entre estudos no perfil de expressão de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona descobertas de expressão gênica em estágio de pesquisa a modelos pré-clínicos, confirmando a expressão específica por tipo celular no cérebro de camundongo.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se um alvo é expresso no contexto celular pretendido, reduzindo o risco de falhas baseadas no mecanismo de ação.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a identificação de sinais específicos por tipo celular que podem ser traduzidos em biomarcadores em fluidos ou por imagem em estágios posteriores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a hipótese sobre o alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo confiança mecanicista antes da triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses de expressão gênica por meio da visualização da co-localização de RNA e proteína em populações celulares definidas.
- Triagem: Gera saídas padronizadas e multiplexadas que permitem comparação confiável da expressão gênica entre grupos experimentais.
- Análises: Fornece leituras quantitativas baseadas em fluorescência e precipitado que suportam comparação estatística dos níveis de expressão.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro ou in silico a padrões de expressão in vivo em tecidos neurais relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para perfis de expressão gênica multiplexados em diversos projetos do SNC.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na biologia do alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista na expressão gênica.
- Valor Operacional: Padroniza o fluxo de trabalho para detecção multiplexada, melhorando a reprodutibilidade entre diferentes locais e equipes.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao confirmar a expressão do alvo em tipos celulares relevantes, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em perfis de expressão validados em sistemas relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em hibridização in situ de RNA, imunohistoquímica e microscopia de fluorescência.
- Depende de um ambiente livre de RNases, fixação de tecido de qualidade e precisão no corte de seções.
- Necessita de acesso a fornos de hibridização, microscópios fluorescentes e reagentes para detecção com Tiramida e Fast Red.
- É necessário otimizar a concentração da sonda e a titulação do anticorpo para cada alvo, a fim de minimizar o fundo.
- Limitado pela autofluorescência do tecido e pelo potencial de sobreposição de sinais em canais multiplexados, exigindo separação espectral cuidadosa.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:42
Overview of Double Fluoresence In Situ Hybridization Followed by Immunostaining
1:44
RNA Probe Synthesis
4:12
Cryosectioning and Hybridization
5:33
Visualization of the FITC Probe and the DIG Probe
7:23
Immunohistochemistry and Mounting
8:16
Results: Expression of Aspa in Oligodendrocytes in the Cortex and the Corpus Callosum
8:45
Conclusion
