Name: Isolamento e Quantificação de MRNAs Axonais Usando Inserções de Membrana Porosa e RTddPCR (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda a isolar mRNAs axonais usando inserções de membrana porosa e RT-ddPCR para quantificação absoluta de transcritos de baixa cópia em neurônios. Este método permite estudar transporte de mRNA e tradução local com alta sensibilidade.

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<table><tbody><tr><td>Inserções de cultura celular para placas de 6 poços, 1.0&nbsp; &mu; m Tamanho dos poros, estéril</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Inserções de cultura celular para placa de 6 poços, 3,0 & nbsp; &mu; m Tamanho dos poros, estéril</td><td>CELLTREAT</td><td>230603</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Levantador de Células com Lâmina Estreita</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos CELLSTAR de 6 poços</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>ddPCR 96 Poços Placas &nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>12001925</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>ddPCR Óleo Leitor de Gotas&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1863004</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Cartuchos DG8 para Gerador de Gotículas QX200/QX100</td><td>Bio-rad</td><td>1864008</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Microplacas para preto à base de fluorescência, 96 poços</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33089</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Vedação térmica da placa PCR, folha de alumínio, perfurável</td><td>Bio-rad</td><td>1814040</td><td>Consumíveis</td></tr><tr><td>Polilisina</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96 Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>12015382</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Software QuantaSoft</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software de análise de dados por PCR</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Reagente e RNA Quant-it RiboGreen</td><td>Thermo Fisher</td><td>R11490</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1864034</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Óleo de geração de gotículas QX200 para EvaGreen</td><td>Bio-rad</td><td>1864005</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Gerador de Gotículas QX200</td><td>Bio-rad</td><td>17005227</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Leitor de Gotas QX200</td><td>Bio-rad</td><td>17005228</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-026</td><td>Reagentes</td></tr></tbody></table>

isolamento e quantificação de mrnas axonais usando inserções de membrana porosa e rtddpcr

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

Neurônios corticais do roedor embrionário primário, neurônios do hipocampo e BFCNs placados em insertos de 1 μm revestidos com PLL aderem robustamente e estendem as neuritas através da membrana por 5 a 7 dias in vitro (DIV). Em 11 DIV, as culturas apresentam redes densas. Para DRGs de rato adulto, adicionar uma camada de laminina a insertos de 3 μm revestidos com PLL ajuda a alcançar extensão axonal comparável de 5 DIV. Essas observações confirmam a capacidade dos insertos de suportar o crescimento neuronal a longo prazo e fornecer material axonal suficiente para extração de RNA a jusante. Em caso de necessidade de escalar, combinamos vários inserts para fornecer material suficiente.
A extração de TRIzol a partir de inserções individuais gera RNA suficiente para transcrição reversa e subsequente ddPCR. A quantificação RiboGreen confirma rendimentos consistentes de RNA a partir de frações inteiras de neurônios (212,85 ng/insert) e rendimentos menores a partir de frações de neurita (42,75 ng/insert) (Figura 2). Geralmente obtemos um RNA ~5-7 vezes da fração inteira do neurônio em comparação com a fração enriquecida com neuritas.
Todos os primers são validados antes dos experimentos RTddPCR. Para cada transcrito alvo, pelo menos dois conjuntos de primers são ordenados e testados usando PCR convencional em cDNA gerado a partir das mesmas amostras neuronais. O par de primers que produz a faixa mais forte e específica é selecionado para RTddPCR (Figura 3A). Por exemplo, escolhemos o conjunto de primers 1 para Gap43. Em casos de resultados ambíguos, como os obtidos para Actγ, realizamos uma PCR em gradiente para otimizar as temperaturas de recozimento (Figura 3B). Isso garante que apenas primers bem validados sejam usados para quantificação absoluta, reduzindo a probabilidade de artefatos na separação de gotículas.
O procedimento de raspagem e swab separa de forma confiável os compartimentos somático e neurítico. RNA isolado de frações inteiras de neurônios mostra enriquecimento de transcritos, como Actγ 46,47,48,49 (Figura 4). Em contraste, frações de axônio/neurita produzem RNA total marcadamente menor, consistente com seu volume restrito, mas apresentam enriquecimento de transcritos conhecidos por se localizarem em processos distas, como Gap43 (Figura 4). A detecção cruzada mínima de transcritos restritos ao soma indica alta pureza compartimental quando os inserts são manuseados cuidadosamente e revestidos com densidade ideal.
Os resultados positivos são caracterizados por: (1) morfologia neuronal intacta com clara extensão axonal, (2) separação limpa dos compartimentos sem ruptura da membrana, (3) primers validados que produzem separação distinta entre gotículas positivas e negativas, e (4) sinais fortes de RTddPCR para transcritos axonais. Experimentos subótimos resultam em baixo rendimento de RNA, contaminação cruzada evidenciada por marcadores soma em frações de neurita ou artefatos RTddPCR, como aumento da "chuva" de gotículas devido à dimerização do primer. Esses problemas geralmente estão ligados a danos na membrana do inserto, pressão excessiva de raspagem ou otimização inadequada da temperatura de recozimento do primer.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Visão geral do isolamento de RNA específico por compartimento usando inserções de membrana. Neurônios de roedores foram cultivados em inserções semipermeáveis com tamanho de poro de 1 a 3 μm, o que permite a extensão de neuritas enquanto restringe o soma. Para a preparação de neurônios inteiros, as células do compartimento superior foram raspadas usando um raspador celular estéril, peloteadas e então lisadas em TRIzol para isolamento de RNA, síntese de cDNA e RTddPCR. Resíduos celulares foram removidos da membrana inserida com um cotonete estéril. Para a preparação de neuritas, a membrana de inserção, agora contendo apenas neuritas, foi invertida e cortada com uma lâmina de bisturi, e imersa diretamente em TRIzol, seguida de isolamento de RNA, síntese de cDNA e RTddPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Curva padrão de concentração de RNA usando o ensaio RiboGreen. (A) A intensidade de fluorescência foi medida usando o ensaio de quantificação de RNA RiboGreen em uma série de padrões de RNA diluídos. Uma análise de regressão linear revelou uma forte correlação entre a concentração de RNA e o sinal de fluorescência (R² = 0,9956). O valor R² próximo a um demonstra excelente linearidade e confiabilidade do ensaio RiboGreen para quantificação precisa de RNA. (B) Usando a equação (y=19,738x + 14,905) para a inclinação obtida em A, o RNA total foi calculado para cada fração. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Validação do primer por PCR e eletroforese em gel de agarose. (A) Produtos de amplificação por PCR usando cDNA para Actγ e Gap43 foram resolvidos em um gel de agarose a 2% para avaliar a especificidade do primer. Para cada gene, dois conjuntos independentes de primers (conjunto 1 e conjunto 2) foram testados. Marcadores de tamanho de DNA (escadas) são mostrados em faixas adjacentes com pesos moleculares indicados (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Bandas simples distintas do tamanho esperado confirmam amplificação bem-sucedida e especificidade dos conjuntos de primários selecionados. (B) A amplificação por PCR foi realizada usando o primer Actγ ajustado 2 ao longo de um gradiente de temperatura (55-65 °C) para determinar a temperatura ideal de recozimento. Os produtos amplificados foram resolvidos em um gel de agarose a 2% ao lado de uma escada de DNA (faixa 2, tamanhos indicados). Bandas simples consistentes do tamanho esperado foram observadas em toda a faixa testada, com a amplificação mais forte detectada a 55 °C, sugerindo que essa é a temperatura ideal para esse conjunto de primers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Análise RTddPCR de transcritos selecionados e quantificação de cópias de mRNA. (A,B) Gráficos de amplitude representativos unidimensionais mostrando separação de gotículas para (A) Actγ e (B) Gap43. Cada ponto representa uma única gota, com gotas azuis indicando amplificação positiva e gotas cinza indicando amplificação negativa. O eixo Y representa a amplitude, e o eixo X indica a posição do poço na placa ddPCR. A clara separação entre gotículas positivas (azuis) e negativas (cinzas) confirma a detecção robusta dos transcritos alvo com os conjuntos de primers indicados. (C) Tabela resumindo o número de cópias/μL e cópias por ng de RNA total para transcritos Actγ e Gap43 em frações inteiras de neurônios e neuritas. As estimativas do número de cópias foram obtidas a partir da quantificação absoluta usando contagens de gotículas ddPCR (mostradas nos painéis A, B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>

Isolamento e Quantificação de MRNAs Axonais Usando Inserções de Membrana Porosa e RTddPCR

The spatial dynamics of mRNA localization and translation within neurons are essential for various mechanisms of neuronal function, including neuronal ...

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