Isolamento e Quantificação de MRNAs Axonais Usando Inserções de Membrana Porosa e RTddPCR

Nossa pesquisa estuda como a síntese local de proteínas é regulada e seus papéis na reparação, desenvolvimento e degeneração neural. Avanços recentes incluem técnicas de detecção de mRNA de alta sensibilidade, como o gdPCR, para identificar MRNAs axonais de baixa abundância e compartimentalizar culturas neuronais. Para começar, aliquota 250 microlitros de triazol em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro correspondente a cada inserto em um poço ou inserto de uma placa de seis poços.

Deixe os tubos de lado até ser necessário. Adicione dois mililitros de PBS estéril em cada poço de uma segunda placa de seis poços, garantindo que o número de poços ou placas coincida com o número de inserts. Pipete o meio de cultivo tanto pela parte inferior superior do inserto quanto transfira o inserto para a placa de seis poços contendo PBS.

Agora, usando pinças, coloque o inserto com cuidado e adicione dois mililitros de PBS por cima. Aspire o PBS dos dois lados e repeta para lavar duas vezes. Depois, deixe o encarte em PBS novo.

Em seguida, use um raspador de células estérils para raspar toda a fração de neurônios do topo do inserto. Pegue o soma lisado do inserto. Transfira para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro de 1,5 mililitro.

Centrifuge o tubo a 10.000 a 15.000 G por dois minutos. Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet em 250 microlitros de trizol. Rotule esse tubo como a fração inteira do neurônio.

Para coletar a fração de neurita, mova uma extremidade de um cotonete estéril lentamente, em um padrão em ziguezague, de cima para baixo, em todo o lado neurônio do inserto. Gire o inserto 90 graus e repita usando a outra ponta do swab. Depois, descarte o swab.

Use um novo swab e mova em círculos concêntricos, começando do centro do insert para fora, certificando-se de limpar também a circunferência. Inverta o insert para que o lado do neurite fique voltado para cima. Corte a membrana usando uma nova lâmina estéril de bisturi.

Coloque a membrana cortada na placa de seis poços contendo trizol, com o lado da neurita voltado para baixo. Certifique-se de que a membrana esteja submersa. Agora colete o trizol que contém o lisado de neurita do poço.

Transfira para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro de 1,5 mililitro. Prossiga com o isolamento de RNA ou armazene os lisados do soma e neurita a menos 80 graus Celsius para processamento posterior. Prepare reações digitais de transcrição reversa por gotícula PCR usando Gotlet Digital PCR Ready-To-Use Universal Mix e mire em primers específicos com DNA complementar apropriado.

Pipete a mistura de reação para o cartucho de geração de gotas. Depois, adicione o óleo de geração aos poços designados do cartucho. Agora, fele o cartucho com a junta.

Gerar as gotículas usando o gerador de gotas. Depois que as gotículas forem geradas, transfira-as para uma placa de PCR de 96 poços e fele com papel alumínio antes de colocar a placa no termociclador. Abra o software QX Manager para iniciar a análise.

Clique na opção Navegar e abra o arquivo para ser analisado. Quando o arquivo é carregado, a visualização do painel aparece no painel esquerdo. Selecione os poços de interesse segurando a tecla Control enquanto clica.

Clique em 1D Amplitude para visualizar um gráfico de pontos. Selecione Threshold Multiple Wells para aplicar o mesmo threshold a mais de um poço. Insira o valor limiar com base em onde se observa uma separação clara entre gotículas positivas e negativas.

Agora veja bem a seção de dados, mostrando a descrição da amostra, valores de concentração, número de gotículas aceitas, bem como contagens positivas e negativas de gotículas. Clique em Salvar para registrar os resultados do limiar. A quantificação de RNA usando o ensaio ribo verde revelou que frações inteiras de neurônios produziram 212,85 nanogramas de RNA por inserção, enquanto frações de neurita renderam 42,75 nanogramas.

A validação por PCR identificou o conjunto de primers um como o mais específico para a transcrição Gap43, mostrando uma única faixa distinta. Resultados ambíguos de PCR para Gamma-actina levaram a um teste de gradiente de temperatura usando o conjunto dois de primer, que mostrou amplificação mais forte a 55 graus Celsius. Gráficos de amplitude RT-ddPCR mostraram separação clara de gotículas para Gamma-actina tanto em amostras de neurônio inteiro quanto de neuritos, confirmando a detecção confiável de transcritos.

Para o Gap43, quase 23% do pool de mRNA está presente nos neuritos, em comparação com o Gamma-actina, onde apenas 5% do pool de mRNA está presente nos neuritos, em comparação com toda a fração de neurônios. Demonstramos a presença de estruturas de grânulos de estresse nos axônios sob condições fisiológicas, que inibem a síntese local de proteínas. Nosso protocolo oferece um método confiável e consistente para isolar compartimentos neuronais e detectar mRNAs de ambiente baixo.

Análises futuras focarão em isolar e caracterizar subdomínios axonais distintos, como cones de crescimento e eixo axonal além da análise em massa.