Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar quantitativamente a colocalização espacial de pares de alvos, neste caso, examinando o tráfego de receptores induzido por fármaco. Isso é realizado tratando células cultivadas vivas com fármaco para induzir alterações no tráfego de receptores. Como segundo passo, a dupla marcação imunológica dos receptores-alvo e dos compartimentos intracelulares de tráfego permite a localização espacial dos pares de alvos por microscopia confocal multicanal em seguida.

A análise quantitativa de colocalização é utilizada para medir a tendência dos receptores-alvo e compartimentos de serem encontrados no mesmo local. Os resultados mostram alterações no tráfego de receptores após o tratamento com fármacos com base na colocalização de receptores e compartimentos de tráfego intracelular. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a colocalização por sobreposição, é que ela fornece medidas quantificadas de colocalização, o que permite análises muito mais robustas e delineamentos experimentais complexos.

Embora este método possa fornecer informações sobre o tráfego de receptores, ele também pode ser aplicado para analisar alterações na colocalização espacial de praticamente quaisquer duas proteínas em células cultivadas. Para iniciar este procedimento, remova o meio de crescimento original e substitua-o por meio contendo a droga de interesse na concentração escolhida. Em seguida, incube as células nas condições originais de crescimento pelo tempo de tratamento escolhido.

Após a incubação, lave as células suavemente com um mililitro de tampão de lavagem cada vez, por três vezes. Fixe as células com 300 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS 0,1 molar por 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave novamente as células com um mililitro de tampão de lavagem cada vez, por três vezes.

Posteriormente, incubar as células em 300 microlitros de tampão bloqueador por duas horas à temperatura ambiente. Depois, incubar as células com o anticorpo primário em 300 microlitros de diluente para anticorpos por 48 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, lavar as células suavemente com um mililitro de tampão de lavagem cada vez, por três vezes.

Em seguida, incubar as células com anticorpo secundário conjugado a fluoróforo em 300 microlitros de diluente para anticorpo durante uma hora à temperatura ambiente, protegendo as células da luz. Após uma hora, lavar as células suavemente com um mililitro de tampão de lavagem cada vez, por três vezes. Para remover a lamínula da placa de 24 poços, segurar a placa a 45 graus.

Coloque a ponta de um par de pinças finas na borda superior da lamínula, onde ela encontra o fundo do poço. Em seguida, incline suavemente a lamínula no tampão de lavagem, afastando-a do fundo do poço. A lamínula irá repousar contra a parede do poço, onde pode ser facilmente removida com pinças.

Em seguida, monte as lamínulas com as células voltadas para baixo sobre lâminas de microscopia com meio de montagem antidesbotamento utilizando uma objetiva de alta magnificação de 100 x. Primeiro, localize uma célula representativa a ser capturada usando fluorescência epiluminiscente. Em seguida, configure as configurações de captura de imagem. Grave imagens tiff de oito bits sem compressão de cada canal marcado para imaginar cada canal sequencialmente e faça a média de quatro a seis varreduras para a imagem final.

Em seguida, mude para o caminho de imagem confocal e foque em um plano Z através do centro da célula. Otimize a potência do laser do pinhole e a tensão e o deslocamento do tubo fotomultiplicador para cada canal. Registre essas configurações e utilize as mesmas configurações para imagens de todas as células marcadas para qualquer par de alvos específico.

No mesmo replicato, localize as células a serem imagiadas com um objetivo de alta magnificação. Usando fluorescência epipolarizada, mude para o caminho de imagem confocal e foque em um plano Z através do centro da célula, se disponível. Use a função de corte de zoom do software para restringir a área de varredura à célula de interesse. Posteriormente.

Capture imagens para cada canal marcado usando as configurações previamente estabelecidas e repita os procedimentos para imagens de 15 ou mais células por condição por replicata. Para garantir uma coleta de amostra suficiente. Neste procedimento, abra o par de imagens de uma célula no ImageJ. Utilize o comando de mesclagem de canais de cor da imagem para gerar uma imagem RGB.

Em seguida, desenhe ao redor da célula de interesse. Utilize o plugin ImageJ SC Colocalization para quantificar a colocalização dos alvos na célula selecionada. Registre a medida de colocalização desejada e repita o procedimento para cada célula da imagem.

Em seguida, calcule a média dos valores de colocalização registrados das condições controle comuns de cada réplica de cada condição de marcação. Multiplique as médias por menos um para obter o deslocamento para cada réplica em cada condição de marcação. Em seguida, adicione o deslocamento de cada réplica em cada condição de marcação a cada valor de colocalização nessa réplica.

Isso normalizará os dados de forma que a medida média de colocalização para a condição controle comum seja zero em cada repetição de cada condição de marcação. Após isso, todos os dados de todas as repetições de cada condição de marcação permitirão a análise de alterações na colocalização entre as repetições. São mostradas aqui culturas primárias de neurônios sensoriais de gânglios da raiz dorsal que foram expostas a tratamentos prolongados e agudos com fármacos. As células foram então imunomarcadas para receptores de opioides delta e um marcador de endossomos reciclantes com pares distintos de anticorpos primários e secundários e foram imagiadas por microscopia confocal sequencial de dois canais.

Além da posterior análise e quantificação de colocalização, essas imagens representativas foram processadas para gerar mapas de colocalização em cores falsas mostrados aqui. Os escores médios de colocalização para receptores de opioides delta e marcadores de endossomos precoces, endossomos de reciclagem e lisossomos — colocalização do receptor com cada compartimento — são comparados entre grupos que receberam diferentes tratamentos agudos com fármacos, e observam-se as alterações induzidas por fármacos no tráfego receptorial. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de adquirir micrografias de alta qualidade e consistentes para permitir uma análise quantitativa válida.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar análise quantitativa de colocalização.