Rastreando alterações induzidas pela droga em Receptor de Pós-internalização Tráfico de Análise Colocalizational

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar quantitativamente a colocalização espacial de pares-alvo, neste caso, examinando o tráfego de receptores induzido por drogas. Isso é conseguido tratando células vivas cultivadas com drogas para induzir o tráfego de receptores alterados. Como segundo passo, a dupla imunomarcação dos receptores-alvo e dos compartimentos de tráfego intracelular permite a localização espacial dos pares de alvos por microscopia confocal multicanal.

A análise quantitativa de colocalização é usada para medir a tendência dos receptores e compartimentos alvo de serem encontrados no mesmo local. Os resultados mostram mudanças no tráfego de receptores após o tratamento medicamentoso com base na colocalização de receptores e compartimentos de tráfego intracelular. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a colocalização de sobreposição, é que ela fornece medidas quantificadas de colocalização, o que permite análises muito mais poderosas e projetos experimentais complexos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o tráfego de receptores, ele também pode ser aplicado a mudanças na colocalização espacial de praticamente duas proteínas em células cultivadas. Para iniciar este procedimento, remova o meio de crescimento original e substitua-o por um meio contendo o medicamento de interesse na concentração escolhida. Em seguida, incube as células nas condições originais de crescimento durante o período de tratamento escolhido.

Após a incubação, lave as células suavemente com um mililitro de tampão de lavagem de cada vez por três vezes. Fixe as células com 300 microlitros de formaldeído a 4% em PBS 0,1 molar por 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as células novamente com um mililitro de tampão de lavagem de cada vez por três vezes.

Em seguida, incube as células em 300 microlitros de tampão de bloqueio por duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, incubar as células com anticorpo primário em 300 microlitros de diluente de anticorpo por 48 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células suavemente com um mililitro de tampão de lavagem de cada vez por três vezes.

Em seguida, incube as células com anticorpo secundário conjugado ao flúor em 300 microlitros de diluente de anticorpos por uma hora em temperatura ambiente e proteja as células da luz. Após uma hora, lave as células suavemente com um mililitro de tampão de lavagem de cada vez por três vezes. Para remover a lamínula da placa de 24 poços, segure a placa de 45 graus.

Coloque a ponta de um par de pinças finas na borda superior da lamínula, onde ela encontra o fundo do poço. Em seguida, incline suavemente a lamínula de cobertura no tampão de lavagem para longe do fundo do poço. A lamínula ficará encostada na parede do poço, onde poderá ser facilmente removida com uma pinça.

Em seguida, monte as lamínulas com as células voltadas para baixo nas lâminas do microscópio com meio de montagem anti-desbotamento usando uma objetiva de alta ampliação de 100 x. Primeiro, localize uma célula representativa a ser fotografada usando epifluorescência. Em seguida, defina as configurações de captura de imagem Grave imagens tiff não compactadas de oito bits de cada canal rotulado para criar imagens de cada canal sequencialmente e obter uma média de quatro a seis varreduras para a imagem final.

Em seguida, mude para o caminho de imagem confocal e foque em um plano Z através do centro da célula. Otimize a potência do laser pinhole e a tensão e o deslocamento do tubo fotomultiplicador para cada canal. Registre essas configurações e use as mesmas configurações para criar imagens de todas as células rotuladas para qualquer par de destinos.

No mesmo Replicar as próximas células localizadoras a serem fotografadas com uma objetiva de alta ampliação. Usando epifluorescência, mude para o caminho de imagem confocal e concentre em um plano Z através do centro da célula, se disponível. Use a função de corte de zoom do software para restringir a área de varredura à célula de interesse. Depois.

Capture imagens para cada canal rotulado usando as configurações previamente estabelecidas e repita os procedimentos para criar imagens de 15 ou mais células por condição por replicação. Para garantir uma coleta de amostra suficiente. Neste procedimento, abra o par de imagens de uma célula na imagem J.Use o comando canais de mesclagem de cores da imagem para gerar uma imagem RGB.

Em seguida, desenhe ao redor da célula de interesse. Use a imagem j plugin a colocalização SC para quantificar a colocalização dos alvos na célula selecionada. Registre a medida de colocalização desejada e repita o procedimento para cada célula de imagem.

Em seguida, calcule a média dos valores de colocalização registrados das condições de controle comuns de cada réplica de cada condição de rotulagem. Multiplique as médias por menos um para obter o deslocamento para cada réplica em cada condição de rotulagem. Em seguida, adicione o deslocamento de cada réplica em cada condição de rotulagem a cada valor de colocalização nessa replicação.

Isso normalizará os dados de modo que a medida média de colocalização para a condição de controle comum seja zero em cada replicação de cada condição de rotulagem. Depois disso, todos os dados de todas as réplicas de cada condição de marcação permitirão a análise das mudanças na colocalização entre as replicações Aqui estão as culturas primárias de neurônios sensoriais dos gânglios da raiz dorsal que foram expostos a tratamentos medicamentosos prolongados e agudos. As células foram então imunomarcadas para receptores opióides delta e um marcador de endossomos de reciclagem com pares distintos de anticorpos secundários primários e foram visualizadas por microscopia confocal sequencial de dois canais.

Além da colocalização e análise quantitativa subsequentes, essas imagens representativas foram processadas para gerar mapas de colocalização de cores falsas mostrados aqui. Os escores médios de colocalização para receptores opióides delta e marcadores de endossomos precoces, endossomos de reciclagem e colocalização de receptores de lisossomos com cada compartimento são comparados entre grupos que recebem diferentes tratamentos medicamentosos agudos e são observadas alterações induzidas por drogas no tráfego de receptores. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adquirir micrografias consistentes de alta qualidade para permitir uma análise quantitativa válida.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a análise quantitativa de colocalização.