Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

O objetivo geral desses procedimentos é demonstrar como transferir com precisão células ou DNA para embriões de camundongos pós-implantação precoce. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como testar o potencial in vivo de células cultivadas in vitro e as funções de certos genes em estágios embrionários específicos. As principais vantagens dessas técnicas são que elas não requerem nenhum equipamento especializado e possibilitam manipulações experimentais de bryo de camundongo de plantação precoce Depois de sacrificar uma fêmea grávida no dia E 7.5 ou E 8.5 de acordo com o protocolo de texto, use tesoura e fórceps para isolar o útero e coloque-o em um prato de 30 milímetros preenchido com M dois meios com dois pares de pinças finas.

Rasgue cuidadosamente o miométrio e, em seguida, retire a decídua, tomando cuidado para não perfurar as cavidades embrionárias extras. Remova a membrana do riker usando uma pinça para beliscá-la e separá-la lentamente do embrião. Em seguida, sob um microscópio de dissecação estéreo, verifique os embriões para garantir que o âmnio do saco vitelino e o cone da placenta estejam intactos Com uma pipeta, transfira os embriões para uma placa limpa de M dois e coloque em uma tampa de placa de Petri de plástico de 30 milímetros no gelo ou em uma plataforma de gelo para resfriar parcialmente os embriões.

Preparar o meio de cultura e os embriões de cultura de acordo com o protocolo de texto para enxertar células cultivadas em embriões de camundongos. Comece usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros para raspar fisicamente as células-tronco de eblasto, que expressam de forma onipresente a GFP de uma placa de cultura de seis poços. Transfira as células para o prato que contém os embriões.

Prenda um capilar de enxerto puxado à mão ao tubo de aspiração para fazer uma pipeta bucal sugar suavemente a pipeta bucal para atrair um ou mais aglomerados de células com mais de 20 células para o capilar de enxerto. Em seguida, sopre suavemente as células para dispersar grandes aglomerados. Selecione uma touceira contendo cerca de 10 a 20 células e puxe-a para o capilar de enxerto.

Novamente, mantendo a touceira perto da abertura do capilar com uma pinça. Segure o embrião frouxamente no lugar e insira o capilar de enxerto na região de interesse. Para criar uma abertura.

Expulse suavemente o aglomerado para fora do capilar de enxerto, deixando a corda curta de 10 a 20 células alojadas no embrião. Deixe os embriões no mesmo prato de M dois meios e use um microscópio de dissecação de compostos de fluorescência e uma câmera para obter imagens dos embriões enxertados. Mantenha o tempo de imagem no mínimo para evitar a exposição dos embriões à luz e calor excessivos.

Imediatamente após a imagem usando uma pasta, transfira os embriões com um volume mínimo de M dois meios para o meio de cultura pré-equilibrado e cultura de acordo com as diretrizes do protocolo de texto antes de realizar experimentos de eletroporação, use uma micropipeta horizontal polar para puxar pipetas de injeção de DNA com uma ponta fina e uma abertura de menos de 10 micrômetros Para evitar danos aos tecidos. Para eletroporação capilar de vidro, use uma microforja para cortar a abertura das pipetas de injeção de DNA em um diâmetro interno de 20 ou 30 micrômetros com uma ponta limpa e sem bordas quebradas. Prenda cada eletrodo de platina a um fio isolado fino e insira-o em um porta-agulha de microinjeção coberto com fita isolante.

Para preparar um eletrodo capilar feito à mão, insira um fio de platina de 0,2 milímetro de diâmetro em um capilar de vidro de eletroporação com uma abertura fixa de 20 ou 30 micrômetros de diâmetro. Focalizar a corrente elétrica e entregar o DNA plasmático a uma pequena região de interesse no embrião. Para fazer um eletrodo em forma de L, dobre um fio de platina de 0,2 milímetro de diâmetro, criando uma forma de L com a porção horizontal do L em torno de um milímetro de comprimento.

Monte os porta-agulhas em porta-instrumentos de micromanipulação padrão. Conecte o eletrodo capilar ao ânodo da fonte de alimentação. Conecte o eletrodo em forma de L ao ânodo do multímetro.

Em seguida, conecte o cátodo do multímetro ao cátodo da fonte de alimentação. Encha o capilar de vidro de eletroporação com PBS até um a dois milímetros do topo e insira o eletrodo de platina reto no capilar de vidro até atingir o fundo do capilar. Ancorar o eléctrodo em forma de L na superfície da placa de Petri de 30 milímetros preenchida com PBS.

Use uma bomba pneumática pico para injeção de DNA. Insira a agulha de injeção do eblasto lateral na cavidade amniótica do embrião e injete aproximadamente cinco microlitros de solução de DNA na cavidade ou até que esteja completamente cheia. Tome cuidado para não estourar o embrião.

Em seguida, posicione cuidadosamente o embrião entre os eletrodos e mova o eletrodo capilar para o local preciso onde o DNA deve ser entregue. Usando 200 volts em seis pulsos a cada 50 milissegundos de duração, eletroporou o embrião com um intervalo de um segundo entre cada pulso. Transfira imediatamente o embrião para um meio de cultura pré-equilibrado antes de repetir a eletroporação para o próximo embrião.

Detecte células vivas ou mortas eletroporadas duas horas após a eletroporação. De acordo com o protocolo de texto mostrado aqui, há um embrião com epi PSCs expressando EGFP de forma ubíqua enxertado em E 7.5 e cultivado ex vivo por 24 horas. Quando 10 a 16 fscs foram enxertados em embriões E 7.5, eles se incorporaram e proliferaram bem dentro do embrião hospedeiro.

No entanto, enxertar mais células não resulta em melhor quimerismo e, de fato, resulta em aglomerados não incorporados, como demonstrado aqui. Como mostrado nesta eletroporação de plasmídeos que expressam GFP. Células positivas para GFP foram detectadas uma a duas horas após a eletroporação.

Quando as células eblásticas distais no embrião do estágio primitivo tardio da raia foram eletroporadas, as células marcadas contribuíram para a derme neural após 24 horas em cultura, o que corresponde aos mapas de destino conhecidos das células eblásticas em embriões em estágio gastro. Esta figura mostra que, semelhante ao uso de outros tipos de eletrodos para eletroporação, o eletrodo capilar também causou algum grau de morte celular na região-alvo. Como essa região parecia mais escura em comparação com as regiões vizinhas, rotulando os núcleos das células mortas com uma matriz de fluorescência vermelha distante impermeável à membrana.

Confirmou que a técnica de eletroporação capilar resulta em apenas um pequeno número de células mortas perto do local da eletroporação. Ao tentar esses procedimentos, é importante começar a cultivar os embriões dentro de duas horas. Depois de isolar o útero dos camundongos no final da cultura, os embriões podem ser corrigidos.

Outros métodos, como a coloração por secção, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a contribuição de um doador ou células eletrotrançadas para os embriões hospedeiros. Depois de assistir a este vídeo, devemos ter uma boa compreensão de como transferir com precisão as células de nosso DNA para embriões de camundongos pós-implantação precoce.