Name: Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda eletroporação in utero em camundongos para transfecção gênica espaciotemporal controlada no sistema nervoso central embrionário. Este método permite visualização precisa com fibra óptica e eletrodos especializados para estudar desenvolvimento cerebral.

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Este trabalho foi financiado pela RIKEN Cérebro Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (atribuído ao TS) e Programa de Pesquisa Riken Júnior Associado (JRA, concedido a MK) RIKEN Cérebro Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (atribuído ao TS) e RIKEN Júnior Programa de Pesquisador Associado (JRA, concedido a MK) financiou este trabalho.

1. Preparação da solução capilar e DNA para injecção <ol><li> Purificar DNA plasmídeo com um Maxi-prep ou método equivalente, e fazer uma concentração final de 2-3 mcg / mL. Alíquota de 100 mg de DNA, adicionar 10μl do corante verde rápido (1% de ações) e TE (10 mM Tris Base, 1mM EDTA Solution, pH 8.0) e ajustar o volume para 100 ml para fazer a concentração final para DNA mix de injeção para 1μg / mL. A concentração de DNA plasmidial podem ser alteradas depende do tamanho do plasmídeo, e também a sua eficiência de transfecção, que precisa ser testado individualmente. </li><li> Girar a solução de DNA por 5 minutos a 14.000 RPM à temperatura ambiente e recolher o sobrenadante para remover qualquer resíduo. </li><li> Puxar um capilar de vidro tubos de vidro tubea capilar utilizando um extrator de micropipeta. Belisque a ponta com uma pinça para fazer a ponta tem um diâmetro M 20-30. Medida 800 M-1 mm da ponta e verifique o diâmetro externo é menor que 60 mm (Fig. 1A). </li><li> Conectar o capilar ao micromanipulador, e encha com óleo mineral. Para preencher o capilar com a solução de DNA, mergulhe a ponta na solução e sugar até a solução de DNA. </li></ol> 2. Vara eletrodos de platina Aqui usamos eletrodos revestidos de platina (Nepe gene, CUY611P2-1) para electroporate em região superficial do cérebro, como o córtex (Fig. 1F). 3. Preparação de micro-eletrodos Use micro-eletrodos para electroporated em partes profundas do cérebro (ie, o tálamo eo hipotálamo) (Fig. 2B-E). <ol><li> Uma extremidade do tungstênio (para eletrodos negativos) e platina (para eletrodos positivos) é enrolado em fios dourados e os pinos fixados com parafilme. Insira o fio à haste de um cotonete e embrulhar ambas as extremidades com parafilme (Figura 1B). </li><li> Uniformemente aguçar a ponta do fio com lixa até atingir 20-30 mM diâmetro externo e 60 mm de 800 M-1 mm da ponta (Fig. 1C e D). </li><li> Aplique uma camada fina de unha polonês para o fio para o isolamento. Após a unha polonês secar, use um cotonete embebido em acetona para removê-lo da ponta (cerca de 200 mM da ponta). Importante: A fim de evitar danos ao útero do rato, a parte dentro de 800 M-1 mm da ponta não deve ter mais de 70 m de diâmetro (Fig. 1E). </li></ol> 4. Preparação da cirurgia <ol><li> Anestesiar um rato grávidas (E9.5-E15.5). Demonstramos anestesiados com pentobarbital sódico grau farmacêutico (Tabela II, 50 mg por grama de peso corporal, injetar intraperitonealmente e aguarde 5 min). Alternativas para pentobarbital sódico como um anestésico Ketamina incluem injeção / Xilazina ou anestésicos de gás (gás é preferível para os procedimentos de curta duração). A injecção deve ser feito com atenção para evitar quaisquer órgãos, caso contrário ele irá causar danos para o útero ou matar animais. Quando IP sucesso é feito, a taxa de sobrevivência é mais do que 95%. Também a cirurgia pode ser realizada ao ar livre no meio ambiente. Antes de iniciada a operação, teste para a falta de resposta do animal a beliscar seus pés para confirmar anestésico. </li><li> Raspar o cabelo do abdômen com uma lâmina de barbear e EtOH 50%. Prepare a pele com a alternância de scrubs de betadine e álcool (70%). </li><li> Faça uma incisão na linha média abdominal com uma tesoura fina e retire todos os cornos uterinos com cuidado sobre a 37 ° C pré-aquecido tampão fosfato (PBS)-umedecidos gaze de algodão, que é colocado em torno da ferida. Manter a umidade do útero com PBS de todos os tempos. </li><li> Segure um cabo de fibra óptica flexível entre os dedos indicador e médio e colocá-lo sob o corno uterino. Cabo limpo com EtOH 70% antes do uso. Sem microscópio ou lupa é necessário para visualização. Útero posição entre o cabo de fibra óptica a luz óptica eo polegar, e aperte suavemente para empurrar para cima o embrião mais perto da parede uterina. </li></ol> 5. Injeção de DNA e eletroporação <ol><li> Quando embrião é posicionado, insira capilar de vidro cuidadosamente em ventrículo-alvo e injetar cerca de 1 mL de solução de DNA (Fig. 2A). </li><li> Eletroporação para a parte superficial da brainIf usando com eletrodos revestidos de platina para electoporation, coloque os eletrodos fora do útero e aplicar sugerido de onda quadrada pulsos de corrente de acordo com a instrução de fabricação (Tabela I). Se usingFor eletroporação a parte mais profunda do cérebro, eletroporação nmicro, eletrodos tipo eedle são usados. Iinsert um eletrodo de tungstênio fino negativo em DNA injetado ventrículo e um eletrodo de platina para o útero e região-alvo lugar entre dois eletrodos, em seguida, aplicar sugerido de onda quadrada pulsos de corrente (Tabela I) (Fig. 2B). </li></ol> 6. Eletroporação pós <ol><li> Coloque o corno uterino de volta em sua origlocalização inal com e adicionar 500 mL de 37 ° C pré-aquecido PBS. </li><li> Sutura a camada interna com sutura cirúrgica e camada externa estreita com um clipe autoclipauto 9 mm. </li><li> Animais colocar em uma almofada de aquecimento por 2 horas para permitir a recuperação da anestesia. Analgésicos como o carprofeno ou buprenorfina pode ser administrada para a dor pós-operatória. </li></ol> 7. Resultados representativos: Alguns exemplos de eletroporação cortical de pCAG-EYFP construir usando eletrodos de platina vara em momentos diferentes são mostradas na figura Figura 32. Cérebros são electroporated na E13.5, E14.5 e E15.5, e colhida no dia pós-natal (P) 6. ÅO coloração ntibody de RORc revela a posição da camada 4 e posição das células transfectadas EYFP são revelados por GFP coloração de anticorpos, e ambas as imagens são super impostas (Fig. 3A e B). Rotulados células corticais são camada de células corticais electroporated é claramente diferente em cada experimento (Fig. 32), o que sugere dependente do tempo eletroporação faz cortical camada específica GOF / LOF possível. A viabilidade de embriões e eficiência de transfecção de células varia dependendo da idade do embrião e do local de eletroporação. Amostras estão apresentadas na Tabela 1, no entanto, as condições devem ser otimizados para cada eletroporação dependendo do estágio e parte do cérebro. Eletroporação em tecidos profundos, tais como tálamo eo hipotálamo com o uso de eletrodos de platina pau muitas vezes dar baixa eficiência (Tabela 1). Este problema pode ser resolvido usando micro-eletrodos whichelectrodes, que chegará às partes profundas do cérebro. Figura 3 4 exemplo mostra de pCAG-EYFP eletroporação no diencéfalo desenvolvimento. Solução de DNA plasmídeo é injetado no 3 º ventrículo na E11.5 e seguido por micro eletroporação (Fig. 3C4C). A área é restrita electroporated no tálamo, onde a maioria do projeto axônios para o córtex (Fig. 3B4B). Axon projeção para camada 4 do córtex também pode ser visualizado por EYFP, que fillesfills o neurônio inteiro. (Fig. 3A4A). <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquemática dos desenhos animados demonstrando a forma correta do capilar. (A) Um tubo capilar de vidro é puxado através de um puxador de micropipeta para fazer certa forma. Uma dica é off prensado por uma pinça para torná-lo 20-30 mM. Medida 800 M-1 milímetro da ponta (faixa vermelha) e certifique-se que o diâmetro externo é menos de 60 mm (faixa verde). (B) end Um dos fios de tungstênio ou platina é enrolada em pinos banhados a ouro e fixado com parafilme. Em seguida, use uma lixa para fazer sua ponta para se tornar 20-30 mM diâmetro externo e 60 mm a partir de 1 mm da ponta. (C) Imagem do fio de tungstênio antes shaping. (D) Imagem do fio de tungstênio após a modelagem. (E) Imagem do fio de tungstênio após a aplicação de fina camada de unha polonês. Barra de escala em E é de 10 mM (menor escala) para CE. (F) Stick eletrodos de platina (Nepa gene. CUY611P2-1). Barra de escala em F é de 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura esquema dos desenhos animados 2. Procedimento cirúrgico. (A) Diagrama de injecção ventrículo lateral ou embriões de grandes dimensões (lado esquerdo) e em 3 º ventrículo ou embriões pequenos (lado direito). (B) Diagrama de electrporation pelo eletrodo de platina stick (lado esquerdo) e com agulha de eletrodo tipo (lado direito). <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Desenvolvimento do mouse telencéfalo foi electroporated com pCAG-EYFP no E13.5 (A), E14.5 (B) e E15.5 (C) e colhidas em P6. Cérebros foram seccionados coronal e corados com GFP anticorpo ou anticorpos RORc separadamente e imagens são mesclados. (A) de Eletroporação pCAG-EYFP plasmídeo em E13.5 transfectar muitos camada 4 neurônios. que se sobrepõem a camada de 4 marcadores RORc. (B) de Eletroporação pCAG-EYFP plasmídeo de células E14.5 transfecção, que são mais superficiais do que os neurônios da camada 4. (C) E15.5 eletroporação rótulo muitos neurônios superficial, como camada 2 / 3. Barra de escala 200 mM. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Transfection da EYFP em tálamo-cortical axônios (TCA). (A) terminus TCA na camada cortical 4 é revelado por GFP coloração de anticorpos. RORc coloração do anticorpo é usado para revelar uma posição de camada 4. Ambas as imagens são tiradas de mesma seção e se fundiram. (B) Posição da eletroporação para o tálamo também é indicado pelo GFP coloração de anticorpos e coloração RORc, que a expressão é restrita no tálamo 11. (C) esquema dos desenhos animados para a eletroporação talâmica e projeção TCA são mostrados. Barra de escala 200 mM.

<ol><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li>
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<li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li>
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<li>Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).</li>
<li>Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally-controlled+site-specific+mutagenesis+in+the+basal+layer+of+the+epidermis%3A+comparison+of+the+recombinase+activity+of+the+tamoxifen-inducible+Cre-ERT+and+Cre-ERT2+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases.</a> Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo, apenas descreveu os benefícios da técnica de transfecção pCAG-EYFP na área restrita de um cérebro pequeno embrionárias usando diferentes eletrodos em forma. Para comparação da eficiência de transfecção pelo promotor diferente é descrito anteriormente, o que mostra a especificidade de células do tipo 1. No entanto, existem limitações para a técnica, tais como a transfecção é apenas transitória e varia depender do plasmídeo, que não tem qualquer especificidade celular e é difícil controlar o número de células transfectadas. ThereforeHowever, combinando este protocolo com outras técnicas ainda mais possibilidades de fornecer métodos de manipulação diferentes. Primeiro, incorporando promotor célula específica no DNA plasmídeo permitirá célula do tipo de transfecção específicos, tais como neurônios, células gliais e astrócitos. Segundo, uma vez que a transfecção é transitória, não é adequado para cientistas que queiram analisar a função do gene mais tarde na vida. Portanto, a combinação com um transposase fazer DNA plasmídeo integrar o genoma irá convertê-lo em um transfecção estável 8. Adoção, ao lado do tet tet-on ou off-sistema, será possível manipular o tempo ou célula tipo específico de expressão gênica em células neurais 8. Alternativamente, pode-se combinar este protocolo com tamoxifeno induzível por Cre-ER (T) recombinases 9 e ratos repórter 10. Esta ampla acessibilidade dos tecidos vai mudar drasticamente projetos experimentais usados ​​em neurociência.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> diâmetro do fio desencapado de tungstênio 125 M </td><td> Sistemas AM </td><td> 797600 </td></tr><tr><td> diâmetro do fio desencapado de platina 125 mM </td><td> Sistemas AM </td><td> 767000 </td></tr><tr><td> Eletrodos revestidos </td><td> Nepa gene </td><td> CUY610P4-1 </td></tr><tr><td> tubo capilar de vidro </td><td> Stoelting </td><td> 50611 </td></tr><tr><td> micromanipulador </td><td> KD Scientific </td><td> KDS310 </td></tr><tr><td> tesoura </td><td> ROBOZ </td><td> RS-5865 </td></tr><tr><td> gerador de pulso </td><td> Sistemas de AM </td><td> Modelo 2100 </td></tr><tr><td> 9 milímetros autoclip </td><td> ROBOZ </td><td> RS-9260 </td></tr><tr><td> banhado a ouro pinos </td><td> WPI </td><td> 5482 </td></tr><tr><td> Anticorpo RORc </td><td> Perseus Proteomics </td><td> H3925 </td></tr></tbody></table>

mouse no utero eletroporação: transfecção gênica controlled spatiotemporal

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A fim de compreender a função de genes expressos em região específica do cérebro em desenvolvimento, incluindo moléculas de sinalização e orientação moléculas axônio, a transferência de genes local ou knock-out é necessária. Gene targeting knock-in knock-out ou em regiões local é possível realizar com a combinação com uma linha específica CRE, que é trabalhoso, caro e demorado. Portanto, um método de transfecção simples, uma em técnica de eletroporação útero, que pode ser realizada com curto período de tempo, será útil para testar a possível função de genes candidatos antes da geração de 1,2 animais transgênicos. Além disso, em eletroporação utero alvos áreas do cérebro onde nenhuma linha específica CRE existe, e vai limitar letalidade embrionária 3,4. Aqui, apresentamos um método de eletroporação no útero da combinação de dois diferentes tipos de eletrodos para a transferência de genes simples e conveniente em áreas-alvo do cérebro em desenvolvimento. Primeiro, um método de realização única de embriões utilizando um cabo de fibra óptica a luz óptica vai criar embriões pequenos (de E9.5) visível para injeção de DNA alvo em solução ventrículos e tipo de agulha de inserção de eletrodos para a área do cérebro alvo 5,6. A padronização do cérebro, tais como área cortical ocorrer na fase embrionária precoce, portanto, estes eletroporação início da E9.5 fazer uma grande contribuição para entender evento padronização toda área. Segundo, a forma precisa de um capilar evita danos uterina, fazendo buracos através da inserção do capilar. Além disso, a forma precisa dos eletrodos de agulha são criados com o tungstênio e fio de platina e afiada usando o papel da areia e isolados com unha polonês 7, um método que é descrito em detalhes neste protocolo. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmidial em áreas restritas do cérebro e vai permitir embriões pequenos para serem electroporated. Isso vai ajudar a, abrir uma nova janela para muitos cientistas que estão trabalhando na diferenciação celular, migração celular, a orientação dos axônios em muito cedo estágio embrionário. Além disso, esta técnica permitirá aos cientistas transfecção de DNA plasmidial em partes profundas do cérebro em desenvolvimento como o tálamo eo hipotálamo, onde muitos não específicas da região linhas CRE existem para ganho de função (GOF) ou perda de função (LOF) analisa.

Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

A fim de compreender a função de genes expressos em regiões específicas do cérebro em desenvolvimento, incluindo moléculas de sinalização e de orientação axonal...

O objetivo geral deste procedimento é obter uma transfeção gênica eficiente no sistema nervoso central de camundongos embriões em um ponto temporal de desenvolvimento e uma região cerebral desejados. Isso é conseguido primeiramente pela preparação de capilares de precisão e eletrodos do tipo agulha para prevenir danos uterinos. O segundo passo do procedimento consiste em aprender um método exclusivo de sustentação dos embriões utilizando um cabo de luz de fibra óptica para visualizar embriões pequenos e realizar a injeção direcionada de DNA.O terceiro passo do procedimento é realizar eletroporação com eletrodos do tipo bastão sobre a superfície uterina, a fim de transfectar o DNA em partes superficiais do cérebro; o passo final do procedimento é realizar eletroporação com eletrodos do tipo agulha em estruturas mais profundas do cérebro, como o tálamo e o hipotálamo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram camada cortical, transfeção específica ou transfeção eficiente no tálamo. A principal vantagem dessa técnica em comparação com métodos existentes, como a injeção regular em posição neutra, é a maior visibilidade e controle do local de injeção dos embriões no útero.Utilizamos um cabo semelhante a uma fibra óptica, que permite visualizar embriões a partir do E 9,5 e agulhas hipodérmicas para transmitir DNA plasmidial para partes mais profundas do cérebro, como o tálamo e o hipotálamo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o desenvolvimento cerebral, tais como diferenciação neuronal, padronização do cérebro e conectividade neural. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque é complicado moldar a agulha, o eletrodo e posicionar corretamente o conjunto.O útero e os embriões. A demonstração visual deste método é essencial para observar como fabricar eletrodos de agulha precisos e como posicionar os embriões para a eletroporação. Uma vez que essas duas etapas são fundamentais para obter resultados bem-sucedidos. Para preparar as capilares, utilize um puxador de micropipetas de acordo com as instruções do fabricante.Neste procedimento, utilizamos tubos capilares de vidro de um milímetro de diâmetro sem fibra interna. As micropipetas puxadas devem ter entre 800 micrômetros e um milímetro de comprimento a partir da ponta, com diâmetro externo inferior a 60 micrômetros, utilizando um microscópio estereoscópico; em seguida, com pinça, quebre as pontas das micropipetas até atingir um diâmetro entre 20 e 30 micrômetros. Meça cada micropipeta utilizando um micrômetro.Em seguida, prepare microeletrodos por enrolamento. Enrole uma extremidade de um fio de tungstênio ao redor de um pino revestido a ouro. Utilize fio de tungstênio para eletrodos negativos e fio de platina para eletrodos positivos.Fixe o fio ao pino com param. Em seguida, insira o fio no cabo plástico de um cotonete e enrole ambas as extremidades com phim. Afine a ponta do fio com lixa fina até atingir de 20 a 30 micrômetros na ponta e 60 micrômetros entre 800 micrômetros e um milímetro da ponta. Novamente, verifique as dimensões finais com um micrômetro.Em seguida, mergulhe o fio afiado em uma gota de esmalte para unhas para aplicar uma camada fina em todo o fio, como isolamento. Após a secagem do esmalte, utilize um cotonete com acetona para removê-lo dos últimos 200 micrômetros da ponta do fio. Os eletrodos de platina são adquiridos prontos e não requerem preparação.Neste procedimento, utilizamos o eletrodo de gene CUY seis 10 P quatro traço um nepo para purificar o DNA plasmidial com um método maxi prep ou equivalente, eluir 100 microgramas de DNA em um novo tubo e adicionar 10 microlitros de corante azul de poliacrilamida a 1%. Utilize tampão TE para ajustar o volume até 100 microlitros, obtendo uma concentração final de um micrograma por microlitro de DNA plasmidial. Misture a solução suavemente por pipetagem, em seguida centrifugue a solução de DNA por cinco minutos a 14.000 RPM em temperatura ambiente para remover impurezas e sais.Transfira o SNAT para um novo tubo. A solução de DNA pode ser mantida à temperatura ambiente no tubo durante todo o procedimento. Em seguida, conecte uma micropipeta puxada a um micromanipulador de acordo com as instruções do fabricante e submerja a ponta da micropipeta na solução de DNA para preenchê-la.Coloque cuidadosamente o micromanipulador de lado e prepare-se para a cirurgia antes da cirurgia. Pese um camundongo grávido nos dias embrionários 9,5 a 15,5 para determinar o peso corporal.Em seguida, intraperitoneal. Injetar pentobarbital sódico de grau farmacêutico na dose de 50 microgramas por grama de peso corporal e aguardar cinco minutos. Alternativas ao pentobarbital sódico podem incluir cetamina, xilazina, injeção ou anestésicos gasosos.Após a anestesia, use uma lâmina de barbear e etanol 50% para remover os pelos do abdômen. Prepare a pele com esfregaços alternados de Betadine e álcool 70%. Faça uma incisão na linha média abdominal com tesoura fina.Retire cuidadosamente todos os cornos uterinos para uma gaze de algodão umedecida com solução salina tamponada com fosfato 1x ou PBS, colocada ao redor da ferida. Mantenha o útero úmido com PBS o tempo todo. Utilizando um cabo de fibra óptica flexível.Coloque o cabo sob o corneto uterino. Posicione o útero entre a luz da fibra óptica e o polegar e comprima suavemente para empurrar o embrião para cima, aproximando-o da parede uterina. Quando o embrião estiver posicionado com a cabeça à esquerda e voltada para cima, insira cuidadosamente a capilar de vidro no ventrículo-alvo e injete aproximadamente um microlitro de solução de DNA para eletroporação da camada cortical quatro no dia 13,5 de desenvolvimento embrionário.Posicione os eletrodos de platina em formato de haste do lado de fora do útero e aplique pulsos de corrente em onda quadrada cinco vezes usando 38 volts por 50 milissegundos. Se estiver usando eletroporação micro para atingir o tálamo ou hipotálamo no dia embrionário 10,5, insira o eletrodo negativo fino de tungstênio no ventrículo injetado com DNA e o eletrodo positivo de platina no útero. Posicione a região-alvo entre as extremidades de ambos os eletrodos e aplique os pulsos de corrente em onda quadrada sugeridos três vezes a sete volts por 100 milissegundos.Após a eletroporação ser concluída, retorne o corno uterino à sua localização original e adicione 500 microlitros de PBS. Suture a camada interna da incisão com um fio cirúrgico. Em seguida, feche a camada externa com um clipe automático de nove milímetros.Coloque o camundongo sobre uma placa aquecida por duas horas para permitir a recuperação da cirurgia e da anestesia. A eletroporação com platina da região cortical é mostrada aqui aplicada nos dias embrionários 13,5, 14,5 e 15,5. Os cérebros foram coletados no período pós-natal.Dia seis. A camada de células corticais eletroporadas é claramente diferente em cada experimento. O que sugere que a eletroporação dependente do tempo torna possível o ganho e a perda de função específicos para camadas corticais.Como mostrado aqui, a eletroporação em um tecido profundo, como o tálamo e o hipotálamo. O uso de eletrodos de platina frequentemente apresenta baixa eficiência ao utilizar microeletrodos para eletroporação. Esses tecidos profundos oferecem melhor eficiência e viabilidade.Injetamos uma solução de DNA plasmidial no terceiro ventrículo de embriões de camundongo. No dia embrionário 11,5, aplicamos eletroporação com agulha restrita ao tálamo, pois a maior parte dos éxons do tálamo projeta-se para a córtex até o sexto dia pós-natal. Aqui mostramos a microeletroporação P-C-A-G-E-Y-F-P na cefála em desenvolvimento.A região do tálamo é mostrada por RORC, que marca todos os neurônios pós-mitóticos talâmicos. As projeções axonais indicadas com setas brancas em direção à camada IV da córtex também podem ser visualizadas por EYFP, que preenche todo o neurônio. A posição da camada IV na córtex também é marcada pelo anticorpo anti-RORC.Uma vez iniciada a MA, esta técnica pode ser realizada em 15 minutos por litro, se for executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular o seu teste com muito cuidado para evitar qualquer dano após este procedimento. Outros métodos, como a incorporação de um cromóforo específico no DNA mitocondrial, podem ser realizados para compreender o mecanismo molecular da especificação celular após o seu desenvolvimento.Essa técnica, onda de toque, fornece aos pesquisadores na área do desenvolvimento do sistema nervoso central uma ferramenta para explorar os mecanismos moleculares envolvidos no padrão, no crescimento axonal e na formação de circuitos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

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No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

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Transdução viral in utero em camundongo

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Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar especificamente diferentes regiões do sistema nervoso central C57BL/6 por meio de eletroporação in utero. Incluídas neste protocolo estão instruções detalhadas para transfecções de regiões que se desenvolvem no córtex, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo septal lateral e estriado.

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Neste protocolo, descrevemos como injetar a cavidade amniótica do camundongo no E7.5 com lentivírus, levando à transdução uniforme de toda a placa neural, com efeitos mínimos prejudiciais sobre a sobrevivência ou desenvolvimento embrionário.

Placa neural de Murine Alvo por In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) no Dia Embrionário 7.5

Aqui descrevemos um método tempo-específico para manipular efetivamente vias críticas de desenvolvimento na placenta de camundongos in vivo. Isto é realizado através da injeção e eletroporação de plasmídeos CRISPR nas placentas de fêmeas grávidas no dia embrionário 12.5.

Mouse In Vivo Placental Alvo CRISPR Manipulação

Aprenda eletroporação in utero em camundongos para transfecção gênica espaciotemporal controlada no sistema nervoso central embrionário. Este método permite visualização precisa com fibra óptica e eletrodos especializados para estudar desenvolvimento cerebral.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

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