Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

O objetivo geral deste procedimento é obter uma transfecção gênica eficiente no sistema nervoso central do camundongo embrionário em um ponto de tempo e área de desenvolvimento desejados do cérebro. Isso é feito primeiro preparando capilares de precisão e eletrodos do tipo agulha para evitar danos uterinos. A segunda etapa do procedimento é aprender um método único de retenção de embriões usando um cabo de fibra óptica para visualizar pequenos embriões para injeção de DNA direcionada.

A terceira etapa do procedimento é realizar a eletroporação com eletrodos do tipo bastão na superfície uterina para transfectar o DNA em partes superficiais do cérebro, a etapa final do procedimento é realizar a eletroporação com eletrodos do tipo agulha em estruturas mais profundas do cérebro, como o tálamo e o hipotálamo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram camada cortical, transfecção específica ou transfecção eficiente no tálamo. A principal vantagem desta técnica sobre as bagunças existentes como regular, em lação neutra, é ter maior visibilidade e controle do local de lação dos embriões no útero.

Usamos um cabo semelhante a fibra óptica, que possibilita a visualização de embriões de E 9.5 e hipoglicemias de agulha para transmitir DNA de plasmídeo para partes mais profundas do cérebro, como tálamo e hipotálamo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o cérebro em desenvolvimento, como diferenciação neuronal, padrões cerebrais, conectividade neural. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é difícil moldar a agulha, a estrada elétrica e a posição coletiva.

O útero e os embriões A demonstração visual deste método é fundamental para ver como fazer eletrodos de agulha precisos e como posicionar os embriões para livre de eletros. Uma vez que essas duas etapas são fundamentais para resultados bem-sucedidos. Para preparar os capilares, use um extrator de micropipeta de acordo com as instruções do fabricante.

Neste procedimento, usamos tubos capilares de vidro de um milímetro sem fibra interna. As agulhas puxadas devem medir de 800 micrômetros a um milímetro da ponta com um diâmetro externo inferior a 60 micrômetros usando um microscópio de dissecção e pinças para arrancar as pontas da agulha com um diâmetro de 20 a 30 micrômetros. Meça cada agulha usando um micrômetro.

Em seguida, prepare microeletrodos enrolando. Uma extremidade de um fio de tungstênio em torno de um alfinete banhado a ouro. Use fio de tungstênio para eletrodos negativos e fio de platina para eletrodos positivos.

Fixe o fio no pino com parâmetro. Em seguida, insira o fio na haste plástica de um cotonete e enrole as duas pontas com phim, afie uniformemente a ponta do fio com uma lixa fina até atingir 20 a 30 micrômetros na ponta e 60 micrômetros entre 800 micrômetros e um milímetro da ponta. Novamente, verifique as dimensões finais com um micrômetro.

Em seguida, mergulhe o fio afiado em uma gota de esmalte para aplicar uma camada fina em todo o fio para isolamento. Depois que o esmalte estiver seco, use uma acetona para cotonete para removê-lo dos últimos 200 micrômetros do bastão de ponta. Os eletrodos de platina são comprados pré-fabricados e não precisam de preparação.

Neste procedimento, usamos o eletrodo de gene CUY six 10 P four dash one nepo Purificar o DNA plasmático com uma preparação maxi ou método equivalente, eloqüente 100 microgramas de DNA em um novo tubo e adicionar 10 microlitros de corante verde rápido a 1%. Use TE para aumentar o volume para 100 microlitros para uma concentração final de DNA plasmático de um micrograma por microlitro. Misturar a solução delicadamente pipetando o cabeçalho e, em seguida, centrifugar a solução de ADN durante cinco minutos à temperatura ambiente de 14 000 RPM para remover as impurezas e os sais.

Transfira o SNAT para um novo tubo. A solução de DNA pode ser mantida em temperatura ambiente no tubo durante todo o procedimento. Em seguida, conecte uma agulha puxada a um micromanipulador de acordo com as instruções do fabricante, mergulhe a ponta da agulha na solução de DNA para encher a agulha.

Deixe cuidadosamente o micromanipulador de lado e prepare-se para a cirurgia antes da cirurgia. Pese um camundongo prenhe em dias embrionários. 9,5 a 15,5 para determinar o peso corporal.

Em seguida, intraperitoneal. Injete pentobarbital sódico de grau farmacêutico a 50 microgramas por grama de peso corporal e peso por cinco minutos. Alternativas ao pentobarbital sódico podem incluir cetamina, xilazina, ejeção ou anestésicos gasosos.

Após a anestesia, use uma lâmina de barbear e 50% de etanol para raspar o cabelo do abdômen. Prepare a pele com esfoliantes alternados de Betadine e álcool 70%. Faça uma incisão na linha média abdominal com uma tesoura fina.

Puxe todos os chifres uterinos cuidadosamente para A one x solução salina tamponada com fosfato ou gaze úmida e de algodão PBS colocada ao redor da ferida. Mantenha o útero úmido com PBS o tempo todo. Usando um cabo de fibra óptica flexível.

Coloque o cabo sob o corno uterino. Posicione o útero entre a luz de fibra óptica e o polegar e aperte suavemente para empurrar o embrião para mais perto da parede uterina. Quando o embrião estiver posicionado com a cabeça à esquerda e voltada para cima, insira o capilar de vidro cuidadosamente no ventrículo alvo e injete aproximadamente um microlitro de solução de DNA para eletroporação da camada cortical quatro No dia embrionário 13.5.

Coloque os eletrodos de platina fora do útero e aplique pulsos de corrente de onda quadrada cinco vezes usando 38 volts por 50 milissegundos. Se estiver usando micro eletroporação para alcançar o tálamo ou hipotálamo no dia embrionário 10.5, insira o eletrodo negativo de tungstênio fino no ventrículo injetado com DNA e o eletrodo positivo de platina no útero. Coloque a região alvo entre as extremidades de ambos os eletrodos e aplique os pulsos de corrente de onda quadrada sugeridos três vezes a sete volts por 100 milissegundos.

Após a conclusão da eletroporação, retorne o corno uterino ao seu local original e adicione 500 microlitros de PBS. Suturar a camada interna da incisão com uma sutura cirúrgica. Em seguida, feche a camada externa com um clipe automático de nove milímetros.

Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento por duas horas para permitir a recuperação da cirurgia e da anestesia. A eletroporação de platina da região cortical é vista aqui aplicada em dias embrionários, 13,5, 14,5 e 15,5. Os cérebros foram colhidos no pós-natal.

Dia seis. A camada de células corticais eletroporadas é claramente diferente em cada experimento. Sugerindo que a eletroporação dependente do tempo torna possível o ganho e a perda de função específicos das camadas corticais.

Como mostrado aqui, eletroporação em um tecido profundo, como o tálamo e o hipotálamo. O uso de eletrodos de platina geralmente oferece baixa eficiência usando microeletrodos para operar eletro. Esses tecidos profundos oferecem melhor eficiência e viabilidade.

Injetamos solução de DNA plasmático no terceiro ventrículo de embriões de camundongos. No dia embrionário 11.5, aplicamos eletroporação com agulha restrita ao tálamo, a maioria dos éxons do tálamo se projeta no córtex no sexto dia pós-natal. Aqui mostramos a microeletroporação P-C-A-G-E-Y-F-P no céfalo em desenvolvimento.

A região do tálamo é mostrada pelo RORC, que rotula todos os neurônios pós-mitóticos talâmicos. As projeções de axônios mostradas com setas brancas na camada quatro do córtex também podem ser visualizadas pelo EYFP, que preenche todo o neurônio. A posição da camada quatro no córtex também é marcada pelo anticorpo RORC.

Uma vez iniciada a MA, essa técnica pode ser feita em 15 minutos por litro se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear o teste com muito cuidado para evitar qualquer dano Após este procedimento. Outros métodos, como a incorporação de um cromo específico no MDNA, podem ser realizados para entender o mecanismo molecular da especificação celular após seu desenvolvimento.

Esta técnica, onda de toque para pesquisadores no campo do desenvolvimento do sistema nervoso central para explorar os mecanismos moleculares na padronização, crescimento axonal e formação de circuitos.