Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal
15 de agosto de 2011
Um método de transferência de genes no cérebro do rato em desenvolvimento é descrito usando um único método cirúrgico ea forma especial de eletrodos. Esta técnica exclusiva permite a transfecção de DNA plasmídeo temporal e espacialmente, o que ajudará muitos neurocientistas em estudar o desenvolvimento do cérebro.
O objetivo geral deste procedimento é obter uma transfeção gênica eficiente no sistema nervoso central de camundongos embriões em um ponto temporal de desenvolvimento e uma região cerebral desejados. Isso é conseguido primeiramente pela preparação de capilares de precisão e eletrodos do tipo agulha para prevenir danos uterinos. O segundo passo do procedimento consiste em aprender um método exclusivo de sustentação dos embriões utilizando um cabo de luz de fibra óptica para visualizar embriões pequenos e realizar a injeção direcionada de DNA.
O terceiro passo do procedimento é realizar eletroporação com eletrodos do tipo bastão sobre a superfície uterina, a fim de transfectar o DNA em partes superficiais do cérebro; o passo final do procedimento é realizar eletroporação com eletrodos do tipo agulha em estruturas mais profundas do cérebro, como o tálamo e o hipotálamo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram camada cortical, transfeção específica ou transfeção eficiente no tálamo. A principal vantagem dessa técnica em comparação com métodos existentes, como a injeção regular em posição neutra, é a maior visibilidade e controle do local de injeção dos embriões no útero.
Utilizamos um cabo semelhante a uma fibra óptica, que permite visualizar embriões a partir do E 9,5 e agulhas hipodérmicas para transmitir DNA plasmidial para partes mais profundas do cérebro, como o tálamo e o hipotálamo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o desenvolvimento cerebral, tais como diferenciação neuronal, padronização do cérebro e conectividade neural. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque é complicado moldar a agulha, o eletrodo e posicionar corretamente o conjunto.
O útero e os embriões. A demonstração visual deste método é essencial para observar como fabricar eletrodos de agulha precisos e como posicionar os embriões para a eletroporação. Uma vez que essas duas etapas são fundamentais para obter resultados bem-sucedidos. Para preparar as capilares, utilize um puxador de micropipetas de acordo com as instruções do fabricante.
Neste procedimento, utilizamos tubos capilares de vidro de um milímetro de diâmetro sem fibra interna. As micropipetas puxadas devem ter entre 800 micrômetros e um milímetro de comprimento a partir da ponta, com diâmetro externo inferior a 60 micrômetros, utilizando um microscópio estereoscópico; em seguida, com pinça, quebre as pontas das micropipetas até atingir um diâmetro entre 20 e 30 micrômetros. Meça cada micropipeta utilizando um micrômetro.
Em seguida, prepare microeletrodos por enrolamento. Enrole uma extremidade de um fio de tungstênio ao redor de um pino revestido a ouro. Utilize fio de tungstênio para eletrodos negativos e fio de platina para eletrodos positivos.
Fixe o fio ao pino com param. Em seguida, insira o fio no cabo plástico de um cotonete e enrole ambas as extremidades com phim. Afine a ponta do fio com lixa fina até atingir de 20 a 30 micrômetros na ponta e 60 micrômetros entre 800 micrômetros e um milímetro da ponta. Novamente, verifique as dimensões finais com um micrômetro.
Em seguida, mergulhe o fio afiado em uma gota de esmalte para unhas para aplicar uma camada fina em todo o fio, como isolamento. Após a secagem do esmalte, utilize um cotonete com acetona para removê-lo dos últimos 200 micrômetros da ponta do fio. Os eletrodos de platina são adquiridos prontos e não requerem preparação.
Neste procedimento, utilizamos o eletrodo de gene CUY seis 10 P quatro traço um nepo para purificar o DNA plasmidial com um método maxi prep ou equivalente, eluir 100 microgramas de DNA em um novo tubo e adicionar 10 microlitros de corante azul de poliacrilamida a 1%. Utilize tampão TE para ajustar o volume até 100 microlitros, obtendo uma concentração final de um micrograma por microlitro de DNA plasmidial. Misture a solução suavemente por pipetagem, em seguida centrifugue a solução de DNA por cinco minutos a 14.000 RPM em temperatura ambiente para remover impurezas e sais.
Transfira o SNAT para um novo tubo. A solução de DNA pode ser mantida à temperatura ambiente no tubo durante todo o procedimento. Em seguida, conecte uma micropipeta puxada a um micromanipulador de acordo com as instruções do fabricante e submerja a ponta da micropipeta na solução de DNA para preenchê-la.
Coloque cuidadosamente o micromanipulador de lado e prepare-se para a cirurgia antes da cirurgia. Pese um camundongo grávido nos dias embrionários 9,5 a 15,5 para determinar o peso corporal.
Em seguida, intraperitoneal. Injetar pentobarbital sódico de grau farmacêutico na dose de 50 microgramas por grama de peso corporal e aguardar cinco minutos. Alternativas ao pentobarbital sódico podem incluir cetamina, xilazina, injeção ou anestésicos gasosos.
Após a anestesia, use uma lâmina de barbear e etanol 50% para remover os pelos do abdômen. Prepare a pele com esfregaços alternados de Betadine e álcool 70%. Faça uma incisão na linha média abdominal com tesoura fina.
Retire cuidadosamente todos os cornos uterinos para uma gaze de algodão umedecida com solução salina tamponada com fosfato 1x ou PBS, colocada ao redor da ferida. Mantenha o útero úmido com PBS o tempo todo. Utilizando um cabo de fibra óptica flexível.
Coloque o cabo sob o corneto uterino. Posicione o útero entre a luz da fibra óptica e o polegar e comprima suavemente para empurrar o embrião para cima, aproximando-o da parede uterina. Quando o embrião estiver posicionado com a cabeça à esquerda e voltada para cima, insira cuidadosamente a capilar de vidro no ventrículo-alvo e injete aproximadamente um microlitro de solução de DNA para eletroporação da camada cortical quatro no dia 13,5 de desenvolvimento embrionário.
Posicione os eletrodos de platina em formato de haste do lado de fora do útero e aplique pulsos de corrente em onda quadrada cinco vezes usando 38 volts por 50 milissegundos. Se estiver usando eletroporação micro para atingir o tálamo ou hipotálamo no dia embrionário 10,5, insira o eletrodo negativo fino de tungstênio no ventrículo injetado com DNA e o eletrodo positivo de platina no útero. Posicione a região-alvo entre as extremidades de ambos os eletrodos e aplique os pulsos de corrente em onda quadrada sugeridos três vezes a sete volts por 100 milissegundos.
Após a eletroporação ser concluída, retorne o corno uterino à sua localização original e adicione 500 microlitros de PBS. Suture a camada interna da incisão com um fio cirúrgico. Em seguida, feche a camada externa com um clipe automático de nove milímetros.
Coloque o camundongo sobre uma placa aquecida por duas horas para permitir a recuperação da cirurgia e da anestesia. A eletroporação com platina da região cortical é mostrada aqui aplicada nos dias embrionários 13,5, 14,5 e 15,5. Os cérebros foram coletados no período pós-natal.
Dia seis. A camada de células corticais eletroporadas é claramente diferente em cada experimento. O que sugere que a eletroporação dependente do tempo torna possível o ganho e a perda de função específicos para camadas corticais.
Como mostrado aqui, a eletroporação em um tecido profundo, como o tálamo e o hipotálamo. O uso de eletrodos de platina frequentemente apresenta baixa eficiência ao utilizar microeletrodos para eletroporação. Esses tecidos profundos oferecem melhor eficiência e viabilidade.
Injetamos uma solução de DNA plasmidial no terceiro ventrículo de embriões de camundongo. No dia embrionário 11,5, aplicamos eletroporação com agulha restrita ao tálamo, pois a maior parte dos éxons do tálamo projeta-se para a córtex até o sexto dia pós-natal. Aqui mostramos a microeletroporação P-C-A-G-E-Y-F-P na cefála em desenvolvimento.
A região do tálamo é mostrada por RORC, que marca todos os neurônios pós-mitóticos talâmicos. As projeções axonais indicadas com setas brancas em direção à camada IV da córtex também podem ser visualizadas por EYFP, que preenche todo o neurônio. A posição da camada IV na córtex também é marcada pelo anticorpo anti-RORC.
Uma vez iniciada a MA, esta técnica pode ser realizada em 15 minutos por litro, se for executada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular o seu teste com muito cuidado para evitar qualquer dano após este procedimento. Outros métodos, como a incorporação de um cromóforo específico no DNA mitocondrial, podem ser realizados para compreender o mecanismo molecular da especificação celular após o seu desenvolvimento.
Essa técnica, onda de toque, fornece aos pesquisadores na área do desenvolvimento do sistema nervoso central uma ferramenta para explorar os mecanismos moleculares envolvidos no padrão, no crescimento axonal e na formação de circuitos.
Visão Geral
Este artigo descreve um método de transferência gênica para o cérebro de camundongo em desenvolvimento utilizando uma técnica cirúrgica única e eletrodos especializados. Esta abordagem permite a transfeção precisa de DNA plasmidial, facilitando pesquisas sobre o desenvolvimento cerebral.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Técnicas de Transferência Gênica
- Desenvolvimento Embrionário
Contexto
- O procedimento tem como objetivo a transfeção gênica eficiente no sistema nervoso central de embriões de camundongo.
- Utiliza capilares de precisão e eletrodos do tipo agulha para minimizar danos uterinos.
- Envolve um método exclusivo de fixação de embriões utilizando visualização por fibra óptica.
- A eletroporação é realizada para transfectar DNA em áreas cerebrais específicas.
Objetivo do Estudo
- Para realizar transfeção gênica direcionada em estágios específicos do desenvolvimento.
- Para melhorar a visibilidade e o controle durante o processo de injeção.
- Para investigar questões fundamentais relacionadas à diferenciação neuronal e à conectividade cerebral.
Métodos Utilizados
- Preparação de capilares de precisão e eletrodos para injeção de DNA.
- Uso de cabos de fibra óptica para visualização de embriões.
- Técnicas de eletroporação para transfectar DNA em diversas regiões cerebrais.
- Procedimentos cirúrgicos detalhados para manipulação de embriões e entrega de DNA.
Resultados Principais
- Transfecção bem-sucedida observada em camadas corticais e estruturas cerebrais mais profundas.
- Demonstrou maior controle sobre o local de transfeção em comparação com métodos tradicionais.
- Os resultados contribuem para a compreensão dos processos de desenvolvimento cerebral.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem confiável para transfeção gênica em camundongos embrionários.
- Oferece vantagens significativas em visibilidade e precisão para pesquisas neurocientíficas.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para explorar diversos aspectos do desenvolvimento cerebral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A eletroporação in utero permite a investigação funcional em estágios iniciais de genes candidatos no cérebro em desenvolvimento, apoiando a validação de alvos antes da geração de modelos transgênicos. Essa abordagem reduz a dependência de linhagens CRE, amplia o acesso a regiões como tálamo e hipotálamo e acelera a desvinculação mecanicista na descoberta de alvos neurodesenvolvimentais. Ao proporcionar transfeção controlada espacial e temporalmente, ela aumenta a confiança preditiva nos testes iniciais de hipóteses sobre alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite testes funcionais de genes de sinalização e orientação de axônios em regiões cerebrais embrionárias específicas para esclarecer hipóteses terapêuticas.
- Valor Operacional: Oferece uma alternativa rápida e econômica aos modelos de inserção/eliminação dependentes de CRE para investigação precoce de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia estudos de ganho e perda de função em áreas que carecem de linhagens específicas de CRE, melhorando a confiança nos alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera padrões de transfeção quantitativamente avaliáveis em camadas corticais e estruturas cerebrais profundas para triagem baseada em fenótipo.
- Valor Operacional: Utiliza preparação padronizada de eletrodos e entrega de DNA para melhorar a reprodutibilidade entre experimentos.
- Escalabilidade: Permite o uso repetido de visualização com fibra óptica e acesso uterino baseado em capilares para manipulação consistente de embriões.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Facilita o estudo da diferenciação neuronal, padrões cerebrais e conectividade neural desde a embriogênese inicial até análises pós-natais.
- Redução Mecanística de Riscos: Permite investigar a função gênica em estruturas cerebrais profundas, como tálamo e hipotálamo, relevantes para modelos de transtornos neurodesenvolvimentais.
- Confiabilidade Preditiva: A eletroporação dependente do tempo permite transfeção específica por camada, apoiando modelos de resposta a dose e ao tempo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a modulação gênica orientada por hipóteses em regiões cerebrais embrionárias, auxiliando na identificação de compostos líderes e na seleção de modelos pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos por meio da transfeção direcionada de genes candidatos em zonas ventriculares e estruturas cerebrais profundas.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e com resolução espacial de transfeção que apoiam a análise comparativa de condições em telas fenotípicas.
- Análises: Permite a medição da eficiência de transfeção e da especificidade por camada cortical por meio de repórteres fluorescentes e imunomarcação.
- Pesquisa Translacional: Conecta a função gênica no início do desenvolvimento embrionário aos resultados de padronização e conectividade cerebrais na pós-natalidade.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e reutilizável para transfeção cerebral embrionária envolvendo múltiplos genes-alvo e pontos temporais de desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação precoce de alvos no neurodesenvolvimento por meio da modulação gênica precisa no espaço e no tempo.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio da padronização da preparação de capilares e eletrodos, da visualização com fibra óptica e de parâmetros controlados de eletroporação.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou não avançar ao permitir a avaliação funcional precoce de alvos, reduzindo investimentos em candidatos mal validados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao gerar dados funcionais em sistemas embrionários relevantes para a doença antes da geração de modelos que consomem muitos recursos.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em microcirurgia, manipulação de embriões e fabricação de eletrodos utilizando fios de tungstênio/platina e puxadores de capilares.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo cabos de luz de fibra óptica, micromanipuladores e eletroporadores capazes de controle preciso de voltagem e pulsos.
- Necessita padronização da posição do embrião, concentração de DNA e parâmetros de eletroporação entre diferentes usuários e laboratórios para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes estágios embrionários (E9,5–E15,5) e alvos cerebrais (corticais versus estruturas profundas como tálamo/hipotálamo).
- As limitações práticas incluem a dificuldade técnica em moldar eletrodos em forma de agulha e manter a integridade uterina durante os procedimentos, conforme observado no protocolo.
