Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por In Vivo Eletroporação

Jane transferida para o Ouvido Interno de Camundongo em Desenvolvimento por in Vivo, eletroporação Ling Wang, Han Jang e John Burgandy, Oregon Hearing Research Center, Oregon Health and Science University. Meu nome é John Burgandy. Meu laboratório está no Oregon Hearing Research Center da Oregon Health and Science University.

Meu nome é Ang. Eu sou um pôster no laboratório de Johns. Eu sou Ang também no laboratório Johns como assistente de pesquisa.

Nossa apresentação é dividida em quatro partes. A primeira é a laparotomia ventral. Demonstramos caneta de sódio, anestesia à base de barbital, como testar a adequação da anestesia, proteção da córnea, preparação do local cirúrgico, ficha técnica de cirurgia de sobrevivência de camundongos de desinfecção, incisão na linha média ventral da suíte cirúrgica através da pele e da parede abdominal e exteriorização dos cornos uterinos.

A segunda parte é a microinjeção transuterina. Demonstramos a transiluminação do embrião, embrião, reorientação, microinjeção, pipeta, fabricação e microinjeção no Otis no dia embrionário 11.5 e no dia embrionário 12.5. A terceira parte é a eletroporação in vivo.

Demonstramos a colocação de eletrodos estilo pá e a eletroporação do dia embrionário 11,5 camundongo O assiste. A quarta parte é de resultados representativos. Mostramos a expressão de GFP em cócleas embrionárias tardias e pós-natais precoces.

Isso resultou da eletroporação in vivo do plasmídeo de expressão Otis no dia embrionário 11.5 parte um laparotomia ventral. A barragem é segurada com segurança segurando a pele atrás do pescoço, a cauda e o membro posterior esquerdo. Uma injeção intraperitoneal de anestésico à base de pentobarbital sódico é administrada após esfregar o abdômen com etanol a 70%.

O camundongo é colocado dentro de sua gaiola doméstica por quatro a cinco minutos para permitir que o anestésico atue. Beliscões nos pés e na cauda são usados para avaliar a adequação da anestesia. Esta barragem fecha em resposta ao beliscão da cauda e precisa de mais dois minutos antes de parar de responder a estímulos nocivos.

Pomada oftálmica estéril é aplicada nos olhos para proteger as córneas da dessecação. Preparamos o local cirúrgico em uma capela de exaustão química para minimizar a propagação de pêlos e caspas. O pelo é raspado com uma lâmina fina para expor a pele que cobre a parede abdominal.

A remoção completa do pelo facilita a cicatrização da incisão no pós-operatório. A desinfecção da pele abdominal é obtida alternando passagens de betadina 70% de etanol e 70% de etanol. Sempre passe do rostral para o mimo e use uma bola de algodão cirúrgica fresca ou um aplicador com ponta de algodão.

Para cada passagem, avaliamos a profundidade e a qualidade das respirações durante a desinfecção para garantir que a barragem não responda Depois, após a segunda passagem de etanol a 70%, imediatamente colocamos a maldita superfície ventral em uma cortina estéril e a colocamos em uma almofada aquecida por dois a três minutos para aquecê-la. Este é um momento conveniente para registrar os dados pré-operatórios na folha de registro da cirurgia de sobrevivência do camundongo. Temos anexado nossa folha de dados de cirurgia de sobrevivência em camundongos como informações suplementares.

Considere incluir a folha de dados e seu protocolo de cuidados com animais para que seu comitê institucional de cuidados e uso de animais possa ver como você monitorará os dados pré-operatórios e pós-operatórios. Preenchemos uma folha de registro para cada sujeito cirúrgico. Preferimos realizar cirurgias em um ambiente estéril, embora isso normalmente não seja necessário para roedores.

A superfície de trabalho é separada do motor do ventilador e da carcaça do plenum, para que nenhuma vibração seja transmitida ao usuário. Durante a microinjeção, anexamos como informações suplementares, um esquema das modificações que fizemos em nossa capela de fluxo laminar para facilitar a transferência de genes In utero, as mudanças essenciais são baixo desafio wat e recortes de iluminação de trilha e receptáculos ocultos para cabos de alimentação de instrumentos e um caminho de roteamento para circuitos elétricos acessórios. A suíte cirúrgica consiste na bolsa IV de ringer com lactato elétrico, banho quente, manipulador XY, Z, fluorescência estéreo, microscópio de dissecação, fonte de luz de fibra óptica e instrumentos cirúrgicos.

Os pedais são usados para acionar o micro injetor, eletro perter entram no foco. Os instrumentos cirúrgicos do escopo são esterilizados em autoclave. Os instrumentos devem ser reesterilizados entre os camundongos usando um esterilizador de esferas de vidro ou autoclavando novamente a chave da agulha.

Pinça de anel de tesoura Balli e pinça vascular são as ferramentas essenciais. Incisão na linha média ventral, agarrar a pele com pinça vascular e extirpar o tegumento com a tesoura com ponta esférica, estender a incisão de 10 a 14 milímetros. Identifique a faixa avascular branca de tecido conectado chamada linha alba e a linha média ventral do abdômen incise a alba linear com a tesoura com ponta esférica.

Ter cuidado para não cortar o intestino ou as almofadas de gordura inguinais. Irrigue imediatamente o abdômen com solução estéril de ringer pré-aquecido com lactato. Avalie os locais de incisão na pele e na parede abdominal quanto a sangramento.

A pressão direta com pinça romba interromperá o sangramento menor, se presente, externalizará os cornos uterinos direito e esquerdo com pinça com ponta de anel. Pegue suavemente o chifre uterino direito com uma extremidade anelada da pinça e puxe o útero em direção à incisão da linha média. Use a mão livre para manipular suavemente o lado lateral da barragem para facilitar o engate do útero.

A pinça nunca é usada para comprimir o útero e puxá-lo para fora. Uma vez que isso pode danificar a vasculatura uterina ou os embriões, Repita o procedimento de externalização para o corno uterino esquerdo. Irrigue imediatamente os chifres uterinos recém-exteriorizados com solução de ringer com lactato pré-aquecido, reinsira suavemente as almofadas de gordura inal ou os intestinos, caso eles se exteriorizem com o útero.

Isso não é encontrado com frequência. Parte dois: microinjeção uterina. A barragem é disposta abaixo da objetiva de longa distância de trabalho e uma luz de fibra óptica de cabo macio é colocada contra a parede uterina.

O útero é pressionado suavemente com um dedo da mão livre. Para facilitar a identificação da orientação do embrião. A luz do cabo de fibra óptica deve estar na intensidade mais baixa necessária para avaliar com precisão a orientação do embrião.

A luz intensa pode transmitir calor ao útero que pode causar complicações. Seguramos a luz de fibra óptica e o útero em uma mão e usamos um dedo em nossa mão livre para reposicionar o embrião por palpação suave. Demonstramos a seguir Três vídeos por microscopia EC clipes e as orientações embrionárias comuns observadas pelo útero.

O espectador verá a visão microscópica que vemos durante a iluminação trans, embora em preto e branco a iluminação trans do útero permita a detecção da orientação do embrião in vivo. Neste exemplo, o embrião está em posição de parada de cabeça com sua superfície ventral voltada para o espectador. Ao alternar o útero para frente e para trás, podemos detectar os membros posteriores direito e esquerdo, a cauda e o cefalon do olho esquerdo.

Neste exemplo, o embrião está novamente na posição de parada de cabeça, mas girado cerca de 90 graus em relação ao eixo ântero-posterior. Ao alternar o útero suavemente para frente e para trás, podemos ver as formas de remo que definem o membro posterior esquerdo e o membro esquerdo. O cérebro posterior também é evidente.

O embrião está na posição vertical com o lado esquerdo voltado para o espectador. O quarto ventrículo nascente é detectável como uma mancha brilhante no cérebro posterior. O céfalo do olho esquerdo, os quatro membros esquerdos e os membros posteriores esquerdos também são evidentes.

Uma leve pressão no útero reorienta ligeiramente os embriões para permitir a detecção do tronco principal da veia primária da cabeça e seus ramos anterior e posterior, que são marcados com asterisco branco e preto, respectivamente. Como veremos, o Otis está localizado a meio caminho entre os ramos anterior e posterior da veia primária da cabeça. O próprio Otis não pode ser visto através do útero por transiluminação.

Demonstramos em dois clipes sucessivos de microscopia de vídeo como reorientar o embrião para microinjeção na assistência Otis. O objetivo é identificar os pontos de referência embrionários que permitem a interpolação da localização do otis na cabeça lateral. Além disso, nosso objetivo é reorientar o embrião da posição dorsal para a lateral para que possamos identificar a veia primária da cabeça.

O quarto ventrículo do mesencéfalo e o membro esquerdo são evidentes na posição dorsal. Uma pressão suave no útero muda a orientação do embrião de dorsal para posterior. O céfalo do olho esquerdo, o mesencéfalo e o quarto ventrículo são facilmente aparentes.

A veia primária da cabeça e seu ramo posterior indicado pelo asterisco também são óbvios. O ramo anterior da veia primária da cabeça não é claramente detectado. Nosso objetivo, novamente, é orientar o embrião para que ele possa identificar a veia primária da cabeça, mas sob maior ampliação apropriada para microinjeção uterina.

Os vasos uterinos, a banda decidual e o olho esquerdo são vistos nesta perspectiva lateral. Uma pressão suave no útero muda a posição do embrião, para que possamos detectar o olho esquerdo do quarto ventrículo. A veia primária da cabeça e seu ramo posterior marcado pelo asterisco, a veia primária da cabeça e seus ramos têm a forma de colunas verticais de futebol americano.

A vesícula ótica não pode ser vista através do útero, mas está localizada no centro das colunas. Lynn iniciou uma sequência de injeção para um embrião. Ela ilumina o útero, reorienta o embrião para uma microinjeção e traz a pipeta de microinjeção cheia de verde rápido para o campo.

A pipeta de microinjeção é conectada a um porta-pipeta que é preso por um manipulador microm X, Y, z. O suporte magnético do manipulador é fixado a uma placa de aço com uma base de Teflon que permite o posicionamento bruto sem esforço da pipeta de microinjeção. A agulha é avançada usando o botão de controle do micrômetro dianteiro no manipulador adequadamente.

As pipetas fabricadas são essenciais para uma microinjeção traumática no embrião de camundongo em estágio inicial de Otis. Puxamos tubos capilares de vidro borosil de paredes grossas com um extrator de pipeta horizontal. A pipeta resultante mostrada em A é quebrada manualmente com uma pinça em cerca de 14 a 16 mícrons de diâmetro externo indicado pela ponta da seta em B. A quebra aproximada da pipeta mostrada em C é irregular e frágil.

Chanframos a pipeta em cerca de 20 graus para afiar a ponta da pipeta, conforme visto no Painel D, os parâmetros para puxar e chanfrar pipetas de microinjeção são fornecidos no texto anexo. Demonstramos nos próximos dois clipes de microscopia de vídeo microinjeção na assistência ótica do camundongo nos dias embrionários 11.5 e 12.5. Nosso objetivo é demonstrar a microinjeção uterina no dia embrionário, 11,5 ótica de camundongos.

Primeiro, injetamos a ótica sem o útero presente para mostrar inequivocamente como uma injeção direcionada corretamente aparece. Em seguida, demonstramos a microinjeção transuterina autêntica. Para esta primeira injeção, o útero foi incisado para permitir que o saco visceral expulsasse a banda decidual que recobre o saco vitelino visceral foi removida.

A placenta permanece presa ao útero e o embrião está vivo. Com o útero removido focalmente, vemos o quarto ventrículo, a veia primária da cabeça e seus ramos anterior e posterior, a pipeta e a localização aproximada do cisto em branco. No início desta sequência de injeção, o fluxo sanguíneo é detectado na vasculatura do saco vitelino visceral.

A pipeta é avançada através do saco vitelino visceral e dai é injetado na nota de osis, no ducto linfático endo dorsalmente e na posição da ótica no centro das colunas. A ótica está a meio caminho entre os ramos anterior e posterior da veia primária da cabeça, microinjeção uterina no dia embrionário. 11.5 A ótica do camundongo requer a detecção da veia primária da cabeça e pelo menos um de seus ramos para estimar a localização da assistência ótica.

Nosso alvo neste exemplo diagramático, tanto os ramos anterior quanto o posterior da veia primária da cabeça são detectados com o território OUC marcado em branco. Uma apresentação mais realista do embrião é aquela em que o tronco principal da veia primária da cabeça é detectado junto com apenas um de seus ramos e o exemplo mostrado apenas o ramo posterior da veia primária da cabeça é visto, mas isso é suficiente para interpretar a localização da ótica. O PT é avançado através do útero e o corante é injetado na ótica.

Esperamos 30 segundos para permitir que o corante saia da cavidade amniótica, momento em que podemos ver o ducto linfático endo dorsalmente e o vestíbulo. Concluímos com uma visão de baixa ampliação do embrião cujo cisto acabamos de injetar para fornecer perspectiva anatômica nesta visão, o quarto ventrículo, o olho esquerdo e a vasculatura uterina são vistos. Demonstramos trans e microinjeção no cisto ótico embrionário do dia 12 de camundongo e microinjeção no quarto ventrículo nascente do cérebro posterior.

A transiluminação nos permite detectar a veia primária da cabeça nesta vista lateral esquerda, bem como o olho. A pipeta é avançada através do útero até a vesícula ótica e morre injetada para preencher seu lúmen. Para injetar o quarto ventrículo, giramos o embrião 90 graus para uma visão dorsal do cérebro posterior.

O cisto esquerdo injetado está agora no lado esquerdo. A pipeta é avançada através do útero e verde rápido misturado com lor. O dextrano conjugado é injetado no quarto ventrículo.

Observe que o volume de corante injetado não entra no mesencéfalo in vivo. A fluorescência é avaliada após a injeção para validar a localização do dextrano no quarto ventrículo. O embrião é então reorientado da posição dorsal para a lateral.

O ducto linfático endo é apenas ventral ao quarto ventrículo nesta vista lateral. A fluorescência in vivo valida a localização do dextrano no quarto ventrículo. Ao nascer, examinamos os filhotes quanto à fluorescência verde no quarto ventrículo usando uma epifluorescência.

Filhotes de microscópio dissecadores com fluorescência verde em seus cérebros posteriores possuem um ouvido interno que foi manipulado durante a eletroporação in vivo da parte três da embriogênese. Após o preenchimento do cisto com plasmídeo de expressão, o útero é irrigado com solução de ringer lactato pré-quente. A transiluminação facilita a centralização do cisto ODU no campo do eletrodo.

A cabeça de metal da luz de fibra óptica é retraída da superfície uterina. Antes de iniciar o trem de pulso de onda quadrada, demonstramos no próximo clipe de microscopia de vídeo um ciclo completo de eletroporação in vivo. A eletroporação do dia embrionário, 11,5 cisto ótico de camundongo requer a colocação suave dos eletrodos estilo pá no útero.

Neste exemplo, o cisto ótico esquerdo foi preenchido com plasmídeo de expressão e o útero foi irrigado recentemente com ringers lactados. O cátodo é posicionado lateralmente em relação ao cisto ótico preenchido e o e ode é posicionado medialmente no início da sequência de ação, o cisto ótico é centralizado no campo de remo. O útero é comprimido suavemente e o trem de pulso de onda quadrada é iniciado com um pedal

Idealmente, 60 a cem miliamperes de corrente são fornecidos por pulso. O útero é então liberado e imediatamente irrigado. O útero recém-irrigado é devolvido à cavidade abdominal por uma leve pressão com a pinça anelar.

Uma vez que o útero é internalizado, a cavidade abdominal é lavada com cerca de quatro mils de ringers lactados, deixando cerca de um mil de ringers lactados na cavidade abdominal para ajudar a manter a hidratação da mãe, que beberá menos água do que o normal imediatamente após a cirurgia abdominal. A parede abdominal e a pele são fechadas com sutura reabsorvível usando uma chave de agulha. Nosso driver de agulha possui uma tesoura embutida que simplifica o fechamento.

Preferimos um ponto corrido tanto para a parede abdominal quanto para a pele. Bloqueamos todos os outros pontos para fornecer suporte adicional no local da incisão. Administramos um medicamento anti-inflamatório não esteróide por via subcutânea antes de colocar a barragem na gaiola de recuperação.

Consulte sua equipe veterinária sobre quais analgésicos profiláticos são preferidos pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais. A barragem é aninhada em uma cortina estéril e colocada no chão da gaiola de recuperação aquecida. A gaiola de recuperação contém material de nidificação, um tubo vermelho para cobertura, ração de laboratório e uma garrafa de água.

A gaiola é remontada com um capô de filtro na parte superior na manhã seguinte à cirurgia. A barragem é lindamente cuidada, ambulatória e capaz de se equilibrar em seus membros posteriores para perguntar sobre o topo da gaiola aberta. A linha de sutura no abdômen está limpa, seca e não mostra evidências de separação, vermelhidão ou inchaço.

Anexamos um documento que discute o desenvolvimento de protocolos de cuidados com animais para transferência de genes no útero. O documento contém uma linguagem que pode ser útil ao projetar um protocolo específico da instituição em consulta com seu comitê de cuidados e uso de animais. Parte quatro, resultados representativos.

Os painéis de resultados representativos A e B mostram uma cóclea representativa de um filhote pós-natal cujo Otis foi injetado com um plasmídeo de expressão de proteína fluorescente verde aprimorada no dia embrionário 11,5 e depois eletro. A parede lateral da cóclea foi removida do meio termo e do ápice. Apenas a expressão de GFP está presente da base até o meio termo da cóclea e segue a distribuição do marcador de células ciliadas miosina sete A mostrado no painel B. O painel C mostra uma projeção confocal de baixa ampliação do dia embrionário.

18,5 órgão de camundongo de corde imuno corado com uma miosina sete células transfectadas com anticorpos A são distribuídas por todo o órgão de corde. O painel D mostra uma projeção confocal de alta ampliação do dia embrionário. 18.5 Órgão de camundongo de corde cordo corado com cin. Sete.

Uma expressão de GFP é detectada em células ciliadas internas e externas, células interfalangeanas, células pilares e células TER. Transferência de genes mediada por eletroporação para o Otis no dia embrionário 11.5 Progenitores transfectos que dão origem a todos os tipos de células componentes dentro do órgão de corde.