Estudos de Transplante

Transplantation Studies

JoVE Science Education
Developmental Biology

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JoVE Science Education Developmental Biology

Transplantation Studies

2.2: Gene Silencing with Morpholinos

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06:21 min

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April 30, 2023

Overview

Muitos biólogos do desenvolvimento estão interessados nos sinais moleculares e interações celulares que induzem um grupo de células a se desenvolver em um determinado tecido. Para investigar isso, os cientistas podem usar uma técnica clássica conhecida como transplante, que envolve tecido de um embrião doador sendo extirpado e enxertado em um embrião hospedeiro. Observando como os tecidos transplantados se desenvolvem em ambientes hospedeiros, os cientistas começaram a dissecar as vias moleculares subjacentes ao desenvolvimento.

Neste vídeo, primeiro olhamos para o papel das interações celulares no desenvolvimento e passamos para um protocolo básico de transplante. Por fim, são discutidos alguns estudos específicos de desenvolvimento utilizando essa técnica, que examinam o efeito do transplante de tecido sobre o destino do doador e do tecido hospedeiro.

Procedure

Cientistas do campo da biologia do desenvolvimento usam estudos de transplante como ferramenta para investigar interações celulares necessárias para a organogênese adequada. Neste procedimento, o tecido embrionário é cuidadosamente dissecado de um doador e transplantado para um hospedeiro durante a embriogênese precoce. Embriões hospedeiros são então examinados para determinar como o tecido transplantado influencia o padrão de desenvolvimento.

Este vídeo fornecerá uma visão geral das interações celulares durante a organogênese, um protocolo geral de transplante e, finalmente, algumas das muitas aplicações práticas desta técnica útil.

Antes de investigar como realizar transplantes, vamos discutir brevemente alguns princípios de estudo das interações celulares durante a organogênese. Os órgãos são estruturas complexas compostas por muitos tipos de células que devem trabalhar em conjunto para gerar um sistema funcional.

Durante o desenvolvimento, cada tipo de célula tem um papel como o indutor ou o respondente. O indutor é um tecido que produz um sinal, altera o comportamento de outro tecido, e muitas vezes determina seu destino, enquanto o respondente é um tecido alvo que recebe um sinal do indutor. Todo esse processo é conhecido como indução tecidual. Padrões de expressão genética determinarão quais células são respondentes, uma vez que as proteínas da superfície celular apropriada devem estar presentes para receber e interpretar sinais.

Estudos de transplante são uma forma de investigar a indução tecidual. As células doadoras podem ser transplantadas para o hospedeiro em um local diferente para ver como alterar os sinais presentes no ambiente celular muda seu destino. Alternativamente, tecidos geneticamente diversos podem ser transplantados entre locais análogos para avaliar como a expressão genética impacta o desenvolvimento.

Agora que sabemos um pouco mais sobre transplantes, vamos ver algumas preparações que podem ser necessárias para realizar essa técnica.

Primeiro, prepare as ferramentas necessárias para técnicas cirúrgicas microscópicas. Ferramentas comumente usadas incluem agulhas de tungstênio, que são polidas em chamas até um ponto afiado, ou agulhas de vidro finas retiradas de tubos capilares. Além disso, dependendo do organismo com o que você vai trabalhar, um molde de estabilização pode ser necessário. Isso ajuda a estabilizar o organismo no local durante o procedimento de transplante.

Vários organismos modelo podem ser usados em estudos de transplante. Aqui, descreveremos brevemente o procedimento usando um sistema de codorna. O primeiro passo é remover o embrião doador do ovo e colocá-lo em um prato para dissecção. Em seguida, sob um microscópio dissecando, o tecido de interesse é cuidadosamente extirpado do doador e colocado em solução adequada e no gelo até que o hospedeiro esteja pronto para receber o transplante.

O anfitrião é preparado da mesma forma que o doador. Extir esse espaço de consumo cuidadosamente, criando um local de enxerto equivalente ao tamanho do tecido doador. O tecido do doador é colocado em posição e fixado no local do enxerto hospedeiro. Finalmente, o embrião é colocado de volta em condições que imitam seu ambiente natural, e permitido desenvolver-se até que a idade desejada seja atendida. A indução tecidual pode então ser estudada usando várias técnicas histológicas e microscópicas.

Agora que passamos por um método geral de realização de transplantes, vamos examinar algumas aplicações a jusante desta técnica.

Estudos de transplante podem ser usados para investigar genes que estão envolvidos na condução de uma célula em direção a um destino de tecido específico. Neste experimento, uma camada de células-tronco, conhecida como a tampa animal, expressando o gene de interesse foi transplantada no flanco de um embrião xenopus. Após um período de incubação, uma estrutura semelhante aos olhos foi vista se desenvolvendo no local do transplante, sugerindo que o gene de interesse pode direcionar uma população de células-tronco para o destino de uma célula retinária.

Estudos de transplantes também podem ser utilizados para examinar como um grupo de células pode alterar o destino do tecido hospedeiro através de interações célula-células. Neste experimento, os pesquisadores extirem a estrutura embrionária chamada nó hensen, também conhecido como “nó primitivo” ou “organizador”, do embrião do pintinho doador, e transplantam-no para uma região ingênua em um embrião de filhote hospedeiro. Eles observam que o nódulo de Hensen transplantado forma um notochord em miniatura, sugerindo que sinais do tecido doador guiaram o tecido hospedeiro em direção a um destino neural.

Aproveitando as diferenças estruturais entre a codorna e o pato, os pesquisadores realizam transplantes para avaliar a padronização específica das espécies. Aqui, os pesquisadores criam um “quck” pegando uma população celular específica conhecida como crista neural de uma codorna e transplantando-a em um pato. Devido às diferenças genéticas, os pesquisadores podem avaliar a contribuição da crista neural da codorna no organismo desenvolvido.

Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre estudos de transplante. Este vídeo forneceu uma visão geral das interações celulares durante a organogênese, uma breve introdução na realização de transplantes, e algumas das muitas aplicações práticas dessa técnica no campo da biologia do desenvolvimento. Como sempre, obrigado por assistir!

Transcript

Scientists in the field of developmental biology use transplantation studies as a tool to investigate cellular interactions that are required for proper organogenesis. In this procedure, embryonic tissue is carefully dissected from a donor and transplanted to a host during early embryogenesis. Host embryos are then examined to determine how the transplanted tissue influences the pattern of development.

This video will provide an overview of cellular interactions during organogenesis, a general transplantation protocol, and finally some of the many practical applications of this useful technique.

Before delving into how to perform transplantations, lets briefly discuss some principles of studying cellular interactions during organogenesis. Organs are complex structures comprised of many cell types that must work together to generate a functioning system.

During development, each cell type has a role as either the inducer or the responder. The inducer is a tissue that produces a signal, alters the behavior of another tissue, and often determines its fate, while the responder is a target tissue that receives a signal from the inducer. This entire process is known as tissue induction. Gene expression patterns will determine which cells are responders, since the appropriate cell surface proteins must be present to receive and interpret signals.

Transplantation studies are one way to investigate tissue induction. Donor cells can be transplanted into the host at a different location to see how altering the signals present in the cellular environment changes their fate. Alternatively, genetically diverse tissues can be transplanted between analogous locations to assess how gene expression impacts development.

Now that we know a little more about transplants, let’s see some preparations that might be necessary in order to perform this technique.

First, prepare the tools necessary for microscopic surgical techniques. Commonly used tools include tungsten needles, which are flame-polished to a sharp point, or fine glass needles pulled from capillary tubes. In addition, depending on the organism you’ll be working with, a stabilization mold may be necessary. This helps in steadying the organism in place during the transplantation procedure.

A number of model organisms can be used in transplantation studies. Here, we will briefly describe the procedure using a quail-chick system. The first step is to remove the donor embryo from the egg and place it on a dish for dissection. Next, under a dissecting microscope, the tissue of interest is carefully excised from donor and placed into appropriate solution and onto ice until the host is ready to receive the transplant.

The host is prepared in the same fashion as the donor. Carefully excise the host tissue, creating a graft site equivalent to the size of the donor tissue. Donor tissue is placed in position and secured to the host graft site. Finally, the embryo is placed back into conditions that mimic its natural environment, and allowed to develop until the desired age is met. Tissue induction can then be studied using various histological and microscopic techniques.

Now that we have gone over a general method of performing transplants, lets examine some downstream applications of this technique.

Transplantation studies can be used to investigate genes that are involved in driving a cell towards a particular tissue fate. In this experiment, a layer of stem cells, known as the animal cap, expressing the gene of interest was transplanted onto the flank of a Xenopus embryo. Following a period of incubation, an eye-like structure was seen developing at the transplantation site, suggesting that the gene of interest can direct a stem cell population towards a retinal cell fate.

Transplantations studies can also be utilized to examine how a group of cells can change the fate of host tissue through cell-cell interactions. In this experiment, researchers excise the embryonic structure called the Hensen’s node, also known as the “primitive knot” or the “organizer,” from the donor chick embryo, and transplant it to a naive region on a host chick embryo. They observe that the transplanted Hensen’s node forms a miniature notochord, suggesting that signals from the donor tissue guided the host tissue toward a neural fate.

Taking advantage of structural differences between the quail and duck, researchers perform transplantations to assess species-specific patterning. Here, researchers create a “quck” by taking a specific cell population known as the neural crest from a quail and transplanting it into a duck. Due to the genetic differences, researchers can assess the quail’s neural crest contribution in the developed organism.

You’ve just watched JoVE’s video on transplantation studies. This video provided an overview of cellular interactions during organogenesis, a brief introduction into performing transplantations, and some of the many practical applications of this technique in the field of developmental biology. As always, thanks for watching!

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