Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de Caenorhabditis elegans 'Locomotion

O objetivo geral deste procedimento é identificar anormalidades na sinalização neuronal e neuromuscular no organismo modelo da C Allergan após exposição química ou manipulação genética. Isso é feito primeiro projetando e gravando um padrão de microcanal em um wafer de silício. Durante a segunda etapa, o molde de silicone é usado para fundir um ou mais microcanais do PDMS.

Em seguida, os componentes acessórios são fixados ao molde PDMS. Em seguida, o comportamento dos vermes à medida que são estimulados a nadar através do microcanal é registrado usando uma câmera montada no microscópio. Em última análise, a eletromicrofluídica é usada para determinar as mudanças nos nematóides, sistemas neuronais e musculares devido à manipulação química ou genética com locomoção como leitura.

Portanto, a principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas existentes, especialmente os ensaios comportamentais baseados em placas, é que, com essa técnica, a direção da locomoção do verme pode ser rigidamente controlada, permitindo a quantificação precisa dos comportamentos da locomotiva, como frequência de curvatura do corpo, tempo de rotação e velocidade de natação. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de distúrbios neurodegenerativos, como Parkinson e Alzheimer, porque pode ser usada para rastrear fatores químicos e genéticos com propriedades neuroprotetoras. Tivemos a ideia dessa técnica pela primeira vez quando percebemos que há falta de método para analisar o comportamento do movimento do método de forma quantitativa.

O movimento é voluntário e aleatório, e é difícil de caracterizar. Então, queríamos estabelecer um método fácil que todos pudessem aprender: fazer o molde mestre começar banhando um wafer de silício de três polegadas em acetona e depois metanol por 30 segundos cada. Em seguida, enxágue o wafer com água deionizada por cinco minutos.

Em seguida, use uma pistola de nitrogênio para secar a superfície dos wafers e, em seguida, aqueça o wafer em uma placa quente a 120 graus Celsius após dois minutos, o plasma oxida a superfície do wafer de silício a 50 watts por um minuto. Agora, usando três mililitros de SU oito 100 fotorresistentes, gire a superfície do wafer a 1.750 RPM por 40 segundos e, em seguida, pré-asse o wafer revestido em uma placa quente a 65 graus Celsius. Após 10 minutos, aumente a temperatura para 95 graus Celsius em dois minutos e asse o wafer por mais uma hora.

Depois de remover o wafer da placa quente, coloque uma máscara fotográfica com o desenho desejado sobre o wafer. Exponha a fotorresistência à luz UV por 95 segundos. Em seguida, asse o wafer em uma chapa quente usando o mesmo gradiente de temperatura usado para o pré-assado após o pós-cozimento.

Mergulhe o wafer em SU oito. Desenvolva uma solução por 10 a 15 minutos. Enxágue o wafer com isopropanol para confirmar a conclusão do desenvolvimento do projeto.

Em seguida, enxágue com água deionizada por 30 segundos. Por fim, seque o wafer com uma pistola de nitrogênio e leve ao forno brevemente a 120 graus Celsius. Agora, coloque o molde mestre fabricado, bem como um wafer de silicone em branco em duas placas de Petri separadas forradas com papel alumínio.

Despeje 20 mililitros de pré-polímero PDMS no molde mestre e no prato e 15 mililitros no prato de wafer em branco. Em seguida, pressione suavemente as bolachas com um aplicador de madeira descartável para eliminar quaisquer bolsas de ar embaixo das bolachas e, em seguida, cubra os dois pratos e deixe-os de lado por um dia para curar. Após a cura das bolachas, remova o papel alumínio e retire o PDMS.

Em seguida, use um unicórnio Harris de 2,5 milímetros para perfurar as portas de acesso ao fluido em ambas as extremidades do canal no PDMS do molde mestre. Corte os dois discos PDMS em tiras de tamanho semelhante. Em seguida, em uma sala limpa, carregue o canal, a tira PDMS em branco e uma lâmina de vidro em um oxidante de plasma.

Exponha os materiais ao plasma de oxigênio a 40 watts de potência por 40 segundos. Em seguida, cole a peça do canal e a lâmina de vidro em lados opostos da tira em branco e reserve os materiais para completar a colagem. Após duas horas, use o pré-polímero PDMS para prender dois pedaços de tubo de plástico com pelo menos quinze centímetros de comprimento aos reservatórios perfurados em uma placa quente a 120 graus Celsius.

Deixe o PDMS curar antes de continuar. Em seguida, afixar um conector de plástico fluídico a um dos tubos para permitir a fixação da seringa. Agora, insira comprimentos de três polegadas de fio de cobre isolado de calibre 22 em cada reservatório entre o tubo de entrada e o canal que prende os fios com mais pré-polímero PDMS.

Comece esta etapa colocando o microcanal recém-montado em um estágio móvel XY de um microscópio com uma câmera montada conectada a um monitor, conecte a fonte de alimentação aos eletrodos dos microcanais. Depois de confirmar que a resistência do microcanal é de cerca de 0,6 mega ohms, conecte o tubo de saída do microcanal a uma seringa descartável. Em seguida, mergulhe a boca do tubo de admissão em uma solução de nematóides suspensa em M nove tampão fisiológico.

Aplique pressão negativa dentro da seringa para aspirar o líquido para o canal. Quando os tubos de entrada e saída estiverem cheios, desconecte a seringa e hidrostático. Manipule o fluxo ajustando a altura relativa dos tubos para colocar uma minhoca no centro do canal.

Em seguida, coloque os dois tubos planos na mesma elevação para manter o fluxo zero dentro do microcanal. Ao trocar amostras de minhocas durante um experimento de eletrotáxis, depois de nivelar os dois tubos de entrada na mesma elevação, se ainda houver fluxo, faça pequenos ajustes na altura do tubo em relação um ao outro. Se não tivermos certeza se o fluxo é realmente zero, podemos induzir uma reversão no movimento do verme alterando a polaridade do campo elétrico e, em seguida, avaliando a velocidade linear do verme à medida que ele gira.

Agora defina a fonte de alimentação para a tensão apropriada. Ative o sinal elétrico e aguarde um minuto de pré-exposição para que o verme se acostume ao campo, durante o qual o verme deve começar a se mover em direção ao cátodo quando o minuto tiver passado. Comece a gravar.

Quando o experimento terminar, remova todo o líquido e vermes do canal. Enxágue a câmara com água deionizada e deixe o dispositivo em uma placa quente a 125 graus Celsius para secar. Neste vídeo representativo, são mostrados o eletroeixo de um nematóide adulto jovem do tipo selvagem e suas saídas de posição e velocidade do software de rastreamento de vermes.

O vídeo começa com o cátodo à direita. A aparência da pipeta de vidro indica a reversão iminente, a remoção subsequente dos sinais da pipeta. O momento da reversão aqui, os dados de posição versus tempo e velocidade instantânea versus tempo do programa de rastreamento de vermes personalizado para o verme No vídeo são mostrados o programa calculou a curva de velocidade a partir da curva de tempo de posição.

Este gráfico de caixa exibe dados de velocidade elétrica de um conjunto de animais selvagens e trincheiros. Os animais transgênicos T expressam o gene da alfa-sinucleína humana nos músculos da parede do corpo sob o controle do promotor do gene da cadeia pesada da miosina UNC 54, que causa agregação de proteínas e se manifesta como uma resposta eletrotática mais lenta do que a dos animais selvagens. Uma vez dominado, mais de 20 vermes podem ser testados a cada hora se o experimento de eletrotáxis for realizado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que apenas mutações e produtos químicos que afetam a locomoção ou a sensação de eletros produzirão fenótipos detectáveis pelo ensaio de eletrotaxas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como padronizar um silicone. Montamos o canal microfluídico e como analisar a locomoção do método N usando um ensaio axxis.