Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de
2 de maio de 2013
Um método de micro-electro-fluídico semi-automatizado para induzir a demanda de locomoção em Caenorhabditis elegans É descrito. Este método baseia-se no fenómeno neurophysiologic de vermes respondem a campos eléctricos ligeiros ("electrotaxis") no interior de canais microfluidicos. Microfluidic electrotaxis serve como um baixo custo, e escalável técnica rápida, sensível, para triagem de fatores que afetam a saúde neuronal.
O objetivo geral deste procedimento é identificar anormalidades na sinalização neuronal e neuromuscular no organismo modelo C Allergan após exposição química ou manipulação genética. Isso é realizado primeiramente projetando e gravando um padrão de microcanal em uma pastilha de silício. Na segunda etapa, o molde de silício é usado para moldar um ou mais microcanais a partir de PDMS.
Em seguida, componentes acessórios são fixados ao molde de PDMS. Depois, o comportamento dos vermes, enquanto são estimulados a nadar através do microcanal, é registrado usando uma câmera acoplada ao microscópio. Por fim, a eletromicrofluídica é utilizada para determinar as alterações nos sistemas neuronal e muscular dos nematoides decorrentes de manipulações químicas ou genéticas, com a locomoção como parâmetro de leitura.
Assim, a principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes, especialmente os ensaios comportamentais baseados em placas, é que com esta técnica, a direção da locomoção do verme pode ser rigorosamente controlada, permitindo a quantificação precisa de comportamentos locomotores, como frequência de curvatura corporal, tempo de rotação e velocidade de natação. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia de distúrbios neurodegenerativos, como Parkinson e Alzheimer, porque pode ser utilizada para triagem de fatores químicos e genéticos com propriedades neuroprotetoras. Tivemos inicialmente a ideia para esta técnica quando percebemos que havia uma falta de método para analisar o comportamento de movimento de forma quantitativa.
O movimento é voluntário e aleatório, e é difícil caracterizá-lo. Por isso, quisemos estabelecer um método simples que todos possam aprender. Para fabricar o molde mestre, comece mergulhando uma pastilha de silício de três polegadas em acetona e, em seguida, em metanol, por 30 segundos cada. Em seguida, enxágue a pastilha com água desionizada por cinco minutos.
Em seguida, utilize uma pistola de ar de nitrogênio para secar a superfície da pastilha e, então, aqueça a pastilha em uma placa aquecedora a 120 graus Celsius após dois minutos; oxide a superfície da pastilha de silício por plasma a 50 watts durante um minuto. Agora, utilizando três mililitros de resistência fotográfica SU 8 100, faça o revestimento por centrifugação na superfície da pastilha a 1.750 RPM durante 40 segundos e, em seguida, pré-aqueça a pastilha revestida em uma placa aquecedora a 65 graus Celsius. Após 10 minutos, aumente a temperatura para 95 graus Celsius ao longo de dois minutos e aqueça a pastilha por mais uma hora.
Após remover a pastilha da placa aquecida, posicione uma máscara fotográfica com o desenho desejado sobre a pastilha. Exponha a resistência fotográfica à luz UV por 95 segundos. Em seguida, faça o cozimento pós-exposição da pastilha em uma placa aquecida, utilizando o mesmo gradiente de temperatura usado para o cozimento pré-exposição após o cozimento pós-exposição.
Mergulhe a pastilha em SU oito. Desenvolva uma solução por 10 a 15 minutos. Enxágue a pastilha com isopropanol para confirmar a conclusão do desenvolvimento do desenho.
Em seguida, enxágue com água desionizada por 30 segundos. Por fim, seque a pastilha com um maçarico de nitrogênio e aqueça brevemente a 120 graus Celsius. Agora, coloque o molde mestre fabricado, bem como uma pastilha de silicone virgem, em duas placas de Petri separadas forradas com folha de alumínio.
Despeje 20 mililitros de pré-polímero de PDMS no molde mestre e no recipiente, e 15 mililitros no recipiente com a pastilha em branco. Em seguida, pressione suavemente as pastilhas com um aplicador descartável de madeira para eliminar quaisquer bolsas de ar sob as pastilhas e, depois, cubra ambos os recipientes e deixe-os de lado por um dia para curar. Após a cura das pastilhas, remova o papel alumínio e retire o PDMS.
Em seguida, utilize um perfurador Harris de 2,5 milímetros para criar portas de acesso ao fluido em ambas as extremidades do canal no PDMS a partir do molde-mestre. Corte ambos os discos de PDMS em tiras de tamanho semelhante. Depois, em uma sala limpa, carregue o canal, a tira de PDMS sem funcionalização e uma lâmina de vidro em um oxidador de plasma.
Exponha os materiais ao plasma de oxigênio a 40 watts de potência durante 40 segundos. Em seguida, fixe a peça do canal e a lâmina de vidro em lados opostos da tira em branco e coloque os materiais de lado para concluir a ligação. Após duas horas, utilize o pré-polímero de PDMS para fixar duas peças de tubo plástico com pelo menos seis polegadas de comprimento nos reservatórios perfurados em uma placa aquecedora a 120 graus Celsius.
Deixe a PDMS curar antes de continuar. Em seguida, fixe um conector plástico fluidico a um dos tubos para permitir a fixação de seringas. Agora, insira comprimentos de três polegadas de fio de cobre isolado de calibre 22 em cada reservatório entre o tubo de entrada e o canal, fixando os fios com mais pré-polímero de PDMS.
Inicie este passo colocando o microcanal recém-montado sobre uma platina móvel XY de um microscópio equipado com câmera acoplada a um monitor e conecte a fonte de alimentação aos eletrodos do microcanal. Após confirmar que a resistência do microcanal é de aproximadamente 0,6 megaohm, conecte o tubo de saída do microcanal a uma seringa descartável. Em seguida, submerja a extremidade do tubo de entrada em uma solução de nematódeos suspensos em tampão fisiológico M nove.
Aplique pressão negativa dentro da seringa para aspirar o líquido para o canal. Quando os tubos de entrada e saída estiverem ambos cheios, desconecte a seringa e utilize pressão hidrostática. Manipule o fluxo ajustando a altura relativa dos tubos para posicionar um verme no centro do canal.
Em seguida, coloque ambos os tubos na posição horizontal e na mesma altura para manter o fluxo nulo dentro do microcanal. Ao trocar as amostras de vermes durante um experimento de eletrotaxia, após nivelar ambos os tubos de entrada na mesma altura, se ainda houver fluxo, faça pequenos ajustes na altura dos tubos em relação um ao outro. Se houver alguma dúvida sobre se o fluxo é realmente nulo, podemos induzir uma inversão no movimento do verme alterando a polaridade do campo elétrico e, em seguida, avaliar a velocidade linear do verme enquanto ele muda de direção.
Agora ajuste a fonte de alimentação à voltagem apropriada. Ative o sinal elétrico e aguarde um minuto de pré-exposição para que o verme se aclimate ao campo, durante o qual o verme deverá começar a se mover em direção ao cátodo. Após decorrido o minuto, inicie a gravação.
Quando o experimento for concluído, remova todo o líquido e os vermes do canal. Enxágue a câmara com água desionizada e deixe o dispositivo em uma placa aquecedora a 125 graus Celsius para secar. Neste vídeo representativo, um eixo eletro de nematoides selvagens jovens adultos e suas saídas de posição e velocidade provenientes do software de rastreamento de vermes são mostrados.
O vídeo começa com o cátodo à direita. A aparência da pipeta de vidro indica a inversão iminente, e a remoção subsequente dos sinais da pipeta. No momento da inversão, são mostrados os dados de posição versus tempo e de velocidade instantânea versus tempo, obtidos pelo programa personalizado de rastreamento de vermes, para o verme no vídeo. O programa calculou a curva de velocidade a partir da curva de posição versus tempo.
Este gráfico de caixa exibe dados de velocidade eletrotática de um conjunto de animais do tipo selvagem e transgênicos. Os animais transgênicos T expressam o gene humano da alfa-sinucleína nos músculos da parede corporal sob o controle do promotor do gene da cadeia pesada da miosina UNC-54, o que causa agregação proteica e se manifesta como uma resposta eletrotática mais lenta em comparação com a dos animais do tipo selvagem. Após dominar a técnica, mais de 20 vermes podem ser ensaiados a cada hora, caso o experimento de eletrotaxia seja realizado corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que apenas mutações e produtos químicos que afetem a locomoção ou a eletrossensibilidade produzirão fenótipos detectáveis pelo ensaio de eletrotaxia. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como moldar uma silicone. Montamos um canal microfluídico e como analisar a locomoção de N method utilizando um ensaio de axxis.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método microeletrofluídico semi-automatizado para induzir locomoção sob demanda em Caenorhabditis elegans. A técnica aproveita o fenômeno da eletrotaxia, permitindo a triagem rápida de fatores que afetam a saúde neuronal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Microssistemas
- Análise Comportamental
Antecedentes
- Caenorhabditis elegans é um organismo modelo para o estudo da sinalização neuronal e neuromuscular.
- A eletrotaxia é uma resposta neurofisiológica a campos elétricos.
- Canais microfluídicos permitem experimentos controlados em organismos pequenos.
- O entendimento da locomoção pode revelar insights sobre a saúde neuronal.
Objetivo do Estudo
- Identificar anormalidades na sinalização neuronal e neuromuscular.
- Avaliar os efeitos da exposição química ou da manipulação genética.
- Utilizar a locomoção como parâmetro para alterações neuronais e musculares.
Métodos Utilizados
- Projetar e gravar padrões de microcanais em pastilhas de silício.
- Confeccionar microcanais em PDMS utilizando moldes de silício.
- Acoplar componentes acessórios ao molde de PDMS.
- Registrar o comportamento dos vermes usando uma câmera acoplada ao microscópio.
Resultados Principais
- Indução bem-sucedida de locomoção em C. elegans utilizando eletrotaxia.
- Identificação de alterações nos sistemas neuronal e muscular.
- Demonstração da eletrotaxia em microfluídica como método escalável de triagem.
- Compreensão dos efeitos de manipulações genéticas e químicas.
Conclusões
- A eletrotaxia em microfluídica é uma ferramenta valiosa para a pesquisa em neurociência.
- Este método oferece uma abordagem sensível e de baixo custo para estudar a saúde neuronal.
- Aplicações adicionais poderiam aprimorar a compreensão dos distúrbios neuromusculares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise quantitativa da locomoção em C. elegans permite triagem em alto rendimento de compostos neuroprotetores e modificadores genéticos em modelos de doenças neurodegenerativas. Ao converter defeitos no sinalização neuronal em respostas eletrotáticas mensuráveis, este método apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em etapas de descoberta. O formato microfluídico fornece leituras fenotípicas escaláveis e reprodutíveis que melhoram a confiança preditiva em campanhas de identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao relacionar a função de neurônios dopaminérgicos com fenótipos locomotores quantificáveis.
- Valor Operacional: Permite avaliação rápida de manipulações genéticas e químicas que afetam a sinalização neuronal, com estimulação de eletrotaxia sob demanda.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar compostos que revertam defeitos de movimento em modelos de DP antes de estudos mamíferos onerosos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas padronizadas, como velocidade de natação e frequência de curvatura do corpo, para prontidão do ensaio.
- Valor Operacional: Facilita o potencial de automação com controle microfluídico da posição dos vermes e inversão da polaridade do campo para medições de tempo de reversão.
- Escalabilidade: Permite a triagem de mais de 20 vermes por hora, possibilitando triagens primárias eficientes de fatores neuroprotetores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Utiliza a locomoção como um indicador funcional relevante para a doença que se correlaciona com a neurodegeneração dopaminérgica em modelos de PD de C. elegans.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Distingue efeitos neurotóxicos de toxicidade geral ao isolar defeitos no sinal neuronal por meio de alterações na resposta eletrotática.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia o desenvolvimento translacional de biomarcadores ao quantificar a variabilidade eletrotática dependente da idade em adultos jovens versus larvas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de eletrotaxia em microfluídica integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta como uma plataforma de triagem fenotípica entre a confirmação do alvo atingido e a otimização do composto líder, fornecendo insights mecanicistas sobre a viabilidade neuronal.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre genes e compostos neuroprotetores mediante a quantificação da recuperação locomotora em modelos de doenças.
- Triagem: Fornece métricas quantitativas e reprodutíveis de locomoção que permitem a avaliação do fator Z' e a análise da robustez do ensaio.
- Análises: Oferece dados temporais de posição e velocidade para análise cinética da dinâmica de resposta eletrotática.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar variações na resposta dependentes da idade, relevantes para neurodegeneração de início tardio.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem interprojetos de moduladores neuronais em diferentes origens genéticas e linhagens, como C. briggsae.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na triagem neuronal ao isolar a locomoção como um leitura específica da função neuromuscular.
- Valor Operacional: Padroniza o manuseio dos vermes e a aplicação do estímulo, minimizando a variabilidade dos ensaios manuais e permitindo a reprodutibilidade entre diferentes locais.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao acelerar decisões de prosseguimento ou interrupção por meio do perfil fenotípico precoce de candidatos neuroprotetores.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de acertos com base na recuperação eletrotática dose-dependente em modelos transgênicos que expressam proteínas humanas associadas a doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na fabricação de dispositivos microfluídicos, incluindo técnicas de fotolitografia e ligação de PDMS.
- Depende do acesso a sistemas de câmera acoplados a microscópio e fontes de alimentação programáveis para controle preciso do campo elétrico.
- Necessita padronização dos protocolos de preparação de vermes, incluindo sincronização etária e condicionamento com tampão M9.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o ensaio a outras espécies de nematoides ou a geometrias de canal variadas.
- Limita-se à detecção de fenótipos que afetam a locomoção ou a eletrossensibilidade, conforme confirmado pelo material de origem, que observa que apenas essas mutações ou substâncias químicas geram respostas detectáveis.
