Clonagem Funcional Utilizando um

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um sistema de oócito de Xenopus, um capuz animal, adequado para a identificação de produtos gênicos capazes de induzir uma resposta em ectoderma competente. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia do desenvolvimento, como quais genes são necessários para provocar uma resposta indutiva. A principal vantagem desta técnica é o uso do oócito de Xenopus como sistema de expressão, para produzir e identificar indutores que atuam sobre um tecido-alvo, ou até mesmo genes que atuam a montante de indutores.

A demonstração visual deste método é extremamente útil, pois as etapas de dissecação e recombinação são altamente dependentes do estágio e exigem uma técnica refinada. Após coletar o tecido ovariano de rãs fêmeas anestesiadas, rasgue o tecido em pequenos pedaços, cada um contendo aproximadamente 10 a 20 ovócitos. Em seguida, transfira esses fragmentos primeiro para solução OR2 fresca e depois para OR2 contendo 2,0 miligramas por mililitro de colagenase A. Prossiga agitando suavemente a mistura contendo o tecido em um agitador durante uma hora.

Em seguida, transfira os fragmentos para uma solução fresca de colagenase e agite por mais uma hora. Espere observar ovócitos desagregados ao final deste tratamento. Prossiga com a lavagem dos ovócitos 10 vezes em OR2 completo e, em seguida, duas vezes em meio de cultura de ovócitos, abreviado como OCM.

Em seguida, coloque os ovócitos em OCM fresco e inspecione-os visualmente sob um microscópio estereoscópico. Isole os estágio seis descartando os ovócitos menores e imaturos. Em seguida, coloque os ovócitos em uma placa de Petri revestida com agarose contendo OCM e mantenha-os a 18 a 20 graus Celsius até a injeção.

Para se preparar para a microinjeção, coloque tubos capilares de vidro em um puxador de agulhas, puxe-os e, em seguida, quebre as pontas do vidro para gerar agulhas com diâmetro aproximado de 20 micrômetros. Em um microscópio composto, meça as pontas das agulhas com um micrômetro ocular calibrado. Em seguida, pressione argila formando uma camada uniforme no fundo de uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros.

E então crie ranhuras paralelas nesta camada, usando uma ferramenta semelhante a uma sonda fina. Encha o recipiente revestido com argila com aproximadamente 2 mililitros de Ficoll 3% em salina de Barth modificada 1x, ou MBS. Em seguida, transfira os ovócitos para ele, usando uma pipeta de grande orifício.

Posicione os ovócitos nas ranhuras para que fiquem fixos durante a microinjeção subsequente. Usando um microinjetor, encha uma agulha com aproximadamente dois microlitros de um pool previamente preparado de mRNA e ajuste o equilíbrio para gerar uma leve pressão positiva, o que impedirá que o citoplasma do ovócito seja aspirado para dentro da agulha durante a injeção. Em seguida, injete 20 nanolitros de RNA em cada ovócito na região equatorial.

Posteriormente, deixe os ovócitos no MBS com Ficoll por uma hora e, em seguida, transfira-os suavemente para o MBS 1x. Prossiga com a incubação dos ovócitos por oito a 24 horas a 20 graus Celsius. Para iniciar o ensaio de calota animal, reúna a solução de meio anfíbio normal 3/4x, abreviada como solução NAM, pinça fina, laço de cabelo, ovócitos previamente injetados e embriões de Xenopus nas fases 11 a 11,5.

Em seguida, quebre lâminas de vidro em fragmentos com aproximadamente um milímetro por dois milímetros de tamanho e passe essas peças por uma chama até que suas bordas fiquem polidas e arredondadas. Depois, pressione argila em uma única camada em um recipiente, conforme descrito anteriormente, e use uma sonda fina para criar impressões individuais com formato de copo nesta camada.

Prossiga preenchendo o recipiente com aproximadamente dois mililitros de NAM 3/4x. Em seguida, transfira os ovócitos injetados, posicionando vários de modo que cada um fique imobilizado em uma única reentrância. Para preparar os embriões, transfira-os para um recipiente contendo solução de NAM 3/4x.

Selecione um subconjunto de gástrulas para ser usado como controles de estadiamento para a idade do ectoderma e transfira-os para outro recipiente contendo a mesma solução. Em seguida, coloque este recipiente de lado. Para os embriões que serão utilizados no ensaio de capuz animal, remova suas membranas vitelinas com dois pares de pinças finas.

Em seguida, transfira a gástrula para o recipiente revestido com argila contendo os ovócitos. Para começar, corte os capuzes animais dos embriões usando dois pares de pinças finas, tomando cuidado para evitar o tecido equatorial. Para gerar recombinantes usando o primeiro método, posicione um capuz animal de modo que sua superfície interna entre em contato com o hemisfério animal de um ovócito, previamente posicionado em uma reentrância.

E repita este processo com vários dos ovócitos injetados. Para garantir que esses recombinantes permaneçam unidos, coloque um fragmento curvado de lamínula de vidro sobre cada um deles e aplique pressão para baixo até que o animal fique achatado e a lamínula entre em contato com a argila. Para gerar recombinantes utilizando o segundo método, posicione as tampas animais e os ovócitos juntos em reentrâncias individuais vazias na argila.

E certifique-se de que as superfícies internas dos capsulares animais estejam voltadas para o oócito. Em seguida, fixe os dois tecidos juntos usando pequenas extensões de argila. Uma vez que múltiplos recombinantes tenham sido gerados por qualquer dos métodos, cultive-os juntamente com os embriões controle reservados a 20 graus Celsius.

Quando os embriões-controle atingirem o estágio desejado, remova as lamínulas dos embriões recombinantes e isole o ectoderma do capuz animal usando pinças e um laço de cabelo. Em seguida, fixe os fragmentos ectodérmicos e os embriões-controle em MEMFA durante uma hora. E transfira-os para etanol e armazene esse tecido a menos 20 graus Celsius.

Aqui, conjuntos de ovócitos foram injetados com pools de mRNA correspondentes a números progressivamente menores de clones ou colônias e, em seguida, cultivados com capuzes animais. Posteriormente, foi determinado o número de capuzes animais em cada conjunto que expressavam foxe3, um marcador normalmente observado no ectoderma da lente presumida desde os estágios da placa neural inicial até a formação da vesícula, e usado aqui para avaliar a capacidade indutora da lente. Este método identificou o gene que codifica o fator nuclear ldb1, o qual pode produzir uma resposta indutora da lente em 50 de 179, ou 28%, dos capuzes animais avaliados.

Mostradas aqui, nossas imagens de hibridização in situ, representando o sinal de foxe3, indicado pelas cabeças de seta, em capuzes animais cultivados com ovócitos injetados com ldb1 do estágio aproximadamente 11 ao estágio 23. Nenhuma expressão de foxe3 é observada em capuzes animais controles correspondentes colocados sobre ovócitos não injetados. Quando seções foram geradas a partir desses capuzes animais, a expressão de foxe3 foi observada tanto nas camadas ectodérmicas interna quanto externa.

A expressão na camada interna é característica de uma resposta do cristalino. Ou, quando sinalizada em ambas as camadas, é indicativa de outras estruturas, como a placa olfativa. Após este procedimento, métodos como imunohistoquímica, hibridização in situ ou detecção direta de um gene repórter fluorescente podem ser realizados para avaliar uma resposta indutiva no ectoderma do capuz animal.