Clonagem Funcional Utilizando um Xenopus Oocyte Sistema de Expressão

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um oócito de Xenopus, um sistema de capa animal, adequado para a identificação de produtos gênicos capazes de induzir uma resposta em ectoderma competente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, como quais genes são necessários para desencadear uma resposta indutiva. A principal vantagem desta técnica é o uso do oócito Xenopus, como sistema de expressão, para produzir e identificar indutores que atuam sobre um tecido-alvo, ou mesmo genes que atuam a montante dos indutores.

A demonstração visual desse método é extremamente útil, pois as etapas de dissecção e recombinação são altamente dependentes do estágio e requerem uma técnica refinada. Depois de coletar tecido ovariano de sapos fêmeas anestesiados, rasgue o tecido em pequenos pedaços, cada um contendo aproximadamente 10 a 20 oócitos. E transfira esses fragmentos, primeiro para uma solução fresca de OR2 e depois para 2,0 miligramas por mililitro de colagenase contendo OR2 A. Continue agitando suavemente a mistura contendo tecido em um agitador por uma hora.

Em seguida, transfira os fragmentos para uma solução fresca de colagenase e agite por mais uma hora. Espere observar oócitos defloculados no final deste tratamento. Proceda à lavagem dos oócitos 10 vezes em OR2 completo e depois duas vezes em meio de cultura de oócitos, abreviado como OCM.

Em seguida, coloque os oócitos em OCM fresco e inspecione-os visualmente sob um microscópio de dissecação. Isole aqueles no estágio seis, descartando os oócitos menores e imaturos. Em seguida, coloque os oócitos em uma placa de Petri revestida de agarose contendo OCM e mantenha-os a 18 a 20 graus Celsius até a injeção.

Para se preparar para a microinjeção, coloque o tubo capilar de vidro em um extrator de agulhas, puxe-o e, em seguida, quebre as pontas do vidro para gerar agulhas de aproximadamente 20 micrômetros de diâmetro. Em um microscópio composto, meça as pontas das agulhas com um micrômetro ocular calibrado. Em seguida, empurre a argila em uma camada uniforme no fundo de uma placa de Petri de 35 por 10 milímetros.

Em seguida, crie ranhuras paralelas nessa camada, usando uma ferramenta semelhante a uma sonda de shopping. Encha o prato forrado de argila com aproximadamente 2 mililitros de 3% de Ficoll em 1x solução salina de Barth modificada, ou MBS. Em seguida, transfira os oócitos para ele, usando uma pipeta de cano largo.

Posicione os oócitos nos pomares para que sejam mantidos no lugar durante a microinjeção subsequente. Usando um microinjetor, encha uma agulha com aproximadamente dois microlitros de um pool de mRNA gerado anteriormente e ajuste o equilíbrio para produzir uma leve pressão positiva, o que impedirá que o citoplasma do oócito seja puxado para dentro da agulha durante a injeção. Em seguida, injete em cada oócito 20 nanolitros de RNA na região equatorial.

Em seguida, deixe os oócitos no Ficoll MBS por uma hora e, em seguida, transfira-os suavemente para 1x MBS. Prossiga para incubar os oócitos por oito a 24 horas a 20 graus Celsius. Para iniciar o ensaio da tampa animal, reúna 3/4x o meio anfíbio normal, abreviado como solução NAM, pinça fina, um laço de cabelo, oócitos previamente injetados e embriões de xenopus no estágio 11 a 11,5.

Em seguida, separe as lâminas de cobertura de vidro em fragmentos de aproximadamente um milímetro por dois milímetros de tamanho e passe essas peças por uma chama até que suas bordas polim e desenham. Em seguida, pressione a argila em uma única camada em um prato, conforme descrito anteriormente. E use uma sonda de shopping para criar impressões individuais em forma de copo neste revestimento.

Prossiga para encher o prato com aproximadamente dois mililitros de 3/4x NAM. E para ele, transfira os oócitos injetados, posicionando vários de forma que cada um fique imobilizado em um único recuo. Para preparar os embriões, transfira-os para um prato contendo 3/4x solução NAM.

Seleccionar um subconjunto de gástrula para ser utilizado como controlo de estadiamento para a idade do ectoderma e transferi-los para outra placa contendo a mesma solução. E deixe este prato de lado. Para embriões que serão usados na montagem do chapéu animal, remova suas membranas vitelinas com dois pares de pinças finas.

Em seguida, transfira a gástrula para o prato forrado de argila com os oócitos. Para começar, corte as tampas dos animais dos embriões usando dois pares de antecedentes finos, tomando cuidado para evitar o tecido equatorial. Para gerar recombinantes usando o primeiro método, posicione uma tampa de animal de forma que a superfície interna entre em contato com o hemisfério animal de um oócito, já posicionado em um recuo.

E repita esse processo para vários dos oócitos injetados. Para garantir que esses recombinantes sejam mantidos juntos, coloque um fragmento de lamínula de vidro curvo em cima de cada um deles e aplique pressão para baixo até que o animal seja achatado e a lamínula entre em contato com a argila. Para gerar recombinantes usando o segundo método, coloque tampas de animais e oócitos juntos em reentrâncias individuais vazias na argila.

E certifique-se de que as superfícies internas das tampas dos animais estejam voltadas para o oócito. Em seguida, prenda os dois tecidos juntos usando pequenas extensões de argila. Uma vez que vários recombinantes tenham sido gerados usando qualquer um dos métodos, a cultura e a retirada de terras controlam os embriões a 20 graus Celsius.

Quando os embriões de controle atingirem o estágio desejado, remova as lamínulas dos recombinantes e isole o ectoderma da capa do animal usando uma pinça e uma alça de cabelo. Prossiga para fixar os fragmentos ectodérmicos e controlar os embriões no MEMFA por uma hora. E transfira-os para etanol e armazene esse tecido a 20 graus Celsius negativos.

Aqui, conjuntos de oócitos foram injetados com pools de mRNA correspondentes a números progressivamente menores de clones ou colônias e, em seguida, cultivados com tampas de animais. Posteriormente, foi determinado o número de tampas de animais em cada conjunto que expressam foxe3, um marcador normalmente observado no ectoderma presuntivo do cristalino desde os estágios iniciais da placa neural até a formação de vesículas, e usado aqui, para avaliar a capacidade de indução do cristalino. Este método identificado no gene codificador do fator nuclear, ldb1, que pode produzir uma resposta indutora de lente em 50 de 179, ou 28% das tampas de animais avaliadas.

Mostradas aqui, nossas imagens de hibridização in situ, representando o sinal foxe3, indicado por pontas de seta, em tampas de animais cultivadas com oócitos injetados com ldb1 aproximadamente do estágio 11 ao estágio 23. Nenhuma expressão de foxe3 é observada em tampas de animais de controle correspondentes colocadas em oócitos não injetados. Quando as seções foram geradas a partir dessas tampas de animais, a expressão de raposa3 foi observada nas camadas ectodérmicas interna e externa.

A expressão na camada interna é característica de uma resposta da lente. Ou, como sinalizado em ambas as camadas, é indicativo de outras estruturas, como o placódio olfatório. Após este procedimento, métodos como imuno-histoquímica, hibridização in situ ou detecção direta de um gene repórter fluorescente podem ser realizados para avaliar uma resposta indutiva no ectoderma do capuz animal.