Name: Clonagem Funcional Utilizando um Xenopus Oocyte Sistema de Expressão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda clonagem funcional usando o sistema de oócitos de Xenopus para identificar genes indutores em ectoderma competente. Este método auxilia pesquisadores em biologia do desenvolvimento a analisar funções gênicas in vivo.

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Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Desenvolvimento Profissional para C.Z.P. da Shepherd University Foundation. Os autores desejam agradecer a Brett Zirkle e Malia Deshotel pelas discussões úteis sobre os protocolos, e à Dra. Carol Hurney pela generosa assistência.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Universidade de Virginia Institutional Animal Care e do Comitê Use. Nota: A Figura 1 mostra uma vista geral esquemática dos procedimentos experimentais. 1. Preparação de oócitos <ol><li> X. Pré-prime laevis fêmeas com 150 U de Pregnant Mare Serum gonadotrofina (PMSG) cerca de uma semana antes do isolamento do oócito. Injectar 1 ml de 150 U / ml PMSG em dorsal saco linfático com 1 cc seringa estéril com 29 g de agulhas. </li><li> Preparar soluções para injecção de oócitos e oócito animal ensaio cap. <ol><li> Prepare de Ca ++ / Mg ++ livre de OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, KCl 2,5 mM, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, 50 mM de HEPES pH 7,2. </li><li> Prepare OR2: OR2- adicionalmente 1 mM de CaCl2 e 1 mM de MgCl2. </li><li> Prepare OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / mL de BSA, 100? G / ml de gentamicina, pH 7,8. </li><li> Prépare MBS 1x: NaCl 88 mM, KCl 1 mM, 0,7 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 5 mM de HEPES (pH 7,8), 2,5 mM de NaHCO3. </li><li> Prepare a 3% de Ficoll em 1x MBS. </li><li> Prepare NAM 1x: NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM de Ca (NO3) 2, 1 mM de MgSO4, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7,4. </li></ol></li><li> Anestesiar a fêmea em uma solução de 0,03% de éster etílico do sal metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo (MS222) em MBS 0,1x (dissolver primeiro 0,3 g MS222 em 10 ml de etanol a 95%, depois dilui-se em 1 L de MBS 0,1x) por colocação em solução de rã 10 - 15 minutos ou até que não responde. <ol><li> Verifique que a anestesia é completa, rodando sapo anestesiado sobre suas costas para garantir que ele não responde (incompletamente rãs anestesiados mover os membros ou virar corpo ao longo). </li></ol></li><li> Cirurgicamente isolar fragmentos de ovário, fazendo uma incisão abdominal através da pele e da parede do corpo com lâmina de bisturi, isolando tecido ovariano com uma pinçae tesouras. Coloque fragmentos ovarianos em OR2-. Fechar a parede do corpo com uma sutura de seda 3-0 em uma agulha curva 24 mm e feche a pele separadamente com os mesmos fios. Permitir a recuperação da fêmea no 1 g / L de sal na água do aquário. </li><li> Usando uma pinça fina, tecido ovariano rasgo em pequenas (10 - 20 oócitos) peças e transferência para OR2- fresco. </li><li> Fragmentos ovarianos Defolliculate em 2,0 mg / ml de colagenase A em OR2- agitando suavemente num agitador durante 1 hora, a transferência de colagenase fresco e agitação durante uma hora adicional. </li><li> Wash ovócitos 10 vezes em OR2 [contendo Ca ++ / Mg ++], descartando oócitos menores. </li><li> Lave oócitos em OCM duas vezes e transferir a nova OCM. Isolar oócitos Fase VI por tamanho após a inspeção visual e descartar oócitos imaturos (menores): ovócitos Fase VI são maiores do que os oócitos imaturos, mesmo com pigmentação no hemisfério animais e são cerca de 1,2-1,4 mm de diâmetro. </li><li> Manter oócitos a 18 - 20 ° C iN OCM antes da injecção. Nota: As placas de Petri revestidas com agarose pode ser utilizado para minimizar a aderência de oócitos de prato. </li></ol> 2. Injecção da Biblioteca Transcrições <ol><li> Prepara-se uma biblioteca de cDNA direccional 15 utilizando ARN extraído numa fase adequada do desenvolvimento (por exemplo, placa neural fase 14 10). Comprar uma biblioteca de cDNA ou construir um usando um kit comercial acordo com a visão geral nos quatro passos abaixo. <ol><li> Isolar cerca de 5 ug de ARNm usando um produto para enriquecer para poli (A) + ARN (Ver tabela de materiais) e seguindo as instruções do fabricante. Nota: Os transcritos para ser usado para produzir a biblioteca de ADNc pode ser restrita a um tecido indução (tais como a placa neural, seguindo microdissecação do tecido desejado), ou pode ser a partir de embriões inteiros numa fase particular. </li><li> Produção de ADNc com um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Ligadura, aproximadamente, 20 ng de cDNA para um vector incluído com o kit comercial ou outro vector adequado. Um vector plasmídeo apropriado inclui sequências de estabilidade do ARNm, tal como 5 &#39;β-globina e 3 poli (A) (sequências pCS2 +, PTNT, pCS105). </li><li> Transforme ligação em células bacterianas competentes que utilizam o protocolo recomendado pelo fornecedor para a transformação de choque térmico. Nota: Alternativamente, um conjunto de grelha de leitura aberta (ORFeome clones) está comercialmente disponível e pode ser usado para gerar transcrições para injecção. </li></ol></li><li> Preparar 10 piscinas de plasmídeos de 10 para 3 10 4 complexidade (10 4 10 5 para a complexidade total). Isto representa 10 placas com 1.000 - 10.000 colónias cada. <ol><li> Biblioteca placa de cultura em 10 placas de 15 cm LB-ampicilina, crescer 12-18 horas a 37 C, e recolher colónias de cada por uma leve pressão com um espalhador de vidro em 7 ml LB. </li><li> Prepare um estoque de glicerol de 0,5 ml (adicionar aos 0,2 ml de glicerol e armazenar estéril a -20 &amp;# 730; C), e utilizar os restantes 6,5 ml para preparar DNA com um padrão disponível comercialmente kit DNA miniprep seguindo as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Linearizar DNA plasmídeo em pool (1,0-2,0 mg) com restrição apropriada enzima digerir 16 a 37 ° C durante 1-1,5 h. Isolar o ADN linearizado com extracção com fenol / clorofórmio seguido de precipitação com etanol e ressuspensão em água de acordo com as especificações do kit de ARN-polimerase utilizada. Sintetizar RNA sentido com ARN-polimerase de um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Prepare agulhas para microinjeção (usando um extrator de agulha com tubos capilares de vidro) de aproximadamente 20 mm de diâmetro; medir pontas de agulha em um microscópio composto com um micrômetro ocular calibrada. Nota: As configurações do extrator de agulhas deve ser determinada empiricamente para produzir uma agulha com uma ponta fina de tal forma que quando quebrado com uma pinça fina produz o tamanho da ponta desejado. </li><li> Prepare (empurrar barro emcamada uniforme na parte inferior do prato) 35 x 10 mm placas de Petri com sulcos paralelos para manter oócitos no lugar durante a microinjeção forrada com argila; produzir sulcos com uma sonda de shopping ou pipeta Pasteur fundido na ponta em chamas. Como uma alternativa para argila, preparar pratos agarose fazendo recortes com um molde de elastômero 17. Oócitos meio de uma pipeta de todo o furo para 3% Ficoll em 1x MBS (aproximadamente 2 ml) em filas nos pratos forrado de barro. </li><li> Usando microinjector, preencher agulha com 1 ng / nl RNA e ajustar o equilíbrio para produzir uma ligeira pressão positiva (para evitar a elaboração de citoplasma de oócitos). </li><li> Injetar oócitos com aproximadamente 20 nl RNA na região equatorial. Permitir uma hora para oócitos injectados para permanecer em Ficoll-MBS, em seguida, transferir cuidadosamente para 1x MBS. Incubar durante 8 - 24 horas a 20 ° C antes do ensaio tampão animal. </li></ol> 3. animal Cap Assay <ol><li> Prepare 3 / 4x NAM e obter uma pinça fina, laço de cabelo, fragmentos lamela curvas, dis-alinhado argilahes com recortes em forma de taça para manter oócitos. Faça fragmentos lamela curvas desmembrando-lamelas de vidro em pequenos fragmentos (aproximadamente 1 - 2 mm x 2-4 mm) e passando pela chama até que as bordas polonês e inclinar-se, produzindo uma peça curvada. </li><li> Fertilize X. laevis ovos 18 através in vitro ou do acasalamento natural e cultura para gastrula fases (10-11 horas pós-fertilização no RT) em 0,1x MBS antes da ordenação por etapa; recolher meados de gástrula (fase 11 - 11,5) 10 embriões. </li><li> Embriões de transferência para uma placa de Petri aproximadamente meio cheio com 3 / 4x NAM. Usando dois pares de uma pinça fina, retire a fertilização (vitelline) membrana de gastrulae. </li><li> Transferência de oócitos a 3 / 4x NAM (aproximadamente 2 ml) em placas forradas de argila e imobilizar em impressões individuais na argila, produzindo impressões para acomodar embriões individuais como ranhuras foram descritos acima. </li><li> Embriões de transferência para os pratos forrado de barro e cortar tampas de animais fora gastrulae usando dois pares de fórceps finos. Tome cuidado para isolar animais cap ectoderma somente e não tecido equatorial 18. </li><li> Colocar uma tampa de animal no hemisfério animal de cada oócito com a superfície interior da tampa de animais contactar o oócito. Segurar recombinantes em conjunto aplicando fragmento lamela de vidro curvo e a aplicação de pressão descendente para o vidro, achatando o ectoderme como os contactos lamela da argila (tampões animais podem permanecer aberta com a camada interior exposta à superfície do oócito para 6 - 8 h ou mais ). Nota: Como alternativa, coloque a tampa de animais em um recuo de barro com sua superfície interna voltada para cima e coloque um oócito na tampa; fixar o recombinante com pequenas extensões de argila. </li><li> Cultura a 20 ° C até a embriões de controlo atingiram a fase desejada para o ensaio. </li><li> Recombinante separada, removendo lamela / argila e isolando ectoderma com uma pinça e um laço de cabelo. </li><li> Corrigir fragmentos ectodérmicas durante 1 hora em MEMFA (3,8%formaldeído em MEM [MOPS 0,1 M pH 7,4, EGTA 2 mM, e 1 mM de MgSO 4]). </li><li> Fragmentos de transferência de embriões (e controle) de MEMFA em etanol e armazenar a -20 C. </li></ol> 4. Análise de Resposta na ectoderme por hibridação in situ (ISH) <ol><li> Preparar soluções para ISH. <ol><li> Prepare 1x PBS: 0,01 M de solução salina tamponada de fosfato, NaCl 0,138 M, pH 7,4 </li><li> Prepare PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20 </li><li> Preparar a solução de Denhart 100x: 2% de BSA, 2% de polivinilpirrolidona, 2% de Ficoll </li><li> Preparar tampão de hibridização: 50% formamida, 5x SSC, 1 mg / ml de ARN de levedura torula, 1 ug / ml de heparina, solução de Denhart 1x, 0,1% de CHAPS a 0,1%, EDTA 10 mM, Tween-20,, DEPC-H2O </li><li> Preparar tampão de ácido maleico (MAB): 100 mM de ácido maleico, NaCl 150 mM, pH 7,5 </li><li> Prepare MAB + bloco: MAB, 2% reagente de bloqueio (calor a 60 ° C para dissolver) </li><li> Prepare a fosfatase alcalina (FA) Tampão: 100 mM de TrispH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween, dH2O </li></ol></li><li> Prepara-se o ARN da sonda. <ol><li> Utilizando um kit de ARN polimerase comercial e cavar-NTP mistura, adicionar a um tubo de 1,5 ml (50 reacção ul): 25,5 mL de DEPC-H2O, 10 uL de 5X de Transcrição Tampão, 2,5 ul 10x DIG-mistura de NTP, 5 ul de 100 mM DTT, 2 ul de RNAsin, 2 ul de molde de ADN linearizado (~ 1 ug / ul), 3 ul de ARN-polimerase de 37 ° C e incubar durante 90 min. </li><li> Adicionar 2 l de ARN polimerase e incubar 37 ° C durante 60 min. </li><li> Verifique 2 ul de reacção sobre 1% de gel de agarose. </li><li> Adicionar 1 mL RQ1 RNase livre de DNase e incubar 37 ° C durante 20 min. </li><li> Precipitar a sonda por adição de 50 ul de DEPC-H2O, 25 mL de 10 M de acetato de amónio e 313 mL de etanol. Armazenar a -20 C durante a noite (O / N), em seguida, recuperar o ARN por centrifugação a 13.800 xg durante 20 min. Lavar com 500 ul de etanol 75%, girar rapidamente, removaetanol e permitir pellet secar ao ar. Adicionar 50 ul de DEPC-H2O </li><li> Adicionar tampão de hibridação a uma concentração final de ~ 0,5 ug / uL. </li></ol></li><li> Prepare tecido por hibridação. Salvo disposição em contrário, encher frascos ao topo com cada mudança de solução descritos (cerca de 4 ml). <ol><li> Remover o etanol e a partir de frascos de transferência de embriões em 75% de etanol / PTW, em seguida, 50% de etanol / PTW durante 10 min cada, horizontalmente no balancim. </li><li> Lavar três vezes em PTW durante 5 min cada em balancim. </li><li> Transferir para 10 ng / mL tratamento Proteinase K em PTW; tubos de rock verticalmente 15 min. </li><li> Lavar duas vezes em cada 10 min trietanolamina 0,1 M de pH 7,8 - tubos de rocha verticalmente. </li><li> Adicionar 12,5 ul anidrido acético para tubos e rock verticalmente 5 min. Repita com anidrido acético adicional de 12,5 ul por 5 min. </li><li> Lavar em PTW 5 min verticalmente no balancim. </li><li> Refix em paraformaldeído a 4% em 20 min balancim. Calor Tampão de Hibridizaçãoa 60 ° C. </li><li> Lavar três vezes em PTW durante 5 min cada em balancim. </li><li> Remova todos, mas ~ 1 ml de PTW de cada tubo e adicionar 250 ul Hyb tampão; Agite cuidadosamente tubos para misturar. Tubos de rocha vertical 5 min. </li><li> Substitua com 60 ° C Hyb Buffer (0,5 ml) e agitar suavemente a 60 ° C 10 min. Substitua com frescos Hyb tampão e agitar a 60 ° C de duas a quatro horas. </li><li> Sonda de calor (1 ml a 0,5 mg / mL em tampão de Hib) a 60 ° C (3 min). Remover Hyb tampão e adicionar sonda para tubos. Agitar suavemente O / N a 60 ° C. </li></ol></li><li> Prepare Tissue para o Anticorpo. <ol><li> Quente Hyb buffer e 2x SSC + 0,1% Tween-20 soluções a 60 C. </li><li> Substitua solução de sonda com Hyb Buffer (sondas salvar a -20 C durante 2 - 3x reutilização). Lavar a 60 ° C durante 10 min. </li><li> Lavar três vezes a 60 ° C em 2x SSC-Tween (20 min cada, com agitação). </li><li> Lavar três vezes a 60 ° C em 0,2x SSC-Tween (20 min cada, com agitação). </li><li> Lavar duas vezes em MAB (RT) durante 15 min cada horizontalmente no balancim. </li><li> Adicione 1 ml MAB + bloco. Lave 2 horas verticalmente no balancim. </li><li> Transferência para 1 ml MAB + bloco que contém um anti-digoxigenina-AP 1 / 2.000. Rocha verticalmente a 4 CO / N. </li></ol></li><li> Prepare tecido por reagente de cor. <ol><li> Substituir solução de anticorpo com MAB; lavar três vezes em 5 min cada MAB horizontalmente no balancim. </li><li> Lavar três vezes em cada MAB 1 h horizontalmente no balancim. </li><li> Lavar duas vezes em tampão de AP 10 min cada horizontalmente no balancim. </li><li> Transferir para tecido de múltiplas bem bandeja de plástico, remover e adicionar tampão de AP BM reagente roxa (~ 1 mL). Permitir que a reacção prossiga na obscuridade 5 min a O / N. </li><li> Quando a coloração adequada é alcançado, transferir tecido para frascos de PTW. Lavar duas vezes 10 minutos cada em PTW no balancim. </li><li> Corrigir em solução de Bouin a 4 CO / N no balancim. </li><li> Lave a Bouin com três de 70% de etanol / 30% PTW lavagens em temperatura ambiente. Prossiga tcaptura de imagem usando o epi-iluminação e uma câmera montada no microscópio, branqueamento, se necessário 18. </li></ol></li></ol> 5. Sib Seleção e Clonagem <ol><li> Selecionar piscina com a maior atividade (maior resposta no tecido ectodérmica). </li><li> Titular (diluir com LB a densidade adequada) o estoque de glicerol para a piscina com a maior atividade e placa out dez novas placas com aproximadamente um décimo das colônias da etapa anterior (usando a seção 2 em protocolo acima). </li><li> Reduzir o tamanho da piscina até que a atividade é atribuída a única colônia. </li><li> Obter sequência de ADN utilizando iniciadores convencionais no vector. </li></ol>

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<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469(2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método aqui descrito para a clonagem de genes funcional capaz de induzir uma resposta em ectoderme competente pode ser utilizado para identificar uma grande variedade de produtos de genes. Este método expande trabalho passado, combinando ensaios de indução de tecido-com técnicas de clonagem de expressão. Nós utilizamos as vias metabólicas do oócito de Xenopus como uma fonte de produção de factores de induzir, directa ou indirectamente, após a injecção de ARN. Isto, em combinação com a utilização de métodos es...

Abordagens genéticas diretas para identificar genes de interesse por meio de sua função ou perda de função1,2 são parte integrante da compreensão de eventos complexos de padronização em desenvolvimento. Juntamente com poderosas técnicas de genética reversa disponíveis para uma gama cada vez maior de sistemas e pesquisadores3-5, agora é possível identificar genes com um papel funcional fundamental em uma via e, em seguida, elucidar essa função no nível celular e em interação com outros produtos gênicos. Uma abordagem para identificar funcionalmente genes de interesse que produziu muitas descobertas importantes no passado é a clonagem de expressão6,7.
Nosso objetivo recente8 foi identificar os primeiros fatores indutores do cristalino, uma vez que foi demonstrado que as etapas iniciais no processo indutor do cristalino dos vertebrados ocorrem tão cedo quanto os estágios da gástrula. Para esse fim, usamos o ectoderma decapa animal 9 com competência transitória para lentes (estágio 11-11,510) de embriões de Xenopus como tecido responsivo para indução, e o oócito de Xenopus estágio VI como fonte de produção para os fatores indutores.
O protocolo a seguir baseia-se nos protocolos de clonagem de expressão e seleção de irmãos de Smith e Harland6,7, também usados com sucesso por outros11-13. Em nosso sistema de expressão de oócitos (utilizado pela primeira vez para a produção de fatores indutores por Lustig e Kirschner14), pools de transcritos injetados capazes de fazer com que os oócitos produzam fatores que provocam uma resposta indutiva de lente no ectoderma animal são selecionados e identificados. Uma vez que o sistema é útil para expressar moléculas indutoras secretadas diretamente (o mRNA INHBB injetado com oócitos causa indução do mesoderma no ectoderma8 de capa animal competente para mesoderma), originalmente esperávamos que o procedimento de triagem fosse útil principalmente para a identificação de fatores parácrinos. No entanto, como identificamos um fator nuclear em nossa tela (ldb18), fica claro que o sistema pode ser usado para identificar uma ampla variedade de moléculas, como fatores regulatórios transcricionais ou translacionais, miRNAs, cofatores ou fatores justacrinos.

<table><tbody><tr><td>12/101</td><td>Estudos de Desenvolvimento de Anticorpos Banco de Hibridoma</td><td>12/101</td><td>Anticorpo monoclonal para detecção de tecido muscular</td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>para</td></tr><tr><td>ISH Anidrido acético</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>para</td></tr><tr><td>ISH Aurum Plasmid Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>Purificação de DNA de plasmídeo</td></tr><tr><td>Reagente de bloqueio</td><td></td><td>Roche 11096176001</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>BM Roxo</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td>para forno</td></tr> de <tr><td>hibridização ISH Boekel</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td><td>para solução de ISH</td></tr><tr><td>Bouin</td><td>Sigma</td><td>HT10132</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>para OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Colagenase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Defoliculação de oócitos</td></tr><tr><td>Cisteína</td><td>Sigma</td><td>C121800</td><td>Dejelly embriões</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Dig-RNA Labeling Mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td>para sondas ISH</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5 World</td><td>Precision Instruments</td><td>500233</td><td>para envelope Vitelline remoção</td></tr><tr><td>Etilo 3-aminobenzoato</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>MS222 anestésico</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>para meios</td></tr><tr><td>de injeção Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1914</td> para <td></td></tr><tr><td>capilares de vidro</td> OCM <td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>3,5" de comprimento, I,D, 0,530 mm</td></tr><tr><td>Frascos de amostra de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-408B</td><td>para</td></tr><tr><td>ISH Hair loop</td><td></td><td></td><td>Cabelo afixado em pipeta pasteur para manipulação de tecidos</td></tr><tr><td>Sal de heparina sódica</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>para injetor ISH</td></tr><tr><td>Nanolitro 2010</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanolitro 2010</td><td>Microinjetor controlado por microprocessador</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Carolina</td><td>972433</td><td>Aquário Sal para recuperação de rãs</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus verificado câmera completa cDNA</td><td>Source Bioscience</td><td>989_IRBG</td><td>biblioteca de cDNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de ágar LB com 100 &micro; g/ml de Ampicilina</td><td>Teknova</td><td>L5004</td><td>Placas LB-Amp pré-derramadas de 150 mm para seleção de irmãos</td></tr><tr><td>LB Luria Broth</td><td>Teknova</td><td>L8650</td><td>LB para coleta de colônias em seleção de irmãos de placas e diluição de culturas</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de mRNA magnético</td><td>New England BioLabs</td><td>S1550S</td><td>para isolamento de RNA enriquecido com poli(A)</td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Micromanipulador manual Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3310R</td><td>Micromanipulador manual</td></tr><tr><td>Misturador de nutação</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-152</td><td>Rocker para ISH</td></tr><tr><td>Permoplast</td><td>Nasco</td><td>SB33495M</td><td>Clay para pratos de injeção e dissecação</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>estimular o desenvolvimento do oócito</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>Sigma</td><td>PVP40</td><td>para</td></tr><tr><td>Extrator Programável</td><td>ISH Instrumentos de Precisão Mundial</td><td>PUL-1000</td><td>Extrator de agulha de micropipeta</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>pTnT Vector</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>construção da biblioteca de cDNA</td></tr><tr><td>Sistema de combinação Riboprobe</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>in vitro transcrição</td></tr><tr><td>Sobrescrito Comprimento Total cDNA Library Construction Kit</td><td>Life Technologies</td><td>18248013</td><td>para construção de biblioteca cDNA</td></tr><tr><td>Suturas, seda 3-0</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>Linha de sutura e agulha para remoção pós-oócito</td></tr><tr><td>Torula RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA Synthesis System</td><td>Promega</td><td>C4360</td><td>kit alternativo para construção de biblioteca de cDNA</td></tr><tr><td>Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration</td><td>Source Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome Clones</td></tr><tr><td>XL2-Blue Células ultracompetentes</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>células para transformação de cDNA biblioteca</td></tr></tbody></table>

clonagem funcional utilizando um<em&gt; xenopus</em&gt; oocyte sistema de expressão

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

A identificação de genes responsáveis pela indução embrionária apresenta uma série de desafios; para citar alguns, as moléculas secretadas de interesse podem ser de baixa abundância, podem não ser secretadas, mas amarradas à(s) célula(s) de sinalização, ou podem exigir a presença de parceiros de ligação ou moléculas reguladoras a montante. Assim, em uma busca por produtos gênicos capazes de provocar uma resposta indutiva precoce do cristalino em ectoderma competente, utilizamos um sistema de clonagem de expressão que permitiria a identificação de fatores parácrinos ou justacrinos, bem como proteínas transcricionais ou outras proteínas reguladoras. Pools de mRNA foram injetados em oócitos de Xenopus e tecido responsivo colocado diretamente nos oócitos e co-cultivado. Após a clonagem funcional de ldb1 de uma biblioteca de cDNA em estágio de placa neural com base em sua capacidade de provocar a expressão do marcador de placode de lente precoce foxe3 em ectoderma de capa animal competente para lentes, caracterizamos o padrão de expressão de mRNA e analisamos a progressão do desenvolvimento após superexpressão ou knockdown de ldb1. Este sistema é adequado em uma ampla variedade de contextos onde a identificação de um indutor ou de suas moléculas reguladoras a montante é buscada usando uma resposta funcional em tecido competente.

Em resposta à expressão do ARNm injectado em oócitos, respondendo tecido tampão animal foi ensaiado quanto à expressão de OTX2 por hibridação in situ (Figura 2 e Tabela 1); OTX2 é expressa em ectoderme lente presuntivo (PLE) de fecho do tubo neural através placï¿½io lente espessamento 19. No entanto, uma vez que OTX2 é também expressa em ectoderme neural anterior, bem como ectoderme cabeça não neurais fora da PLE, que está a...

Descrevemos um sistema de capas de oócitos e animais de Xenopus para a clonagem de expressão de genes capazes de induzir uma resposta em ectoderma competente, e discutimos técnicas para a análise subsequente de tais genes. Este sistema é útil na identificação funcional de uma ampla gama de produtos gênicos.

Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um sistema de oócito de Xenopus, um capuz animal, adequado para a identificação de produtos gênicos capazes de induzir uma resposta em ectoderma competente. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia do desenvolvimento, como quais genes são necessários para provocar uma resposta indutiva. A principal vantagem desta técnica é o uso do oócito de Xenopus como sistema de expressão, para produzir e identificar indutores que atuam sobre um tecido-alvo, ou até mesmo genes que atuam a montante de indutores.A demonstração visual deste método é extremamente útil, pois as etapas de dissecação e recombinação são altamente dependentes do estágio e exigem uma técnica refinada. Após coletar o tecido ovariano de rãs fêmeas anestesiadas, rasgue o tecido em pequenos pedaços, cada um contendo aproximadamente 10 a 20 ovócitos. Em seguida, transfira esses fragmentos primeiro para solução OR2 fresca e depois para OR2 contendo 2,0 miligramas por mililitro de colagenase A. Prossiga agitando suavemente a mistura contendo o tecido em um agitador durante uma hora.Em seguida, transfira os fragmentos para uma solução fresca de

functional-cloning-using-a-xenopus-oocyte-expression-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

Xenopus embrionárias epitélios são um sistema modelo ideal para estudar os comportamentos das células, como o desenvolvimento de polaridade e mudar de forma durante a morfogênese epitelial. Histologia tradicional de amostras fixa é cada vez mais sendo complementado por live-célula de imagem confocal. Aqui nós demonstrar os métodos para isolar os tecidos de rã e visualizar ao vivo as células epiteliais e seus citoesqueleto usando live-célula microscopia confocal.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Este protocolo de vídeo demonstra um método para a geração de...

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Descrevemos métodos de manipulação de oócitos imaturos de Xenopus laevis, maturação in vitro de oócitos em óvulos e injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite a degradação de algumas proteínas maternas e a superexpressão de genes de interesse na fertilização e, portanto, é valioso para estudar papéis de fatores específicos no desenvolvimento embrionário inicial.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

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Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

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Nós apresentamos um método para a geração de em vitro auto-sustentado mitótica oscilações no nível de célula única encapsulando extratos de ovos de Xenopus laevis em microemulsões de água em óleo.

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